Name: high-throughput screening for protein-based inheritance in s. cerevisiae
Uploaded: 2017-08-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae at JoVE.com

אנו מודים Sohini Chakrabortee סנדרה ג'ונס, דייוויד גרסיה, Bhupinder Bhullar, אמיליה צ'אנג, ריצ'רד היא, סוזן Lindquist לסיוע שלהם בפיתוח מבחני את הנייר הזה, כמו גם הבודקים המשמש את הערותיהם מתחשב.

1. Initial Overexpression
<ol>
	<li>Transform the yeast cells (in this case, BY4741 MAT a haploids) previously grown in YPD liquid (10 g of yeast extract, 20 g of peptone, and 20 g of glucose per 1 L) with the desired candidate constructs from the FLEXGene ORFeome library (yeast ORFs under the control of a galactose-inducible promoter in the URA3-marked centromericplasmid backbone, pBY01129).</li>
	<li>Use autoclaved toothpicks to pick four separate colonies from these...

<ol>
	<li>Halfmann, R., Alberti, S., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prions,+protein+homeostasis,+and+phenotypic+diversity.">Prions, protein homeostasis, and phenotypic diversity.</a> Trends Cell Biol. 20 (3), 125-133 (2010).</li><li>Byers, J. S., Jarosz, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pernicious+pathogens+or+expedient+elements+of+inheritance:+the+significance+of+yeast+prions.">Pernicious pathogens or expedient elements of inheritance: the significance of yeast prions.</a> PLoS Pathog. 10 (4), 1003992 (2014).</li><li>Jarosz, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-kingdom+chemical+communication+drives+a+heritable,+mutually+beneficial+prion-based+transformation+of+metabolism.">Cross-kingdom chemical communication drives a heritable, mutually beneficial prion-based transformation of metabolism.</a> Cell. 158 (5), 1083-1093 (2014).</li><li>True, H. L., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+prion+provides+a+mechanism+for+genetic+variation+and+phenotypic+diversity.">A yeast prion provides a mechanism for genetic variation and phenotypic diversity.</a> Nature. 407 (6803), 477-483 (2000).</li><li>Suzuki, G., Shimazu, N., Tanaka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+prion,+Mod5,+promotes+acquired+drug+resistance+and+cell+survival+under+environmental+stress.">A yeast prion, Mod5, promotes acquired drug resistance and cell survival under environmental stress.</a> Science. 336 (6079), 355-359 (2012).</li><li>Hou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAVS+forms+functional+prion-like+aggregates+to+activate+and+propagate+antiviral+innate+immune+response.">MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response.</a> Cell. 146 (3), 448-461 (2011).</li><li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion-like+polymerization+underlies+signal+transduction+in+antiviral+immune+defense+and+inflammasome+activation.">Prion-like polymerization underlies signal transduction in antiviral immune defense and inflammasome activation.</a> Cell. 156 (6), 1207-1222 (2014).</li><li>Majumdar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+of+amyloid-like+oligomers+of+Drosophila+Orb2+in+the+persistence+of+memory.">Critical role of amyloid-like oligomers of Drosophila Orb2 in the persistence of memory.</a> Cell. 148 (3), 515-529 (2012).</li><li>Khan, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloidogenic+Oligomerization+Transforms+Drosophila+Orb2+from+a+Translation+Repressor+to+an+Activator.">Amyloidogenic Oligomerization Transforms Drosophila Orb2 from a Translation Repressor to an Activator.</a> Cell. 163 (6), 1468-1483 (2015).</li><li>Fioriti, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Persistence+of+Hippocampal-Based+Memory+Requires+Protein+Synthesis+Mediated+by+the+Prion-like+Protein+CPEB3.">The Persistence of Hippocampal-Based Memory Requires Protein Synthesis Mediated by the Prion-like Protein CPEB3.</a> Neuron. 86 (6), 1433-1448 (2015).</li><li>Derkatch, I. L., Bradley, M. E., Hong, J. Y., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prions+affect+the+appearance+of+other+prions:+the+story+of+[PIN(+)].">Prions affect the appearance of other prions: the story of [PIN(+)].</a> Cell. 106 (2), 171-182 (2001).</li><li>Alberti, S., Halfmann, R., King, O., Kapila, A., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+survey+identifies+prions+and+illuminates+sequence+features+of+prionogenic+proteins.">A systematic survey identifies prions and illuminates sequence features of prionogenic proteins.</a> Cell. 137 (1), 146-158 (2009).</li><li>Chernoff, Y. O., Lindquist, S. L., Ono, B., Inge-Vechtomov, S. G., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+chaperone+protein+Hsp104+in+propagation+of+the+yeast+prion-like+factor+[psi+].">Role of the chaperone protein Hsp104 in propagation of the yeast prion-like factor [psi+].</a> Science. 268 (5212), 880-884 (1995).</li><li>Patino, M. M., Liu, J. J., Glover, J. R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Support+for+the+prion+hypothesis+for+inheritance+of+a+phenotypic+trait+in+yeast.">Support for the prion hypothesis for inheritance of a phenotypic trait in yeast.</a> Science. 273 (5275), 622-626 (1996).</li><li>Wickner, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[URE3]+as+an+altered+URE2+protein:+evidence+for+a+prion+analog+in+Saccharomyces+cerevisiae.">[URE3] as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae.</a> Science. 264 (5158), 566-569 (1994).</li><li>Sondheimer, N., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rnq1:+an+epigenetic+modifier+of+protein+function+in+yeast.">Rnq1: an epigenetic modifier of protein function in yeast.</a> Mol Cell. 5 (1), 163-172 (2000).</li><li>Balbirnie, M., Grothe, R., Eisenberg, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+amyloid-forming+peptide+from+the+yeast+prion+Sup35+reveals+a+dehydrated+beta-sheet+structure+for+amyloid.">An amyloid-forming peptide from the yeast prion Sup35 reveals a dehydrated beta-sheet structure for amyloid.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2375-2380 (2001).</li><li>Glover, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-seeded+fibers+formed+by+Sup35,+the+protein+determinant+of+[PSI+],+a+heritable+prion-like+factor+of+S.+cerevisiae.">Self-seeded fibers formed by Sup35, the protein determinant of [PSI+], a heritable prion-like factor of S. cerevisiae.</a> Cell. 89 (5), 811-819 (1997).</li><li>King, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion-inducing+domain+2-114+of+yeast+Sup35+protein+transforms+in+vitro+into+amyloid-like+filaments.">Prion-inducing domain 2-114 of yeast Sup35 protein transforms in vitro into amyloid-like filaments.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6618-6622 (1997).</li><li>Shorter, J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp104+catalyzes+formation+and+elimination+of+self-replicating+Sup35+prion+conformers.">Hsp104 catalyzes formation and elimination of self-replicating Sup35 prion conformers.</a> Science. 304 (5678), 1793-1797 (2004).</li><li>Ferreira, P. C., Ness, F., Edwards, S. R., Cox, B. S., Tuite, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+elimination+of+the+yeast+[PSI+]+prion+by+guanidine+hydrochloride+is+the+result+of+Hsp104+inactivation.">The elimination of the yeast [PSI+] prion by guanidine hydrochloride is the result of Hsp104 inactivation.</a> Mol Microbiol. 40 (6), 1357-1369 (2001).</li><li>Caudron, F., Barral, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+super-assembly+of+Whi3+encodes+memory+of+deceptive+encounters+by+single+cells+during+yeast+courtship.">A super-assembly of Whi3 encodes memory of deceptive encounters by single cells during yeast courtship.</a> Cell. 155 (6), 1244-1257 (2013).</li><li>Wickner, R. B., Edskes, H. K., Shewmaker, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+find+a+prion:+[URE3],+[PSI+]+and+[beta].">How to find a prion: [URE3], [PSI+] and [beta].</a> Methods. 39 (1), 3-8 (2006).</li><li>Chernoff, Y. O., Derkach, I. L., Inge-Vechtomov, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicopy+SUP35+gene+induces+de-novo+appearance+of+psi-like+factors+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Multicopy SUP35 gene induces de-novo appearance of psi-like factors in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Curr Genet. 24 (3), 268-270 (1993).</li><li>Brown, J. C., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+heritable+switch+in+carbon+source+utilization+driven+by+an+unusual+yeast+prion.">A heritable switch in carbon source utilization driven by an unusual yeast prion.</a> Genes Dev. 23 (19), 2320-2332 (2009).</li><li>Coustou, V., Deleu, C., Saupe, S., Begueret, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+product+of+the+het-s+heterokaryon+incompatibility+gene+of+the+fungus+Podospora+anserina+behaves+as+a+prion+analog.">The protein product of the het-s heterokaryon incompatibility gene of the fungus Podospora anserina behaves as a prion analog.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (18), 9773-9778 (1997).</li><li>Sopko, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+pathways+and+phenotypes+by+systematic+gene+overexpression.">Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression.</a> Mol Cell. 21 (3), 319-330 (2006).</li><li>Chakrabortee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsically+Disordered+Proteins+Drive+Emergence+and+Inheritance+of+Biological+Traits.">Intrinsically Disordered Proteins Drive Emergence and Inheritance of Biological Traits.</a> Cell. 167 (2), 369-381 (2016).</li><li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaching+a+complete+repository+of+sequence-verified+protein-encoding+clones+for+Saccharomyces+cerevisiae.">Approaching a complete repository of sequence-verified protein-encoding clones for Saccharomyces cerevisiae.</a> Genome Res. 17 (4), 536-543 (2007).</li><li>Swain, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inferring+time+derivatives+including+cell+growth+rates+using+Gaussian+processes.">Inferring time derivatives including cell growth rates using Gaussian processes.</a> Nat Commun. 7, 13766 (2016).</li><li>Jarosz, D. F., Lancaster, A. K., Brown, J. C., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolutionarily+conserved+prion-like+element+converts+wild+fungi+from+metabolic+specialists+to+generalists.">An evolutionarily conserved prion-like element converts wild fungi from metabolic specialists to generalists.</a> Cell. 158 (5), 1072-1082 (2014).</li><li>Neiman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sporulation+in+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).</li><li>Gietz, D., St Jean, A., Woods, R. A., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+method+for+high+efficiency+transformation+of+intact+yeast+cells.">Improved method for high efficiency transformation of intact yeast cells.</a> Nucleic Acids Res. 20 (6), 1425 (1992).</li><li>Formosa, T., Nittis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppressors+of+the+temperature+sensitivity+of+DNA+polymerase+alpha+mutations+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Suppressors of the temperature sensitivity of DNA polymerase alpha mutations in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Gen Genet. 257 (4), 461-468 (1998).</li><li>Christiano, R., Nagaraj, N., Frohlich, F., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+proteome+turnover+analyses+of+the+Yeasts+S.+cerevisiae+and+S.+pombe.">Global proteome turnover analyses of the Yeasts S. cerevisiae and S. pombe.</a> Cell Rep. 9 (5), 1959-1965 (2014).</li><li>Lancaster, A. K., Nutter-Upham, A., Lindquist, S., King, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PLAAC:+a+web+and+command-line+application+to+identify+proteins+with+prion-like+amino+acid+composition.">PLAAC: a web and command-line application to identify proteins with prion-like amino acid composition.</a> Bioinformatics. 30 (17), 2501-2502 (2014).</li><li>Halfmann, R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+amyloid+aggregation+by+Semi-Denaturing+Detergent-Agarose+Gel+Electrophoresis.">Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis.</a> J Vis Exp. (17), (2008).</li><li>Rogoza, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-Mendelian+determinant+[ISP+]+in+yeast+is+a+nuclear-residing+prion+form+of+the+global+transcriptional+regulator+Sfp1.">Non-Mendelian determinant [ISP+] in yeast is a nuclear-residing prion form of the global transcriptional regulator Sfp1.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (23), 10573-10577 (2010).</li><li>Shorter, J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prions+as+adaptive+conduits+of+memory+and+inheritance.">Prions as adaptive conduits of memory and inheritance.</a> Nat Rev Genet. 6 (6), 435-450 (2005).</li><li>Tanaka, M., Chien, P., Naber, N., Cooke, R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+variations+in+an+infectious+protein+determine+prion+strain+differences.">Conformational variations in an infectious protein determine prion strain differences.</a> Nature. 428 (6980), 323-328 (2004).</li><li>Tanaka, M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+protein+transformation+protocol+for+introducing+prions+into+yeast.">An efficient protein transformation protocol for introducing prions into yeast.</a> Methods Enzymol. 412, 185-200 (2006).</li><li>Roberts, B. T., Wickner, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+activity:+a+prion+that+propagates+by+covalent+autoactivation.">Heritable activity: a prion that propagates by covalent autoactivation.</a> Genes Dev. 17 (17), 2083-2087 (2003).</li><li>Ozbudak, E. M., Thattai, M., Lim, H. N., Shraiman, B. I., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multistability+in+the+lactose+utilization+network+of+Escherichia+coli.">Multistability in the lactose utilization network of Escherichia coli.</a> Nature. 427 (6976), 737-740 (2004).</li></ol>

Prions הראשון שמרים זוהו על ידי שלהם יוצא דופן פנוטיפים ודפוסי מביך של ירושה. המאפיינים של אלה prions ואז שימשו לבניית אלגוריתמים, כלים חישוביים למסך חלבונים פריון נוספים. השיטה המתוארת כאן, לעומת זאת, נסיוני ומסתמך על ביטוי ארעית כדי ליצור מתמשך שינוי-a יציב מקודד המדינה קונפורמציה חלבון. עם זאת...

מערכות ביולוגיות חווים לעתים קרובות תנודות ארעי בשפע חלבון. בין אם אלה יש השפעה ממושכת בעיצוב של פנוטיפ של אורגניזם או של דורות העתיד עדיין לא ברור. המופעים הידועים ביותר של ביולוגיה זה לערב מחלקה נדיר של חלבונים, prions, אשר כונן את הופעתה של תכונות heritable ללא שינוי הגנום. במקום זאת, החלקיקים fectious pro, teinaceous וב -לשדר פנוטיפים באמצעות שינויים המנציחים את החלבון קונפורמציה1,2. סוג זה של ירושה התגלה כגורם של הדפוסים ירושה יוצא דופן של מחלה ניווניות הרסנית. עם זאת, מחקרים אורגניזמים ועד פטריות יונקים3,4,5,6,7,8,9,10 מאז גילו כי רכיבים דמויי פריון יכול להתייעץ ערך מסתגלת. למרות זאת, prions מתפרשת מרתקת אבל נדיר oddity ביולוגי.
זו חוכמה הרווחת מתקיים באופן חלקי בגלל האפיון של ירושה חלבון מבוססת זמן הוגבלה על ידי קבוצה קטנה של דוגמאות. מאמצי ההקרנה שיטתית ובמתמטיקה תמונה זו במידה ניכרת על-ידי זיהוי מספר bona אמן חדש prions11 וכמעט שני תריסר חלבון תחומים12 עם יכולת המרה הסתגלותי פריון כמו דלק. עם זאת, כי גישות אלה התמקדו בדרך כלל הטיות רצף חומצות אמיניות חזקה, prions זה התגלו לשתף את המאפיינים הביוכימי של המייסד שמרים prions [PSI+]13,14, [URE3]15,11,[RNQ+]16. אלה כוללים: 1) מודולרי תחומים שאינם עשירים מותח פולימריים זמן של אספרגין (N) וגלוטמין (Q) 2) הרכבה לתוך עמילואיד [פריון+] קונפורמציה17,18,19, ו- 3) להשלים את ההסתמכות על disaggregase Hsp104 פונקציה עבור הפצת נאמן מאמא ל בת13,20,21. ואכן, רבים בונה פיד ה prions, לרבות [גאר+], [הט-s], והוא אפילו את הפריון המקורי (PrPSc), יהיו חסרים תחת קריטריונים מחמירים כגון. אולי חשוב יותר, הם יהיו מסוגלים ללכוד את כל מנגנוני הרומן של ירושה מבוססי חלבונים22. לכן, מגוון ביולוגי אמיתי תופעות כאלה עשויים להיות הרבה יותר נפוץ בטבע מכפי ששוער.
כדי לחקור את השאלה הזו, הועסק אסטרטגיה תפוקה גבוהה, פרוטאום ברוחב. סימן היכר של כל prions, כולל PrPSc, [גאר+], והוא [הט-s], כי ביטוי ארעית של החלבונים סיבתי חזק מגביר את הקצב של פריון רכישה15,23,24,25,26. אנחנו ניצלו תכונה זו באופן שיטתי לשאול, על פני כולו שמרים ORFeome, אם הברית מבוסס-חלבון, epigenetic יציב יכול להיות ביוזמת transiently שייצור את ביטוי של חלבונים בודדים. ידוע שכי ביטוי חלבון יכול לשנות פנוטיפים27. עם זאת, פריון חלבונים הם יוצא דופן כי שלהם מתערובת זמנית מייצרת שינוי פנוטיפ זה heritable מאות רבות של דורות לאחר ביטוי ראשוני. בעבר לקחנו לנצל תכונה זו, כמו גם את דפוסי ירושה יוצא דופן של חלבון מבוססת מרכיבים גנטיים, לזהות עשרות חלבונים המסוגלים heritably חיווט מחדש נופים פנוטיפי מבלי לשנות את הגנום28. למרות כמה לזהות חלבונים היו בעבר המכונה prions, רובם היו לא, דבר המלמד את הכוח של גישה זו לחשוף את צורות חדשות של חלבון מבוססת ירושה.

<table width="958">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:356px;height:21px;">Guanidine hydrochloride</td>
			<td style="width:299px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">Cat#G3272-25G</td>
			<td style="width:179px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manganese chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat#M8054-100G</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethidium bromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1510</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5-Fluoroorotic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat#F5013-50MG</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BY4741 MATa (his3&#916;1 leu2&#916;0 LYS2 met15&#916;0 ura3&#916;0)</td>
			<td>Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Yeast strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BY4741 MAT&#945; (his3&#916;1 leu2&#916;0 lys2&#916;0 MET15 ura3&#916;0)</td>
			<td>Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Yeast strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hsp70 (K69M)&#160;</td>
			<td>Jarosz et al., 2014b</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FLEXGene library</td>
			<td>Hu et al., 2007</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Plasmid library</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextrose (glucose)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-3</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Raffinose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R0250-25G</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Galactose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP656-500</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CSM</td>
			<td>Sunrise Science</td>
			<td>1001-100</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CSM-URA</td>
			<td>Sunrise Science</td>
			<td>1004-100</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CSM-LYS</td>
			<td>Sunrise Science</td>
			<td>1032-100</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CSM-MET</td>
			<td>Sunrise Science</td>
			<td>1019-100</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CSM-LYS-MET</td>
			<td>Sunrise Science</td>
			<td>1035-100</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">yeast extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">peptone</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>P20240-5000</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">bacto-peptone</td>
			<td>BD</td>
			<td align="right">211677</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glycerol</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>GX0185-2</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">yeast nitrogen base w/o amino acids</td>
			<td>BD</td>
			<td align="right">291920</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">agar</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB49172</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adenine sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3159-25G</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1190-500G</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Uracil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0750-100G</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Histidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8000-100G</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leucine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8000-25G</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5501-25G</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNase I&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EN0601</td>
			<td>Enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">biotinylated DNase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM1906</td>
			<td>Enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">zymolyase 100T (yeast lytic enzyme)</td>
			<td>Sunrise Science</td>
			<td>N0766555</td>
			<td>Enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy H1</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microplate stacker</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BioStack3</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plate filler</td>
			<td>BiotTek</td>
			<td>EL406</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liquid handling robot</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Biomek FX</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput screening for protein-based inheritance in s. cerevisiae

קידוד מידע ביולוגי שנגיש לדורות מושגת בדרך כלל באמצעות שינויים רצף הדנ א. ירושה מאריכים מקודד חלבון קונפורמציה (במקום רצף) שהוצג זמן הפרדיגמה-shifting אבל נדיר. הדוגמאות מאופיין בצורה הטובה ביותר של רכיבים כגון epigenetic נמצאים prions, אשר בעלי התנהגות וההספק עצמית שיכולים להביא ביטוי heritable של פנוטיפים חדש. Prions ארכיטיפי רבים להציג דעה קדומה רצף מרשים של N/Q-עשיר ולהרכיב לתוך קיפול עמילואיד. אלה מאפיינים יוצאי דופן יש הודיע רוב המאמצים ההקרנה כדי לזהות חלבונים חדשים פריון. עם זאת, לפחות שלושה prions ידוע (כולל את הפריון המייסדים, PrPSc) לא הנמל מאפיינים אלו הביוכימי. לכן פיתחנו שיטה חלופית כדי לחקור את היקף הירושה חלבון מבוססת בהתבסס על מאפיין של פעולה המונית: ביטוי ארעית של חלבונים פריון מגדיל את תדירות שבו הם רוכשים קונפורמציה של העצמי-תבניות. מאמר זה מתאר שיטה לניתוח הקיבולת של שמרים ORFeome להפיק חלבון מבוססת ירושה. באמצעות אסטרטגיה זו, מצאנו כי בעבר &gt; 1% של חלבונים שמרים יכול לתדלק את הופעתה של תכונות ביולוגיות היו מאריכים, יציב, וקם בתדירות גבוהה יותר מאשר מוטציה גנטית. יכול להיות מועסקים גישה זו תפוקה גבוהה על פני כל ORFeomes או פרדיגמה ההקרנה ממוקד עבור רשתות גנטיות ספציפיות או גירויים סביבתיים. בדיוק כמו מסכי גנטי קדימה להגדיר אינספור מסלולים התפתחותית, איתות, טכניקות אלה מספקים מתודולוגיה לחקור את ההשפעה של חלבון מבוססת ירושה תהליכים ביולוגיים.

Protein overexpression is known to dramatically alter cellular phenotypes27. Indeed, with an initial screening approach, hundreds of new phenotypes were reproducibly recovered from the overexpression of clones from the yeast ORFeome using just ten stressors. However, the assays described above allow for the assessment of whether cells retain any long-term stable phenotypes following this overexpression. One protein capable of encoding such a state is Psp1. Psp1 is ...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae at JoVE.com

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה תפוקה גבוהה על המסך באופן פונקציונלי עבור חלבון מבוססת ירושה cerevisiae ס.

הקרנה תפוקה גבוהה של חלבון מבוססת ירושה cerevisiae ס

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived ...

Research

JoVE Journal

Biology

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Assay עבור הידבקות ואת הפלישה אגר ב cerevisiae ס

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

שיטת תפוקה גבוהה ברחבי העולם כדי ללמוד את המורפולוגיה של אברון cerevisiae ס

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

זיהוי של קומפלקסים חלבונים עם proteomics כמותיים cerevisiae ס

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

תפוקה גבוהה הקרנת ו biosensing עם פלורסנט ג elegans מתחים

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

הקרנת תפוקה גבוהה של פעילות Endoglucanase פטרייתיים ב Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

טיהור הזרימה Cytometry מבוסס<em&gt; ס cerevisiae</em&gt; זיגוטות

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

הקרנת תפוקה גבוהה למאפנני מולקולה הקטנה של ערוצי אשלגן מיישרים פנימה

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

הקרנה פונקציונלית תפוקה גבוהה באמצעות assay בלוציפראז Dual-זוהר תוצרת בית

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

הקרנת תפוקה גבוהה ביטוי כמותי וטיהור יישומים לחלבוני ארס רקומביננטי דיסולפיד עשירים הופק ב<em&gt; א coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...