Name: live imaging of mouse secondary palate fusion
Uploaded: 2017-07-27T14:00:00
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Agradecemos a M. Douglas Benson por conversas iniciais sobre imagens de paladar secundário. Também reconhecemos David Castaneda-Castellanos (Leica) e Chris Rieken (Zeiss) por sua ajuda para ajustar as condições de imagem em microscopia confocal. Agradecemos Lynsey Hamilton (Bitplane) por sugestões úteis para análise quantitativa de imagens usando o software Imaris. Este trabalho foi financiado pelo NIH / NIDCR R01 DE025887.

Todas as experiências com animais foram realizadas de acordo com os protocolos da Universidade da Califórnia no Santian Institutional Animal Care and Use Committee. 1. Preparação de mídia de imagem ao vivo <ol><li> Preparação de meios de cultura líquidos <ol><li> Adicionar 20% de soro fetal bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina, 100 U / mL de penicilina, 100 μg / mL de estreptomicina, 200 μg / mL de ácido L-ascórbico, 15 mM de HEPES para Dulbecco&#39;s Modified Eag...

<ol>
	<li>Ray, H. J., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+tissue+fusion+during+development.">Mechanisms of tissue fusion during development.</a> Dev. Camb. Engl. 139, 1701-1711 (2012).</li><li>Dudas, M., Li, W. -. Y., Kim, J., Yang, A., Kaartinen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palatal+fusion+-+where+do+the+midline+cells+go?+A+review+on+cleft+palate,+a+major+human+birth+defect.">Palatal fusion - where do the midline cells go? A review on cleft palate, a major human birth defect.</a> Acta Histochem. 109, 1-14 (2007).</li><li>Bush, J. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+medial+edge+epithelial+cells+during+palatal+fusion+in+vitro:+an+analysis+by+Dil+labelling+and+confocal+microscopy.">The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro: an analysis by Dil labelling and confocal microscopy.</a> Development. 114, 379-388 (1992).</li><li>Muzumdar, M., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li><li>Dassule, H., Lewis, P., Bei, M., Mass, R., McMahon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+regulates+growth+and+morphogenesis+of+the+tooth.">Sonic hedgehog regulates growth and morphogenesis of the tooth.</a> Development. 127, 4775-4785 (2000).</li><li>Eisenhoffer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crowding+induces+live+cell+extrusion+to+maintain+homeostatic+cell+numbers+in+epithelia.">Crowding induces live cell extrusion to maintain homeostatic cell numbers in epithelia.</a> Nature. 484, 501-546 (2012).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact:+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin.">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nat Methods. 5, 605-607 (2008).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact+mice+for+studying+F-actin+dynamics.">Lifeact mice for studying F-actin dynamics.</a> Nat Methods. 7, 168-169 (2010).</li><li>Can, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+correction+in+confocal+laser+microscopes:+a+novel+two-view+approach.">Attenuation correction in confocal laser microscopes: a novel two-view approach.</a> J Microsc. 211, (2003).</li><li>Veenman, C., Reinders, M., Backer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+motion+correspondence+for+densely+moving+points.">Resolving motion correspondence for densely moving points.</a> IEEE Trans Pattern Anal Mach Intell. 23, 54-72 (2001).</li><li>Udan, R., Piazza, V., Hsu, C., Hadjantonakis, A., Dickinson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+cell+dynamics+in+mouse+embryos+using+light-sheet+microscopy.">Quantitative imaging of cell dynamics in mouse embryos using light-sheet microscopy.</a> Development. 141, 4406-4414 (2014).</li><li>Stoller, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+reporter+mouse+expressing+a+nuclear+localized+fusion+of+GFP+and+beta-galactosidase+reveals+new+derivatives+of+Pax3-expressing+precursors.">Cre reporter mouse expressing a nuclear localized fusion of GFP and beta-galactosidase reveals new derivatives of Pax3-expressing precursors.</a> Genesis. 46, 200-204 (2008).</li></ol>

A imagem ao vivo da morfogênese do tecido com cultura de explante de órgãos 3D pode fornecer informações detalhadas sobre processos celulares que não podem ser mostrados na análise de coloração convencional de seções fixas de tecidos. Usando a cultura de explante in vitro do paladar secundário embrionário de rato, observamos vários comportamentos celulares interessantes, levando-nos a propor um novo mecanismo de fusão palatina que envolve convergência epitelial e extrusão celular. <p class=...

A fusão de tecido é um passo importante no desenvolvimento de múltiplos órgãos. Principais defeitos de nascença humana, como fissura labial e palatina, espinha bífida e malformações do coração podem resultar de defeitos na fusão tecidual 1 . A fusão do palato secundário do rato foi amplamente estudada para identificar os mecanismos celulares e moleculares que controlam a fusão tecidual no desenvolvimento 2 , 3 , 4 . No mouse, o desenvolvimento do paladar secundário começa em torno de E11.5 com o crescimento de uma plataforma palatina secundária de cada um dos processos maxilares bilaterais. O crescimento inicial das prateleiras palatais ocorre verticalmente ao longo da língua, até aproximadamente E14.0, altura em que as prateleiras palatais se tornam elevadas horizontalmente acima da língua. O crescimento direcionado medialmente resulta em contato físico entre os epitélios que compõem as duas prateleiras palatinas, formando o epíteto da linha médiaAl seam (MES) em E14.5. O MES interveniente deve ser removido entre as prateleiras palatinas secundárias para permitir a confluência mesenquimatosa e o desenvolvimento de um palato secundário intacto e completamente fundido por E15.5 3 . Como uma camada de célula MES epitelial compartilhada é formada entre duas prateleiras palatais separadas e, em seguida, removida para alcançar a confluência mesenquimal, tem sido uma questão central no desenvolvimento do paladar. Com base em estudos de microscopia histológica e eletrônica de mouse (EM), estudos de cultura de explantes e experiências funcionais de genética de mouse, vários comportamentos celulares fundamentais foram implicados nesse processo. As projeções semelhantes a Filopodia do epitélio da margem mediana MEE de cada prateleira palatina facilitam o contato inicial 5 , 6 , seguido da intercalação dessas células epiteliais a um MES 6 compartilhado , 7 . Remoção do MES compartilhado resultanteFoi proposto prosseguir por três mecanismos não exclusivos. Estudos iniciais que utilizaram observação histológica e rastreamento de linhagem ex vivo com corantes vitais indicaram que o MES poderia ser removido por transição epitelial para mesenquimatosa (EMT) das células MES 8 , 9 , embora mais recentemente, o rastreamento genético das células epiteliais gerasse incerteza quanto à A contribuição a longo prazo das células epiteliais para o mesênquima palatino 10 , 11 , 12 . Um número significativo de células apoptóticas e uma redução em seu número em alguns mutantes que não sofrem fusão palatina adequada levaram à idéia de que a apoptose pode ser um grande motor da dissolução MES 2 , 3 . Finalmente, com base inicialmente em estudos envolvendo rotulagem epitelial e observação estática em pontos de tempo progressivos, células MESForam propostos para migrar nas dimensões oronasal e anteroposterior 11 , 13 , mas esses comportamentos celulares dinâmicos foram inicialmente não confirmados devido à incapacidade de observá-los no tecido palatal vivo. Recentemente, conseguimos observar diretamente esses comportamentos através do desenvolvimento de uma nova metodologia de imagem ao vivo que combina métodos genéticos de rótulos fluorescentes com imagens confocais ao vivo de prateleiras palatinas explantadas. Em primeiro lugar, para visualizar comportamentos dinâmicos celulares em células epiteliais de paladar durante a fusão paladar, geramos um rato repórter específica-epitelial por cruzamento de ratinhos ROSA26-mTmG flox com ratinhos Keratin14-cre 14, 15. Imagens vivas confocais da cultura explante de palato dos embriões resultantes confirmaram alguns comportamentos celulares previamente propostos e eventos de romance identificados no processo de fusão 6 </Sup&gt;. As protrusões da membrana celular epitelial precederam o contato inicial da célula-célula seguido de convergência epitelial por intercalação celular e deslocamento celular oronasal. Notavelmente, também descobrimos que a extrusão celular, um processo relatado para desempenhar papéis importantes na homeostase epitelial, foi um mecanismo importante que conduzia a fusão palatina secundária do mouse 6 , 16 . Este método de imagem pode ser usado com outras linhas repórter; Utilizamos ratos transgênicos Lifeact-mRFPruby 17 , 18 para examinar a dinâmica do citoesqueleto da actina durante o processo de fusão. Outros repórteres também podem ser empregados para observar outros aspectos específicos da fusão palatina e este método pode ser adaptado para microscopia confocal de microscopia confocal ou microscópio de disco giratório, dependendo das necessidades de imagem e da disponibilidade do microscópio. A imagem ao vivo está se tornando cada vez mais uma abordagem fundamental na biologia do desenvolvimento. PartiParticularmente, a morfogênese craniofacial é complexa e os defeitos congênitos humanos que afetam o rosto são comuns. Este método de imagem ao vivo confocal ajudará a melhorar a compreensão dos mecanismos básicos de desenvolvimento subjacentes, bem como a origem de anormalidades craniofaciais humanas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1193">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Reagents</td>
			<td style="width:360px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td style="width:260px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DMEM/F12</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">L-glutamine</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Pennicillin/Streptomycin</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Low melting agarose</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>E-3111-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">35mm glass bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Petrolieum Jelly (Vaseline)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>16415-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Keratin14-cre</td>
			<td></td>
			<td>MGI: J:65294</td>
			<td>Allele = Tg(KRT14-cre)1Amc</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">ROSA26mTmG</td>
			<td></td>
			<td>MGI: J:124702</td>
			<td>Allele = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Lifeact-mRFPruby</td>
			<td></td>
			<td>MGI: J:164274</td>
			<td>Allele = Tg(CAG-mRuby)#Rows</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">White Light SP5 confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Cell Observer spinning disk confocal microscope</td>
			<td>Zeiss Microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of mouse secondary palate fusion

A fusão das prateleiras palatinas secundárias para formar o palato secundário intacto é um processo chave no desenvolvimento de mamíferos e a sua ruptura pode levar ao palato secundário fissurado, uma anomalia congênita comum em humanos. A fusão secundária do palato tem sido amplamente estudada, levando a vários mecanismos celulares propostos que podem mediar esse processo. No entanto, esses estudos foram realizados principalmente em tecidos embrionários fixos em pontos de tempo progressivos durante o desenvolvimento ou em culturas de explantes fixas analisadas em pontos de tempo estáticos. A análise estática é limitada para a análise de processos morfogenéticos dinâmicos, como a fusão palatina e quais tipos de comportamentos celulares dinâmicos medeiam a fusão palatina, é incompletamente entendido. Aqui descrevemos um protocolo para imagens vivas da fusão de palato secundário ex vivo em embriões de camundongo. Para examinar os comportamentos celulares da fusão palatina, a queratin14 -cre específica do epitélio foi utilizada para rotular as células epiteliais do palato em ROSA26-mTmG embriões repórter flox . Para visualizar a actina filamentosa, utilizaram-se ratos repórter Lifeact-mRFPruby . A imagem viva da fusão secundária do palato foi realizada por dissecção de prateleiras palatais secundárias recentemente aderidas de embriões de dia embrionário (E) 14,5 embriões e cultura em meio contendo agarose em um prato de fundo de vidro para permitir a imagem com um microscópio confocal invertido. Usando esse método, detectamos uma variedade de novos comportamentos celulares durante a fusão palatina secundária. A percepção de como os comportamentos celulares distintos são coordenados no espaço e no tempo contribui grandemente para a nossa compreensão desse processo dinamométrico dinâmico. Este protocolo pode ser aplicado a linhas de mouse mutantes, ou culturas tratadas com inibidores farmacológicos para avançar a compreensão de como a fusão palatina secundária é controlada.

A imagem viva da cultura de explantes de palato revelou vários processos celulares que mediam a fusão palatina 6 . Os contatos iniciais entre duas células epiteliais são feitos por protrusões de membrana ( Figura 2 B-2E ). Quando duas camadas epitélias se encontram, elas formam um MES em camadas de células múltiplas seguido de intercalação para fazer uma MES de camada celular única integrada através da con...

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Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Aqui, apresentamos um protocolo para imagens ao vivo da fusão do palato secundário do mouse usando microscopia confocal. Este protocolo pode ser usado em combinação com uma variedade de linhas de mouse repórter fluorescentes e com inibidores de via para visão mecanicista. Este protocolo pode ser adaptado para imagens ao vivo em outros sistemas de desenvolvimento.

Imagem ao vivo do mouse Fusão do palato secundário

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

The overall goal of this confocal live imaging method is to directly observe the cellular processes, the drive's secondary palate fusion during cranial facial development. Begin by separating the head from the body of the embryo under a dissecting microscope in a petri dish containing fresh, room temperature PBS. Grasp the head with one pair of fine number five forceps and use a second pair of forceps to remove the upper brain, cutting away any extra tissue outside of the palatal shelves with a second pair of forceps.Remove the mandible carefully without damaging the palatal shelves. When the mandible has been detached, carefully remove the tongue and confirm the presence of a robust reporter signal in the midline epithelia seam. It's important not to damage it, palatal explained during dissection to keep the midline epithelia seam intact.Next, remove the hind brain, brain stem and both maxilli with the adhered palatal shelves. Cut the anterior upper jaw tissue, keeping both the primary and secondary palates intact. Remove the nasal septum on the nasal side of the explant to expose the midline epithelia seam and confirm that the epithelia layer between the tissue is intact.Now, add live imaging medium to a 35 millimeter glass bottom dish and place the dissected palatal shelves, oral side down in the dish as close to the glass bottom as possible. Then, place dry ice pellets on a conductive surface near the culture dish to expedite the solidification of the agarose within the imaging medium. When the agarose is semi-solid, mount the culture dish in an inverted confocal microscope equipped with a 37 degree celsius incubation chamber and use a syringe to apply petroleum jelly between the culture dish and the culture cover to prevent evaporation of the imaging medium.Select a low magnification objective to locate the region of interest. Then, select a high magnification objective and scan multiple z stacks with five micron steps for 16 to 24 hours, using the appropriate laser excitation. Live imaging of palate explant culture reveals multiple cellular processes that mediate palate fusion, with the initial contacts between the two epithelia cells being made by membrane protrusions.When the two epithelia layers meet, they form a multi cell layered midline epithelia seam, followed by intercalation to generate an integrated single cell layer, midline epithelia seam through epithelia convergence. The epithelia cells in deeper z levels are also progressively displaced to the oral side of the midline epithelia seam, contributing to the epithelia convergence process. Posterior directed cell migration is observed in middle palate midline epithelia seam.With epithelia cell extrusion events observed during palate fusion, suggesting that the epithelia cells in the midline epithelia seam can be removed by this active process. This integrated epithelia seam will ultimately break down to achieve confluency. Further, filamentis actin becomes enriched at the border between the epithelia and mazenkemo areas, forming a cable like structure along the anterior posterior axis.Software can be used to track specific cellular behaviors of interest, during palate fusion with the best method for cell tracking depending on the reporter signal used in the experiment.

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