Name: screening bioactive nanoparticles in phagocytic immune cells for inhibitors of toll-like receptor signaling
Uploaded: 2017-07-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Screening Bioactive Nanoparticles in Phagocytic Immune Cells for Inhibitors of Toll-like Receptor Signaling at JoVE.com

Die Autoren möchten die Unterstützung des Programms für Professor für Sonderveranstaltung (Eastern Scholar) bei Shanghai Institutionen of Higher Learning (HY), dem Startfonds von Shanghai First People&#39;s Hospital (HY), Gaofeng Clinical Medicine Grant Unterstützung von Shanghai Jiaotong anerkennen University School of Medicine (HY), und die Finanzierung von der Crohn und Colitis Foundation of Canada (CCFC) (SET und HY).

1. Herstellung von Zellkulturmedien und Reagenzien <ol><li> Bereiten Sie das gesamte Zellkulturmedium R10 vor, indem Sie die Ergänzungen von 10% fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin und 1 mM Natriumpyruvat in das RPMI-1640-Medium hinzufügen. <ol><li> Bereiten Sie das Selektionskulturmedium R10-Z vor, indem Sie die Antibiotika Zeocin (200 μg / ml) zu R10 addieren, um die Expression von SEAP unter der Kontrolle der NF- &amp; kgr; B / AP-1-Aktivierung aufrechtzuerhalten. Zur Auswahl von Zellen,...

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Da TLRs an der Pathogenese vieler entzündlicher Erkrankungen beteiligt sind, haben sie sich als therapeutische Ziele für die Modulation von Immunantworten und entzündlichen Zuständen entwickelt. Allerdings hat die klinische Entwicklung von Therapeutika, um TLR-Signalwege zu hemmen, bisher nur begrenzten Erfolg. Das Antimalarialmedikament Hydroxychloroquin, das TLR7 und TLR9 hemmt, ist in der klinischen Anwendung 35 , 36 . Ähnlich ist nur eine begrenzte Anza...

Mautartige Rezeptoren (TLRs) sind eines der Schlüsselelemente des angeborenen Immunsystems, das zur ersten Verteidigungslinie gegen Infektionen beiträgt. TLRs sind verantwortlich für die Erfassung von eindringenden Pathogenen durch die Erkennung eines Repertoires von pathogen-assoziierten molekularen Mustern (oder PAMPs) und Montage von Verteidigungsreaktionen durch eine Kaskade der Signaltransduktion 1 , 2 . Es gibt 10 menschliche TLRs identifiziert; Außer TLR10, für die der Ligand (s) unklar bleibt, kann jeder TLR eine deutliche, konservierte Gruppe von PAMPs erkennen. Beispielsweise können TLR2 und TLR4, die sich primär auf der Zelloberfläche befinden, Lipoproteine ​​und Glycolipide aus Gram-positiven und Gram-negativen Bakterien nachweisen; Während TLR3, TLR7 / 8 und TLR9, die hauptsächlich in den endosomalen Kompartimenten vorhanden sind, RNA- und DNA-Produkte aus Viren und Bakterien spüren können 3 . Wenn sie durch PAMPs stimuliert werden, lösen TLRs wesentliche Immunantworten aus, indem sie pro-inf freisetzenLammatorische Mediatoren, Rekrutierung und Aktivierung von Effektor-Immunzellen und koordinieren nachfolgende adaptive Immunereignisse 4 . Die TLR-Signalisierungstransduktion kann einfach in zwei Hauptwege 5 , 6 kategorisiert werden. Einer ist abhängig vom Adapterprotein myeloiden Differenzierungsfaktor 88 (MyD88) - dem MyD88-abhängigen Weg. Alle TLRs mit Ausnahme von TLR3 nutzen diesen Weg zur Aktivierung des Kappa-Light-Ketten-Enhancers von aktivierten B-Zellen (NF- &amp; kgr; B) und Mitogen-assoziierten Proteinkinasen (MAPKs), was zur Expression von proinflammatorischen Mediatoren wie TNF- Α, IL-6 und IL-8. Der zweite Weg nutzt TIR-Domain-haltige Adapter-induzierende Interferon-β (TRIF) - den TRIF-abhängigen oder MyD88-unabhängigen Weg -, um Interferon (IFN) regulatorische Faktoren (IRFs) und NF-κB zu aktivieren, was zur Produktion von führt Typ I IFNs. Intakte TLR-SignalisierungIst entscheidend für unseren täglichen Schutz vor mikrobiellen und viralen Infektionen; Defekte in TLR-Signalwegen können zu Immunschwäche führen und sind oft schädlich für die menschliche Gesundheit. 7 Allerdings ist die TLR-Signalisierung ein &quot;zweischneidiges Schwert&quot; und eine übermäßige, unkontrollierte TLR-Aktivierung ist schädlich. Überaktive TLR-Antworten tragen zur Pathogenese bei vielen akuten und chronischen menschlichen entzündlichen Erkrankungen bei 8 , 9 bei . Zum Beispiel ist die Sepsis, die durch systemische Entzündungen und Multiorganverletzungen gekennzeichnet ist, vor allem auf akute, überwältigende Immunreaktionen auf Infektionen zurückzuführen, wobei TLR2 und TLR4 eine entscheidende Rolle bei der Sepsis-Pathophysiologie spielen 10 , 11 , 12 . Darüber hinaus wurde gefunden, dass TLR5 zur chronischen Lungenentzündung von Patienten mit zystischer Fibrose beiträgt 13, 14 Darüber hinaus ist die dysregulierte endosomale TLR-Signalisierung (zB TLR7 und TLR9) stark mit der Entwicklung und dem Fortschreiten mehrerer Autoimmunerkrankungen verbunden, einschließlich systemischer Lupus erythematodes (SLE) und rheumatoider Arthritis (RA) 15 , 16 . Diese konvergierenden Beweislinien identifizieren die TLR-Signalisierung als potentielles therapeutisches Ziel für viele entzündliche Erkrankungen 17 . Obwohl die pharmakologische Regulation von TLR-Reaktionen in vielen entzündlichen Zuständen vorteilhaft ist, gibt es derzeit nur sehr wenige Verbindungen, die klinisch verfügbar sind, um die TLR-Signalisierung 9 , 17 , 18 zu hemmen. Dies ist teilweise auf die Komplexität und Redundanz der TLR-Wege in der Immun-Homöostase und Krankheit Pathologie beteiligt. Also suche nach neuem, potenT therapeutische Mittel, um mehrere TLR-Signalwege zu erreichen, könnten eine fundamentale Lücke überbrücken und die Herausforderung überwinden, TLR-Inhibitoren in die Klinik voranzutreiben. Angesichts der rasanten Fortschritte in der Nanowissenschaften und der Nanotechnologie tauchen Nanodevices aufgrund ihrer einzigartigen Eigenschaften 19 , 20 , 23 als TLR-Modulatoren der nächsten Generation auf. Die nanoskalige Größe erlaubt diesen Nano-Therapeutika eine bessere Bioverteilung und nachhaltige Zirkulation 24 , 25 , 26 . Sie können weiter funktionalisiert werden, um die gewünschten pharmakodynamischen und pharmakokinetischen Profile 27 , 28 , 29 zu erfüllen. Aufregenderen entsteht die Bioaktivität dieser neuartigen Nanodonen aus ihren intrinsischen Eigenschaften, auf die man sich anpassen lässtSpezifische medizinische Anwendungen, anstatt einfach als Lieferwagen für ein therapeutisches Mittel zu wirken. Zum Beispiel wurde ein hochdichtes Lipoprotein (HDL) -ähnliches Nanopartikel zur Hemmung der TLR4-Signalisierung durch Spülen des TLR4-Liganden LPS 23 entwickelt . Darüber hinaus haben wir ein Peptid-Gold-Nanopartikel-Hybridsystem entwickelt, bei dem die dekorierten Peptide die Oberflächeneigenschaften der Goldnanopartikel verändern und ihnen verschiedene Bioaktivitäten 30 , 31 , 32 , 33 ermöglichen können . Dies macht sie zu einer besonderen Klasse von Medikamenten (oder &quot;Nano-Drogen&quot;) als die nächste Generation Nano-Therapeutika. In diesem Protokoll präsentieren wir einen Ansatz zur Identifizierung einer neuartigen Klasse von Peptid-Gold-Nanopartikel (Peptid-GNP) -Hybriden, die mehrere TLR-Signalwege in phagozytischen Immunzellen 32 , </suP&gt; 33 Der Ansatz basiert auf handelsüblichen THP-1-Reporterzelllinien. Die Reporterzellen bestehen aus zwei stabilen, induzierbaren Reporterkonstrukten: Man trägt ein sekretiertes embryonales alkalisches Phosphatase (SEAP) -Gen unter der Kontrolle eines durch die Transkriptionsfaktoren NF-κB und Aktivatorprotein 1 (AP-1) induzierbaren Promotors; Die andere enthält ein sezerniertes Luciferase-Reporter-Gen unter der Kontrolle von Promotoren, die durch Interferon-regulatorische Faktoren (IRFs) induzierbar sind. Bei der TLR-Stimulation führt die Signaltransduktion zur Aktivierung von NF- &amp; kgr; B / AP-1 und / oder IRFs, die die Reportergene zu geheimem SEAP und / oder Luciferase einschalten; Solche Ereignisse können mit ihren entsprechenden Substratreagenzien mit einem Spektrophotometer oder Luminometer leicht nachgewiesen werden. Mit diesem Ansatz, um unsere bisher etablierte Bibliothek von Peptid-GNP-Hybriden zu screenen, identifizierten wir Lead-Kandidaten, die TLR4-Signalwege stark hemmen können. Die inhibitorische Aktivität der Blei-Peptid-GNP-Hybriden wurden dann mit einem anderen biochemischen Ansatz des Immunoblottings validiert und auf anderen TLR-Wegen bewertet. Dieser Ansatz ermöglicht ein schnelles, effektives Screening von neuartigen Agenten, die auf TLR-Signalwege abzielen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>THP-1-XBlue reporter cell</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>thpx-sp</td>
			<td>keep cell culture passage under 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1-Dual repoter cell</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>thpd-nfis</td>
			<td>keep cell culture passage under 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 (no L-glutamine)</td>
			<td>GE Health Care</td>
			<td>SH30096.02</td>
			<td>Warm up to 37 &#176;C before use; add supplements to make a complete medium R10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (qualified)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12484028</td>
			<td>Heat inactivated; 10% in RPMI-1640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30034.02</td>
			<td>2 mM in the complete medium R10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>1 mM in the complete medium R10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline, 1X, without calcium, magnesium</td>
			<td>GE Health Care</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td>Use for cell washing and reagent preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QUANTI-Blue</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>rep-qb1</td>
			<td>SEAP substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QUANTI-Luc</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>rep-qlc2</td>
			<td>Luciferase substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-zn-1</td>
			<td>Selection antibiotics for reporter cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>anti-bl-1</td>
			<td>Selection antibiotics for reporter cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO) for molecular biology</td>
			<td>Sigmal-Aldrich</td>
			<td>D8418-100ML</td>
			<td>Use for reagent preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) for molecular biology</td>
			<td>Sigmal-Aldrich</td>
			<td>P1585-1MG</td>
			<td>Use for cell differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli K12</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-eklps</td>
			<td>TLR4 ligand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pam3CSK4</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-pms</td>
			<td>TLR2/1 ligand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly (I:C) HMW</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-pic</td>
			<td>TLR3 ligand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flagellin from S. Typhimurium (FLA-ST), ultrapure</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-epstfla</td>
			<td>TLR5 ligand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax Plus 384 microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Read colorimetric assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite M200 Pro multimode microplate reader with injectors</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Read luminiscience</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge 22R centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Temperature controlled micro-centrifugator (up to 18,000 g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra X-15R centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Temperature controlled general purpose centrifugator (for cell culture use)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar assay plate, 96-well white with clear flat bottom, tissue culure treated</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>3903</td>
			<td>Used for luminiscence assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

screening bioactive nanoparticles in phagocytic immune cells for inhibitors of toll-like receptor signaling

Die pharmakologische Regulation von Toll-like Rezeptor (TLR) Reaktionen ist ein großes Versprechen bei der Behandlung von vielen entzündlichen Erkrankungen. Allerdings gab es bisher nur begrenzte Verbindungen, um die TLR-Signalisierung zu dämpfen, und es gab keine klinisch zugelassenen TLR-Inhibitoren (mit Ausnahme des Anti-Malaria-Arzneimittels Hydroxychloroquin) in der klinischen Anwendung. Angesichts der rasanten Fortschritte in der Nanotechnologie kann die Manipulation der Immunantwort unter Verwendung von Nano-Geräten eine neue Strategie zur Behandlung dieser Krankheiten darstellen. Hierin präsentieren wir eine Hochdurchsatz-Screening-Methode zur schnellen Identifizierung von neuartigen bioaktiven Nanopartikeln, die die TLR-Signalisierung in phagozytischen Immunzellen hemmen. Diese Screening-Plattform basiert auf THP-1 zellbasierten Reporterzellen mit Kolorimetrie- und Luciferase-Assays. Die Reporterzellen werden aus der humanen THP-1 monozytischen Zelllinie durch stabile Integration von zwei induzierbaren Reporterkonstrukten konstruiert. Man drückt ein sezerniertes embryonales alkalisches Phosphatase (SEAP) -Gen ausUnter der Kontrolle eines durch die Transkriptionsfaktoren NF- &amp; kgr; B und AP-1 induzierbaren Promotors, und der andere exprimiert ein sezerniertes Luciferase-Reportergen unter der Kontrolle von durch Interferon-regulatorische Faktoren (IRFs) induzierbaren Promotoren. Bei der TLR-Stimulation aktivieren die Reporterzellen Transkriptionsfaktoren und produzieren anschließend SEAP und / oder Luciferase, die mit ihren entsprechenden Substratreagenzien nachgewiesen werden können. Unter Verwendung einer Bibliothek von Peptid-Gold-Nanopartikel (GNP) Hybriden, die in unseren früheren Studien als Beispiel etabliert wurden, identifizierten wir ein Peptid-GNP-Hybrid, das die beiden Arme der TLR4-Signalkaskade, die durch seinen prototypischen Liganden, Lipopolysaccharid (LPS) ausgelöst wurde, wirksam hemmen könnte. Die Ergebnisse wurden durch Standard-biochemische Techniken einschließlich Immunoblotting validiert. Eine weitere Analyse ergab, dass dieser Blei-Hybrid ein breites inhibitorisches Spektrum hatte, das auf mehrere TLR-Wege, einschließlich TLR2, 3, 4 und 5, einwirkt. Dieser experimentelle Ansatz ermöglicht eine rasche Bewertung vonNanopartikel (oder andere therapeutische Verbindungen) können spezifische TLR-Signalisierung in phagozytischen Immunzellen modulieren.

Der gesamte experimentelle Ansatz ist in Abbildung 1 dargestellt . Die beiden THP-1-Reporterzelllinien THP-1-XBlue und THP-1-Dual werden verwendet, um die TLR-Antworten schnell zu screenen, indem sie die Aktivierung von NF-κB / AP-1 bzw. IRFs untersuchen. Die Aktivierung von NF-κB / AP-1 kann durch den SEAP-Kolorimetrie-Assay nachgewiesen werden, während die IRF-Aktivierung durch Luciferase-Lumineszenz überwacht wird. Die monozytischen THP-1-Zellen könn...

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Screening Bioactive Nanoparticles in Phagocytic Immune Cells for Inhibitors of Toll-like Receptor Signaling

Maut-like Rezeptor (TLR) -Signalisierung spielt eine wichtige Rolle bei der Pathophysiologie vieler menschlicher entzündlicher Erkrankungen, und die Regulierung der TLR-Reaktionen durch bioaktive Nanopartikel wird in vielen entzündlichen Zuständen als vorteilhaft angesehen. THP-1 zellbasierte Reporterzellen bieten eine vielseitige und robuste Screening-Plattform zur Identifizierung neuer Inhibitoren der TLR-Signalisierung.

Screening bioaktiver Nanopartikel in phagozytischen Immunzellen für Inhibitoren der Toll-like Receptor Signaling

Pharmacological regulation of Toll-like receptor (TLR) responses holds great promise in the treatment of many inflammatory diseases. However, there have ...

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