Name: high-throughput screening for protein-based inheritance in s. cerevisiae
Uploaded: 2017-08-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae at JoVE.com

Мы благодарим Sohini Chakrabortee, Сандра Джонс, Дэвид Гарсия, Bhupinder Bhullar, Амелия Chang, Ричард она и Сьюзен Линдквист за их помощь в разработке анализов, используемые в этом документе, а также рецензентов для их вдумчивые комментарии.

1. Initial Overexpression
<ol>
	<li>Transform the yeast cells (in this case, BY4741 MAT a haploids) previously grown in YPD liquid (10 g of yeast extract, 20 g of peptone, and 20 g of glucose per 1 L) with the desired candidate constructs from the FLEXGene ORFeome library (yeast ORFs under the control of a galactose-inducible promoter in the URA3-marked centromericplasmid backbone, pBY01129).</li>
	<li>Use autoclaved toothpicks to pick four separate colonies from these...

<ol>
	<li>Halfmann, R., Alberti, S., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prions,+protein+homeostasis,+and+phenotypic+diversity.">Prions, protein homeostasis, and phenotypic diversity.</a> Trends Cell Biol. 20 (3), 125-133 (2010).</li><li>Byers, J. S., Jarosz, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pernicious+pathogens+or+expedient+elements+of+inheritance:+the+significance+of+yeast+prions.">Pernicious pathogens or expedient elements of inheritance: the significance of yeast prions.</a> PLoS Pathog. 10 (4), 1003992 (2014).</li><li>Jarosz, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-kingdom+chemical+communication+drives+a+heritable,+mutually+beneficial+prion-based+transformation+of+metabolism.">Cross-kingdom chemical communication drives a heritable, mutually beneficial prion-based transformation of metabolism.</a> Cell. 158 (5), 1083-1093 (2014).</li><li>True, H. L., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+prion+provides+a+mechanism+for+genetic+variation+and+phenotypic+diversity.">A yeast prion provides a mechanism for genetic variation and phenotypic diversity.</a> Nature. 407 (6803), 477-483 (2000).</li><li>Suzuki, G., Shimazu, N., Tanaka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+prion,+Mod5,+promotes+acquired+drug+resistance+and+cell+survival+under+environmental+stress.">A yeast prion, Mod5, promotes acquired drug resistance and cell survival under environmental stress.</a> Science. 336 (6079), 355-359 (2012).</li><li>Hou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAVS+forms+functional+prion-like+aggregates+to+activate+and+propagate+antiviral+innate+immune+response.">MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response.</a> Cell. 146 (3), 448-461 (2011).</li><li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion-like+polymerization+underlies+signal+transduction+in+antiviral+immune+defense+and+inflammasome+activation.">Prion-like polymerization underlies signal transduction in antiviral immune defense and inflammasome activation.</a> Cell. 156 (6), 1207-1222 (2014).</li><li>Majumdar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+of+amyloid-like+oligomers+of+Drosophila+Orb2+in+the+persistence+of+memory.">Critical role of amyloid-like oligomers of Drosophila Orb2 in the persistence of memory.</a> Cell. 148 (3), 515-529 (2012).</li><li>Khan, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloidogenic+Oligomerization+Transforms+Drosophila+Orb2+from+a+Translation+Repressor+to+an+Activator.">Amyloidogenic Oligomerization Transforms Drosophila Orb2 from a Translation Repressor to an Activator.</a> Cell. 163 (6), 1468-1483 (2015).</li><li>Fioriti, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Persistence+of+Hippocampal-Based+Memory+Requires+Protein+Synthesis+Mediated+by+the+Prion-like+Protein+CPEB3.">The Persistence of Hippocampal-Based Memory Requires Protein Synthesis Mediated by the Prion-like Protein CPEB3.</a> Neuron. 86 (6), 1433-1448 (2015).</li><li>Derkatch, I. L., Bradley, M. E., Hong, J. Y., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prions+affect+the+appearance+of+other+prions:+the+story+of+[PIN(+)].">Prions affect the appearance of other prions: the story of [PIN(+)].</a> Cell. 106 (2), 171-182 (2001).</li><li>Alberti, S., Halfmann, R., King, O., Kapila, A., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+survey+identifies+prions+and+illuminates+sequence+features+of+prionogenic+proteins.">A systematic survey identifies prions and illuminates sequence features of prionogenic proteins.</a> Cell. 137 (1), 146-158 (2009).</li><li>Chernoff, Y. O., Lindquist, S. L., Ono, B., Inge-Vechtomov, S. G., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+chaperone+protein+Hsp104+in+propagation+of+the+yeast+prion-like+factor+[psi+].">Role of the chaperone protein Hsp104 in propagation of the yeast prion-like factor [psi+].</a> Science. 268 (5212), 880-884 (1995).</li><li>Patino, M. M., Liu, J. J., Glover, J. R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Support+for+the+prion+hypothesis+for+inheritance+of+a+phenotypic+trait+in+yeast.">Support for the prion hypothesis for inheritance of a phenotypic trait in yeast.</a> Science. 273 (5275), 622-626 (1996).</li><li>Wickner, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[URE3]+as+an+altered+URE2+protein:+evidence+for+a+prion+analog+in+Saccharomyces+cerevisiae.">[URE3] as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae.</a> Science. 264 (5158), 566-569 (1994).</li><li>Sondheimer, N., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rnq1:+an+epigenetic+modifier+of+protein+function+in+yeast.">Rnq1: an epigenetic modifier of protein function in yeast.</a> Mol Cell. 5 (1), 163-172 (2000).</li><li>Balbirnie, M., Grothe, R., Eisenberg, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+amyloid-forming+peptide+from+the+yeast+prion+Sup35+reveals+a+dehydrated+beta-sheet+structure+for+amyloid.">An amyloid-forming peptide from the yeast prion Sup35 reveals a dehydrated beta-sheet structure for amyloid.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2375-2380 (2001).</li><li>Glover, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-seeded+fibers+formed+by+Sup35,+the+protein+determinant+of+[PSI+],+a+heritable+prion-like+factor+of+S.+cerevisiae.">Self-seeded fibers formed by Sup35, the protein determinant of [PSI+], a heritable prion-like factor of S. cerevisiae.</a> Cell. 89 (5), 811-819 (1997).</li><li>King, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion-inducing+domain+2-114+of+yeast+Sup35+protein+transforms+in+vitro+into+amyloid-like+filaments.">Prion-inducing domain 2-114 of yeast Sup35 protein transforms in vitro into amyloid-like filaments.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6618-6622 (1997).</li><li>Shorter, J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp104+catalyzes+formation+and+elimination+of+self-replicating+Sup35+prion+conformers.">Hsp104 catalyzes formation and elimination of self-replicating Sup35 prion conformers.</a> Science. 304 (5678), 1793-1797 (2004).</li><li>Ferreira, P. C., Ness, F., Edwards, S. R., Cox, B. S., Tuite, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+elimination+of+the+yeast+[PSI+]+prion+by+guanidine+hydrochloride+is+the+result+of+Hsp104+inactivation.">The elimination of the yeast [PSI+] prion by guanidine hydrochloride is the result of Hsp104 inactivation.</a> Mol Microbiol. 40 (6), 1357-1369 (2001).</li><li>Caudron, F., Barral, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+super-assembly+of+Whi3+encodes+memory+of+deceptive+encounters+by+single+cells+during+yeast+courtship.">A super-assembly of Whi3 encodes memory of deceptive encounters by single cells during yeast courtship.</a> Cell. 155 (6), 1244-1257 (2013).</li><li>Wickner, R. B., Edskes, H. K., Shewmaker, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+find+a+prion:+[URE3],+[PSI+]+and+[beta].">How to find a prion: [URE3], [PSI+] and [beta].</a> Methods. 39 (1), 3-8 (2006).</li><li>Chernoff, Y. O., Derkach, I. L., Inge-Vechtomov, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicopy+SUP35+gene+induces+de-novo+appearance+of+psi-like+factors+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Multicopy SUP35 gene induces de-novo appearance of psi-like factors in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Curr Genet. 24 (3), 268-270 (1993).</li><li>Brown, J. C., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+heritable+switch+in+carbon+source+utilization+driven+by+an+unusual+yeast+prion.">A heritable switch in carbon source utilization driven by an unusual yeast prion.</a> Genes Dev. 23 (19), 2320-2332 (2009).</li><li>Coustou, V., Deleu, C., Saupe, S., Begueret, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+product+of+the+het-s+heterokaryon+incompatibility+gene+of+the+fungus+Podospora+anserina+behaves+as+a+prion+analog.">The protein product of the het-s heterokaryon incompatibility gene of the fungus Podospora anserina behaves as a prion analog.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (18), 9773-9778 (1997).</li><li>Sopko, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+pathways+and+phenotypes+by+systematic+gene+overexpression.">Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression.</a> Mol Cell. 21 (3), 319-330 (2006).</li><li>Chakrabortee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsically+Disordered+Proteins+Drive+Emergence+and+Inheritance+of+Biological+Traits.">Intrinsically Disordered Proteins Drive Emergence and Inheritance of Biological Traits.</a> Cell. 167 (2), 369-381 (2016).</li><li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaching+a+complete+repository+of+sequence-verified+protein-encoding+clones+for+Saccharomyces+cerevisiae.">Approaching a complete repository of sequence-verified protein-encoding clones for Saccharomyces cerevisiae.</a> Genome Res. 17 (4), 536-543 (2007).</li><li>Swain, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inferring+time+derivatives+including+cell+growth+rates+using+Gaussian+processes.">Inferring time derivatives including cell growth rates using Gaussian processes.</a> Nat Commun. 7, 13766 (2016).</li><li>Jarosz, D. F., Lancaster, A. K., Brown, J. C., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolutionarily+conserved+prion-like+element+converts+wild+fungi+from+metabolic+specialists+to+generalists.">An evolutionarily conserved prion-like element converts wild fungi from metabolic specialists to generalists.</a> Cell. 158 (5), 1072-1082 (2014).</li><li>Neiman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sporulation+in+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).</li><li>Gietz, D., St Jean, A., Woods, R. A., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+method+for+high+efficiency+transformation+of+intact+yeast+cells.">Improved method for high efficiency transformation of intact yeast cells.</a> Nucleic Acids Res. 20 (6), 1425 (1992).</li><li>Formosa, T., Nittis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppressors+of+the+temperature+sensitivity+of+DNA+polymerase+alpha+mutations+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Suppressors of the temperature sensitivity of DNA polymerase alpha mutations in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Gen Genet. 257 (4), 461-468 (1998).</li><li>Christiano, R., Nagaraj, N., Frohlich, F., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+proteome+turnover+analyses+of+the+Yeasts+S.+cerevisiae+and+S.+pombe.">Global proteome turnover analyses of the Yeasts S. cerevisiae and S. pombe.</a> Cell Rep. 9 (5), 1959-1965 (2014).</li><li>Lancaster, A. K., Nutter-Upham, A., Lindquist, S., King, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PLAAC:+a+web+and+command-line+application+to+identify+proteins+with+prion-like+amino+acid+composition.">PLAAC: a web and command-line application to identify proteins with prion-like amino acid composition.</a> Bioinformatics. 30 (17), 2501-2502 (2014).</li><li>Halfmann, R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+amyloid+aggregation+by+Semi-Denaturing+Detergent-Agarose+Gel+Electrophoresis.">Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis.</a> J Vis Exp. (17), (2008).</li><li>Rogoza, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-Mendelian+determinant+[ISP+]+in+yeast+is+a+nuclear-residing+prion+form+of+the+global+transcriptional+regulator+Sfp1.">Non-Mendelian determinant [ISP+] in yeast is a nuclear-residing prion form of the global transcriptional regulator Sfp1.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (23), 10573-10577 (2010).</li><li>Shorter, J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prions+as+adaptive+conduits+of+memory+and+inheritance.">Prions as adaptive conduits of memory and inheritance.</a> Nat Rev Genet. 6 (6), 435-450 (2005).</li><li>Tanaka, M., Chien, P., Naber, N., Cooke, R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+variations+in+an+infectious+protein+determine+prion+strain+differences.">Conformational variations in an infectious protein determine prion strain differences.</a> Nature. 428 (6980), 323-328 (2004).</li><li>Tanaka, M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+protein+transformation+protocol+for+introducing+prions+into+yeast.">An efficient protein transformation protocol for introducing prions into yeast.</a> Methods Enzymol. 412, 185-200 (2006).</li><li>Roberts, B. T., Wickner, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+activity:+a+prion+that+propagates+by+covalent+autoactivation.">Heritable activity: a prion that propagates by covalent autoactivation.</a> Genes Dev. 17 (17), 2083-2087 (2003).</li><li>Ozbudak, E. M., Thattai, M., Lim, H. N., Shraiman, B. I., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multistability+in+the+lactose+utilization+network+of+Escherichia+coli.">Multistability in the lactose utilization network of Escherichia coli.</a> Nature. 427 (6976), 737-740 (2004).</li></ol>

Первый прионов дрожжи были определены их необычные фенотипы и запутанной модели наследования. Характеристики этих прионы, затем были использованы для построения алгоритмов и вычислительных средств экран для дополнительных прионных белков. Метод, описанный здесь, напротив, экспериме?...

Биологические системы часто испытывают временные колебания в изобилии белка. Ли они имеют долговременное воздействие на формирование фенотип организма или будущих поколений остается неясным. Известных экземпляров этой биологии включать редкие класса белков, прионы, подталкивающих появление наследственные черты без модификации генома. Вместо этого эти проteinaceous и вобструктиным частицы передают фенотипов через самоподдерживающиеся изменения конформации белка1,2. Этот тип наследования был обнаружен в качестве причины необычной наследования шаблонов разрушительные нейродегенеративных заболеваний. Однако исследования в организмах, начиная от грибов до млекопитающих3,4,5,6,,78,9,10 с тех пор показали, что китовая птичка как элементы могут иметь значение adaptive. Тем не менее прионы были осмотрены как увлекательная, но редких биологических странность.
Этот сложившейся мудрость проводится в части потому что характеристика на основе белков наследования давно были ограничены небольшим набором примеров. Недавние усилия систематического отбора значительно расширили эту картину путем выявления несколько новых bona fide прионов11 и белка почти двух десятков доменов12 мощностью до конформационные конверсии топлива китовая птичка как. Однако потому что эти подходы как правило сосредоточены на сильных аминокислот последовательности предубеждения, прионы, которые были обнаружены поделиться биохимические свойства основателей дрожжи прионов [PSI+]13,14,15[URE3] и [RNQ+]11,16. К ним относятся: 1) Модульная домены, которые богаты длинные полимерные тянется аспарагин (N) и (Q), глютамин 2) Ассамблея в амилоида [китовая птичка+] конформации17,18,19и 3) завершить зависимость disaggregase функции Hsp104 для верных распространения от матери к дочери13,,2021. Действительно, многие bona fide прионы, включая [Гар+], [Het-s] и даже оригинальные китовая птичка (ScPrP), будет не хватать под такие строгие критерии. Возможно более важно, они будут не в состоянии захватить любых новых механизмов на основе белков наследования22. Таким образом истинный биологических ширина таких явлений может быть гораздо более общий характер, чем предполагалось ранее.
Расследовать этот вопрос, было занято высокой пропускной способностью, протеома общесистемной стратегии. Отличительной чертой всех прионы, включая PrPSc, [Гар+], и [Het-s], что переходные гиперэкспрессия причинной белков сильно увеличивает скорость прионных приобретение15,23,24,25,26. Мы воспользовались эта возможность систематически во всем дрожжей ORFeome, спросить, если стабильной основе белка, эпигенетических государств мог бы быть инициирован временно вызывая гиперэкспрессия индивидуальных белков. Это хорошо известно, что гиперэкспрессия белка может изменить фенотипов27. Однако прионных белков являются необычными, потому что их временные перепроизводства производит изменение фенотипа, что наследственные многие сотни поколений после первоначального гиперэкспрессия. Мы ранее принял преимущество этой функции, а также необычные наследования шаблонов на основе белков генетические элементы, чтобы определить десятки белков, которые способны heritably повторной проводки фенотипические пейзажи без изменения генома28. Хотя некоторые выявленные белков ранее были известны как прионы, большинство не было, подчеркнув сила этого подхода для выявления новых форм на основе белков наследования.

<table width="958">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:356px;height:21px;">Guanidine hydrochloride</td>
			<td style="width:299px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">Cat#G3272-25G</td>
			<td style="width:179px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manganese chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat#M8054-100G</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethidium bromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1510</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5-Fluoroorotic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat#F5013-50MG</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BY4741 MATa (his3&#916;1 leu2&#916;0 LYS2 met15&#916;0 ura3&#916;0)</td>
			<td>Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Yeast strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BY4741 MAT&#945; (his3&#916;1 leu2&#916;0 lys2&#916;0 MET15 ura3&#916;0)</td>
			<td>Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Yeast strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hsp70 (K69M)&#160;</td>
			<td>Jarosz et al., 2014b</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FLEXGene library</td>
			<td>Hu et al., 2007</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Plasmid library</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextrose (glucose)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-3</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Raffinose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R0250-25G</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Galactose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP656-500</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CSM</td>
			<td>Sunrise Science</td>
			<td>1001-100</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CSM-URA</td>
			<td>Sunrise Science</td>
			<td>1004-100</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CSM-LYS</td>
			<td>Sunrise Science</td>
			<td>1032-100</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CSM-MET</td>
			<td>Sunrise Science</td>
			<td>1019-100</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CSM-LYS-MET</td>
			<td>Sunrise Science</td>
			<td>1035-100</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">yeast extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">peptone</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>P20240-5000</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">bacto-peptone</td>
			<td>BD</td>
			<td align="right">211677</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glycerol</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>GX0185-2</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">yeast nitrogen base w/o amino acids</td>
			<td>BD</td>
			<td align="right">291920</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">agar</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB49172</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adenine sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3159-25G</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1190-500G</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Uracil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0750-100G</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Histidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8000-100G</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leucine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8000-25G</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5501-25G</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNase I&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EN0601</td>
			<td>Enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">biotinylated DNase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM1906</td>
			<td>Enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">zymolyase 100T (yeast lytic enzyme)</td>
			<td>Sunrise Science</td>
			<td>N0766555</td>
			<td>Enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy H1</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microplate stacker</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BioStack3</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plate filler</td>
			<td>BiotTek</td>
			<td>EL406</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liquid handling robot</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Biomek FX</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput screening for protein-based inheritance in s. cerevisiae

Кодирование биологической информации, доступной для будущих поколений обычно достигается через изменения в последовательности ДНК. Долгоживущих наследования, закодированные в конформации белка (а не последовательность) долго рассматривалась как сдвиг парадигмы, но редко. Лучше всего характеризуется примеры таких эпигеномные элементов являются прионы, которые обладают самостоятельной сборки поведение, которое может управлять наследуемое проявление новых фенотипов. Многие архетипической прионов отображения ярких предвзятости последовательности N/Q-богатые и собрать в амилоида лоно. Эти необычные свойства сообщили большинство скрининг усилия по выявлению новых прионных белков. Однако по крайней мере три известных прионы, (в том числе основателей прионы, ОТРSc) не гавань этих биохимических характеристик. Поэтому мы разработали альтернативный метод прозондирует область на основе белков наследования на основе свойства массовых действий: переходных гиперэкспрессия прионных белков увеличивает частоту, на которой они приобретают конформации self шаблонов. Этот документ описывает метод для анализа дрожжей ORFeome способность добиться на основе белков наследования. Используя эту стратегию, мы ранее обнаружил, что &gt; 1% белков, дрожжи могут топлива появление биологических черт, которые были долгоживущих, стабильной и возникают чаще, чем генетической мутации. Этот подход может быть использован в высокой пропускной способности через весь ORFeomes или как целенаправленного скрининга парадигмы для конкретных генетических сетей или экологических раздражителей. Так же, как вперед генетических экраны определяют многочисленные пути развития и сигнализации, эти методы обеспечивают методологию для исследовать влияние наследования на основе белков в биологических процессах.

Protein overexpression is known to dramatically alter cellular phenotypes27. Indeed, with an initial screening approach, hundreds of new phenotypes were reproducibly recovered from the overexpression of clones from the yeast ORFeome using just ten stressors. However, the assays described above allow for the assessment of whether cells retain any long-term stable phenotypes following this overexpression. One protein capable of encoding such a state is Psp1. Psp1 is ...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae at JoVE.com

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

Этот протокол описывает высок объём методологию функционально экран для наследования на основе белков в S. cerevisiae.

Высокопроизводительного скрининга для наследования на основе белков в S. cerevisiae

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived ...

Research

JoVE Journal

Biology

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Анализ для адгезии и агар Вторжение в CEREVISIAE С.

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

Высокой пропускной метод глобально исследования морфологии органелл в CEREVISIAE С.

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Идентификация белковых комплексов с количественной протеомики в CEREVISIAE С.

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

Высокопроизводительный скрининг и биодатчиков с люминесцентными С. Элеганс Штаммы

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Высокопроизводительного скрининга грибной активность в эндоглюканазы Кишечной палочки</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Проточной цитометрии на основе очистки<em&gt; S. CEREVISIAE</em&gt; Зиготы

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Высокопроизводительного скрининга для малых молекул модуляторы калиевых каналов входящего Rectifier

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

Высокая пропускная Функциональная Скрининг с использованием Домашнее двойного свечения люциферазы

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Высокая пропускная количественном выражении Скрининг и очистка Применительно к рекомбинантный дисульфид-богатые Venom белков, продуцируемых в<em&gt; Е. палочка</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Высокопроизводительный скрининг для химических модуляторов посттранскрипционно регулируемых генов

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...