Name: live imaging of mouse secondary palate fusion
Uploaded: 2017-07-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion at JoVE.com

İkincil damak görüntüleme ile ilgili ilk görüşmelerde M. Douglas Benson&#39;a teşekkür ediyoruz. Aynı zamanda, konformasyon mikroskopisinde görüntüleme koşullarını ayarlamaya yardımlarından dolayı David Castaneda-Castellanos (Leica) ve Chris Rieken&#39;i (Zeiss) kabul ediyoruz. Imaris yazılımını kullanarak niceliksel görüntü analizi için yararlı öneriler için Lynsey Hamilton&#39;u (Bitplane) takdir ediyoruz. Bu çalışma NIH / NIDCR R01 DE025887 tarafından finanse edildi.

Tüm hayvan deneyleri, San Francisco Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi&#39;ndeki Kaliforniya Üniversitesi protokollerine uygun olarak gerçekleştirildi. 1. Canlı Görüntüleme Ortamının Hazırlanması <ol><li> Sıvı kültür ortamının hazırlanması <ol><li> Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) / F12&#39;ye% 20 sığır fetüsü serumu (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 U / mL penisilin, 100 ug / mL streptomisin, 200 ug / mL L-askorbik asit, 15 mM HEPES e...

<ol>
	<li>Ray, H. J., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+tissue+fusion+during+development.">Mechanisms of tissue fusion during development.</a> Dev. Camb. Engl. 139, 1701-1711 (2012).</li><li>Dudas, M., Li, W. -. Y., Kim, J., Yang, A., Kaartinen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palatal+fusion+-+where+do+the+midline+cells+go?+A+review+on+cleft+palate,+a+major+human+birth+defect.">Palatal fusion - where do the midline cells go? A review on cleft palate, a major human birth defect.</a> Acta Histochem. 109, 1-14 (2007).</li><li>Bush, J. O., Jiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palatogenesis:+morphogenetic+and+molecular+mechanisms+of+secondary+palate+development.">Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development.</a> Development. 139, 231-243 (2012).</li><li>Lan, Y., Xu, J., Jiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+Molecular+Mechanisms+of+Palatogenesis.">Cellular and Molecular Mechanisms of Palatogenesis.</a> Curr Top Dev Biol. 115, 59-84 (2015).</li><li>Taya, Y., O'Kane, S., Ferguson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+cleft+palate+in+TGF-b3+knockout+mice.">Pathogenesis of cleft palate in TGF-b3 knockout mice.</a> Development. 126, 3869-3879 (1999).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergence+and+Extrusion+Are+Required+for+Normal+Fusion+of+the+Mammalian+Secondary+Palate.">Convergence and Extrusion Are Required for Normal Fusion of the Mammalian Secondary Palate.</a> PLOS Biol. 13, 100122 (2015).</li><li>Yoshida, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periderm+cells+covering+palatal+shelves+have+tight+junctions+and+their+desquamation+reduces+the+polarity+of+palatal+shelf+epithelial+cells+in+palatogenesis.">Periderm cells covering palatal shelves have tight junctions and their desquamation reduces the polarity of palatal shelf epithelial cells in palatogenesis.</a> Genes Cells. 17, 455-472 (2012).</li><li>Fitchett, J., Hay, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medial+edge+epithelium+transforms+to+mesenchyme+after+embryonic+palatal+shelves+fuse.">Medial edge epithelium transforms to mesenchyme after embryonic palatal shelves fuse.</a> Dev. Biol. 131, 455-474 (1989).</li><li>Akira, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+TGF-beta3+for+epithelial-mesenchyme+transdifferentiated+MEE+in+palatogenesis.">The expression of TGF-beta3 for epithelial-mesenchyme transdifferentiated MEE in palatogenesis.</a> J Mol Hist. 41, 343-355 (2010).</li><li>Sani, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate-mapping+of+the+epithelial+seam+during+palatal+fusion+rules+out+epithelial-mesenchymal+transformation.">Fate-mapping of the epithelial seam during palatal fusion rules out epithelial-mesenchymal transformation.</a> Dev. Biol. 285, 490-495 (2005).</li><li>Jin, J. -. Z., Ding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cell+migration,+transdifferentiation+and+apoptosis+during+mouse+secondary+palate+fusion.">Analysis of cell migration, transdifferentiation and apoptosis during mouse secondary palate fusion.</a> Development. 133, 3341-3347 (2006).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+autonomous+requirement+for+Tgfbr2+in+the+disappearance+of+medial+edge+epithelium+during+palatal+fusion.">Cell autonomous requirement for Tgfbr2 in the disappearance of medial edge epithelium during palatal fusion.</a> Dev. Biol. 297, 238-248 (2006).</li><li>Carette, M. J., Ferguson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+medial+edge+epithelial+cells+during+palatal+fusion+in+vitro:+an+analysis+by+Dil+labelling+and+confocal+microscopy.">The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro: an analysis by Dil labelling and confocal microscopy.</a> Development. 114, 379-388 (1992).</li><li>Muzumdar, M., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li><li>Dassule, H., Lewis, P., Bei, M., Mass, R., McMahon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+regulates+growth+and+morphogenesis+of+the+tooth.">Sonic hedgehog regulates growth and morphogenesis of the tooth.</a> Development. 127, 4775-4785 (2000).</li><li>Eisenhoffer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crowding+induces+live+cell+extrusion+to+maintain+homeostatic+cell+numbers+in+epithelia.">Crowding induces live cell extrusion to maintain homeostatic cell numbers in epithelia.</a> Nature. 484, 501-546 (2012).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact:+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin.">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nat Methods. 5, 605-607 (2008).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact+mice+for+studying+F-actin+dynamics.">Lifeact mice for studying F-actin dynamics.</a> Nat Methods. 7, 168-169 (2010).</li><li>Can, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+correction+in+confocal+laser+microscopes:+a+novel+two-view+approach.">Attenuation correction in confocal laser microscopes: a novel two-view approach.</a> J Microsc. 211, (2003).</li><li>Veenman, C., Reinders, M., Backer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+motion+correspondence+for+densely+moving+points.">Resolving motion correspondence for densely moving points.</a> IEEE Trans Pattern Anal Mach Intell. 23, 54-72 (2001).</li><li>Udan, R., Piazza, V., Hsu, C., Hadjantonakis, A., Dickinson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+cell+dynamics+in+mouse+embryos+using+light-sheet+microscopy.">Quantitative imaging of cell dynamics in mouse embryos using light-sheet microscopy.</a> Development. 141, 4406-4414 (2014).</li><li>Stoller, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+reporter+mouse+expressing+a+nuclear+localized+fusion+of+GFP+and+beta-galactosidase+reveals+new+derivatives+of+Pax3-expressing+precursors.">Cre reporter mouse expressing a nuclear localized fusion of GFP and beta-galactosidase reveals new derivatives of Pax3-expressing precursors.</a> Genesis. 46, 200-204 (2008).</li></ol>

3D organ eksplant kültürü ile doku morfogenezinin canlı görüntülemesi, sabit doku kesitlerinin konvansiyonel boyama analizinde gösterilemeyen hücresel proseslerle ilgili ayrıntılı bilgi sağlayabilir. Fare embriyonik sekonder damakta in vitro eksplant kültürü kullanarak, epitelyal yakınsama ve hücre ekstrüzyonu içeren damak füzyonu için yeni bir mekanizma önermek için birkaç ilginç hücre davranışları gözlemledik. Bu tip çalışmalarda karşılaşılan ...

Doku füzyonu çoklu organların gelişiminde önemli bir adımdır. Yarık dudak ve damak, spina bifida ve kalp malformasyonları gibi temel insan doğum kusurları, doku füzyonu 1&#39;deki kusurlardan kaynaklanabilir. Fare sekonder damak füzyonu, gelişmede doku füzyonunu kontrol eden hücresel ve moleküler mekanizmaları tanımlamak için kapsamlı olarak incelenmiştir 2 , 3 , 4 . Fare, sekonder damak gelişimi E11.5 civarında başlar ve bilateral maksiller süreçlerin her birinde ikinci bir palale rafının büyümesi ile başlar. Palatal rafların başlangıçtaki büyümesi, yaklaşık olarak E14.0 olana kadar dil boyunca dikey olarak gerçekleşir; bu esnada, palatal raflar, dilin üstünde yatay olarak yükselir. Medial yönelimli büyüme, iki palatal rafın uygun epitelleri arasında fiziksel temasa neden olur ve orta hat epiteli oluştururE15.5 adresindeki Al Seam (MES). Müdahale eden MES, mezenkimal konfluansa ve tamamen sağlam erimiş ikinci taliatın gelişmesine E15.5 3 izin verecek şekilde ikincil palatal raflar arasında kaldırılmalıdır. Paylaşılan bir epitelial MES hücre tabakası, iki ayrı palet rafı arasında nasıl oluşturulur ve daha sonra mezenkimal konfluansı sağlamak için alınır damak gelişiminde merkezi bir sorundur. Fare histolojik ve elektron mikroskobu (EM) çalışmaları, eksplant kültürü çalışmaları ve fonksiyonel fare genetiği deneylerine dayanarak, bu süreçte birkaç temel hücre davranışı dahil edilmiştir. Her bir palatal rafın medial kenar epitelyumundan Filopodia benzeri projeksiyonlar ilk temas 5 , 6&#39;yı kolaylaştırır ve bunu takiben bu epitelyal hücrelerin ortak bir tek MES 6 , 7&#39;ye interkalasyonu sağlanır. Ortaya çıkan paylaşılan MES&#39;in kaldırılmasıÜç özel olmayan mekanizma ile devam etmesi önerildi. Histolojik gözlem ve yaşamsal boyalarla eks vivo soy araştırması kullanan erken çalışmalar, MES hücrelerinin epitelial mezenşimal geçiş (EMT) ile ortadan kaldırılabileceğini, ancak son zamanlarda epitelyal hücrelerin genetik soy taklidinin belirsizliği arttırdığını gösterdi ( 8 , 9) Epitel hücrelerinin palatal raf mezenkimine uzun süreli katkısı 10 , 11 , 12 . Önemli sayıda apoptotik hücre ve bazı mutantlarda uygun damak füzyonuna girilemeyen sayıda azalma, apoptozun MES çözünmesinin önemli bir sürücüsü olabileceği fikrini ortaya çıkarmıştır 2 , 3 . Sonunda, başlangıçta epitelial etiketleme ve progresif zaman noktalarında statik gözlemi içeren çalışmalara dayanan MES hücreleriOronazal ve anteroposterior boyutlarda 11 , 13&#39;e göç etmeleri önerildi, ancak bu tür dinamik hücre davranışları canlı palat dokuda gözlemlenememesi nedeniyle başlangıçta doğrulanmadı. Son zamanlarda, eksplant edilen palet raflarının konfokal canlı görüntülemesi ile flüoresan etiketlemenin fare genetik yöntemlerini birleştiren yeni bir canlı görüntüleme metodolojisi geliştirerek bu davranışları doğrudan gözlemledik. İlk olarak, damak füzyonu sırasında damak epitel hücrelerindeki dinamik hücresel davranışları görselleştirmek için Keratin14-cre fareleri 14 , 15 ile ROSA26- mTmG flox farelerini geçerek bir epitelyal spesifik raportör fare ürettik . Elde edilen embriyoların damak eksplant kültürünün konfokal canlı görüntülemesi, önceden önerilen bazı hücresel davranışları doğruladı ve füzyon işleminde yeni olayları saptadı 6 </&gt; Sup. Epitelyal hücre membranı çıkıntıları ilk hücre-hücre temasından önce gerçekleşmiş ve ardından hücre interkalasyonu ve oronazal hücre yer değiştirmesi ile epitelyal yakınsaklık izlemiştir. Özellikle, aynı zamanda bu hücre ekstrüzyon, epitelyal homeostazında önemli bir rol oynadığı rapor bir yöntem keşfettik, fare ikincil damak füzyon 6, 16 tahrik eden bir ana mekanizma oldu. Bu görüntüleme yöntemi, diğer muhabir hatlarıyla kullanılabilir; Füzyon işlemi sırasında aktin sitoskelet dinamikleri incelemek için , Lifeact-mRFPruby transgenik fareler 17 , 18&#39;i kullandık. Diğer gazeteciler damak füzyonunun diğer özel yönlerini gözlemlemek için de kullanılabilir ve bu yöntem görüntüleme ihtiyaçlarına ve mikroskop kullanılabilirliğine bağlı olarak lazer tarama konfokal mikroskopi veya eğirme disk konfokal mikroskopi için uyarlanabilir. Canlı görüntüleme gittikçe gelişme biyolojisinde temel taş yaklaşımı haline geliyor. PartiCularly, craniofacial morfogenezis karmaşıktır ve insanın yüzünü etkileyen doğum kusurları yaygındır. Bu konfokal canlı görüntüleme yöntemi, insan kraniofasial anormalliklerinin kökenlerinin yanı sıra temel temel gelişim mekanizmalarının daha iyi anlaşılmasına yardımcı olacaktır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1193">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Reagents</td>
			<td style="width:360px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td style="width:260px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DMEM/F12</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">L-glutamine</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Pennicillin/Streptomycin</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Low melting agarose</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>E-3111-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">35mm glass bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Petrolieum Jelly (Vaseline)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>16415-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Keratin14-cre</td>
			<td></td>
			<td>MGI: J:65294</td>
			<td>Allele = Tg(KRT14-cre)1Amc</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">ROSA26mTmG</td>
			<td></td>
			<td>MGI: J:124702</td>
			<td>Allele = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Lifeact-mRFPruby</td>
			<td></td>
			<td>MGI: J:164274</td>
			<td>Allele = Tg(CAG-mRuby)#Rows</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">White Light SP5 confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Cell Observer spinning disk confocal microscope</td>
			<td>Zeiss Microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of mouse secondary palate fusion

Sağlam sekonder damak oluşturmak için ikinci helezoni rafların kaynaştırılması, memeli gelişiminde kilit bir süreçtir ve bozulması, insanlarda yaygın görülen konjenital bir anomali yarık yarık damganın oluşmasına neden olabilir. İkincil damak füzyonu kapsamlı olarak incelenmiş ve bu süreçte aracılık yapabilen birkaç önerilen hücresel mekanizma ortaya çıkmıştır. Bununla birlikte, bu çalışmalar çoğunlukla, gelişme sırasındaki aşamalı zaman noktalarında sabit embriyonik dokularda veya statik zaman noktalarında analiz edilen sabit eksplant kültürlerinde gerçekleştirilmiştir. Statik analiz, damak füzyonu gibi dinamik morfogenetik süreçlerin analizi için sınırlıdır ve palatal füzyona ne tür dinamik hücresel davranışlar araştırabilir tam olarak anlaşılamamıştır. Burada fare embriyolarında ex vivo sekonder damak füzyonunun canlı görüntülenmesi için bir protokol açıklanmaktadır. Damak füzyonun hücresel davranışlarını incelemek için epitel özgü Keratin14 -cre ROS içinde damak epitel hücreleri etiketlemek için kullanıldıA26-mTmG flox raportör embriyoları. Filamentöz aktini görselleştirmek için, Lifeact-mRFPruby raportör fareleri kullanıldı. İkincil damak füzyonunun canlı görüntülemesi, embriyonik gün (E) 14.5 evre embriyolarının yakın zamanda yapışmış sekonder palal raflarını ve ters çevrilmiş bir konfokal mikroskop ile görüntülemeyi mümkün kılmak için agaroz içeren ortamda bir cam alt çanakta kültürleyerek diseke ederek gerçekleştirildi. Bu yöntemi kullanarak, ikinci damak füzyonu sırasında çeşitli yeni hücresel davranışlar tespit ettik. Farklı hücre davranışlarının uzayda ve zaman içinde nasıl koordine edildiğine dair bir değerlendirme, bu dinamik morfogenetik süreci anlamamıza büyük ölçüde katkıda bulunur. Bu protokol, mutant fare hatlarına veya ikincil damak füzyonunun nasıl kontrol edildiğini daha iyi anlamak için farmakolojik inhibitörlerle tedavi edilen kültürlere uygulanabilir.

Dudak eksplant kültüründe canlı görüntüleme, damak füzyonuna aracılık eden çok hücresel süreçleri ortaya koymuştur 6 . İki epitel hücresi arasındaki ilk temaslar membran çıkıntıları ile yapılır ( Şekil 2 B-2E ). İki epitelyal katman buluştuğunda, epitelyal yakınsak yoluyla entegre bir tek hücre katmanı MES yapmak için interkalasyonun ardından çok hücreli tabakalı bir MES oluşturur...

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion at JoVE.com

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Burada, konfokal mikroskopi kullanarak fare sekonder damak füzyonunun canlı görüntülemesi için bir protokol sunmaktayız. Bu protokol, çeşitli floresan muhabir fare hatları ve mekanik içgörü için yol inhibitörleri ile birlikte kullanılabilir. Bu protokol, diğer gelişimsel sistemlerde canlı görüntüleme için uyarlanabilir.

Fare İkincil Palin Füzyonunun Canlı Görüntüsü

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

The overall goal of this confocal live imaging method is to directly observe the cellular processes, the drive's secondary palate fusion during cranial facial development. Begin by separating the head from the body of the embryo under a dissecting microscope in a petri dish containing fresh, room temperature PBS. Grasp the head with one pair of fine number five forceps and use a second pair of forceps to remove the upper brain, cutting away any extra tissue outside of the palatal shelves with a second pair of forceps.Remove the mandible carefully without damaging the palatal shelves. When the mandible has been detached, carefully remove the tongue and confirm the presence of a robust reporter signal in the midline epithelia seam. It's important not to damage it, palatal explained during dissection to keep the midline epithelia seam intact.Next, remove the hind brain, brain stem and both maxilli with the adhered palatal shelves. Cut the anterior upper jaw tissue, keeping both the primary and secondary palates intact. Remove the nasal septum on the nasal side of the explant to expose the midline epithelia seam and confirm that the epithelia layer between the tissue is intact.Now, add live imaging medium to a 35 millimeter glass bottom dish and place the dissected palatal shelves, oral side down in the dish as close to the glass bottom as possible. Then, place dry ice pellets on a conductive surface near the culture dish to expedite the solidification of the agarose within the imaging medium. When the agarose is semi-solid, mount the culture dish in an inverted confocal microscope equipped with a 37 degree celsius incubation chamber and use a syringe to apply petroleum jelly between the culture dish and the culture cover to prevent evaporation of the imaging medium.Select a low magnification objective to locate the region of interest. Then, select a high magnification objective and scan multiple z stacks with five micron steps for 16 to 24 hours, using the appropriate laser excitation. Live imaging of palate explant culture reveals multiple cellular processes that mediate palate fusion, with the initial contacts between the two epithelia cells being made by membrane protrusions.When the two epithelia layers meet, they form a multi cell layered midline epithelia seam, followed by intercalation to generate an integrated single cell layer, midline epithelia seam through epithelia convergence. The epithelia cells in deeper z levels are also progressively displaced to the oral side of the midline epithelia seam, contributing to the epithelia convergence process. Posterior directed cell migration is observed in middle palate midline epithelia seam.With epithelia cell extrusion events observed during palate fusion, suggesting that the epithelia cells in the midline epithelia seam can be removed by this active process. This integrated epithelia seam will ultimately break down to achieve confluency. Further, filamentis actin becomes enriched at the border between the epithelia and mazenkemo areas, forming a cable like structure along the anterior posterior axis.Software can be used to track specific cellular behaviors of interest, during palate fusion with the best method for cell tracking depending on the reporter signal used in the experiment.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Canlı-görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupa Göz

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Gelişim Biyolojisi

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Canlı Görüntüleme Olgun Myofibers İn Vitro Farklılaşma içinde

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

Arabidopsis Çiçek Gelişmekte Konfokal Görüntüleme Canlı

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Uzun süreli Canlı Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Göz Disk

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Fare Malı İnsani Kemik İliği Mikro Çevrelerinin Biyomühendisliği ve Canlı Görüntüleme ile Görselleştirilmesi

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

Vitro Zigot polarizasyon, Live-hücre görüntüleme ve Arabidopsis thaliana embriyo desenlendirme için ovule ekimi

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Kromozom segregasyon mitoz sırasında canlı hücre görüntüleme

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Canlı görüntüleme ve Drosophila embryo kas kasılmaları Analizi

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging

Mikro-BT Görüntüleme için Erişkin ve Erken Postnatal Fare Akciğerlerinin Vasküler Döküm

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Geç Embriyonik Drosophila Gonad'ın Diseksiyonu ve Canlı Görüntülemesi

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...