Name: screening bioactive nanoparticles in phagocytic immune cells for inhibitors of toll-like receptor signaling
Uploaded: 2017-07-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Screening Bioactive Nanoparticles in Phagocytic Immune Cells for Inhibitors of Toll-like Receptor Signaling at JoVE.com

Gli autori vorrebbero riconoscere il sostegno del Programma per il Professore di Appuntamento Speciale (Scholar Orientale) presso le istituzioni di istruzione superiore di Shanghai (HY), il fondo di partenza del primo ospedale popolare di Shanghai (HY), il supporto per la medicina clinica di Gaofeng da Shanghai Jiaotong Università di medicina (HY), e il finanziamento della Fondazione Crohn e Colitis del Canada (CCFC) (SET e HY).

1. Preparazione dei mezzi di coltura cellulare e dei reagenti <ol><li> Preparare il mezzo completo di coltura cellulare R10 aggiungendo i supplementi del 10% di siero fetale bovino (FBS), 2mM L-glutammina e 1mM di piruvato di sodio nel mezzo RPMI-1640. <ol><li> Preparare il mezzo di coltura di selezione R10-Z aggiungendo gli antibiotici Zeocin (200 μg / mL) a R10 per mantenere l&#39;espressione di SEAP sotto il controllo dell&#39;attivazione NF-κB / AP-1. Per selezionare le cellule che esprimono ent...

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	<li>Akira, S., Takeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+signalling.">Toll-like receptor signalling.</a> Nat Rev Immunol. 4 (7), 499-511 (2004).</li><li>Beutler, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLRs+and+innate+immunity.">TLRs and innate immunity.</a> Blood. 113 (7), 1399-1407 (2009).</li><li>Gay, N. J., Symmons, M. F., Gangloff, M., Bryant, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+localization+of+Toll-like+receptor+signalling+complexes.">Assembly and localization of Toll-like receptor signalling complexes.</a> Nat Rev Immunol. 14 (8), 546-558 (2014).</li><li>Palm, N. 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Dal momento che i TLR sono coinvolti nella patogenesi di molte malattie infiammatorie, sono emerse come obiettivi terapeutici per la modulazione delle risposte immunitarie e delle condizioni infiammatorie. Tuttavia, lo sviluppo clinico delle terapie per inibire i percorsi di segnalazione TLR ha avuto un successo limitato fino ad oggi. L&#39;idrossiclorochina della droga antimalarica che inibisce TLR7 e TLR9 è in uso clinico 35 , 36 . Analogamente, solo un numer...

Ricordi simili (TLR) sono uno degli elementi chiave del sistema immunitario innato che contribuisce alla prima linea di difesa contro le infezioni. I TLR sono responsabili del rilevamento di patogeni invasivi riconoscendo un repertorio di pattern molecolari associati ad agenti patogeni (o PAMP) e reazioni di difesa di montaggio attraverso una cascata di trasduzione del segnale 1 , 2 . Ci sono 10 identificatori TLR umani identificati; Tranne TLR10 per il quale il ligando non è ancora chiaro, ogni TLR può riconoscere un distinto, conservato gruppo di PAMP. Ad esempio, TLR2 e TLR4, localizzati principalmente sulla superficie cellulare, possono rilevare lipoproteine ​​e glicolipidi da batteri Gram-positivi e Gram-negativi rispettivamente; Mentre TLR3, TLR7 / 8 e TLR9, presenti principalmente nei compartimenti endosomali, possono rilevare prodotti RNA e DNA da virus e batteri 3 . Quando stimolato da PAMP, TLR innescano risposte immunitarie essenziali rilasciando pro-infMediatori lammatori, reclutare e attivare le cellule immunitarie effettive e coordinare i successivi eventi immunitari adattativi 4 . La trasduzione di segnalazione TLR può essere semplicemente classificata in due percorsi principali 5 , 6 . Uno dipende dal fattore di differenziazione mieloide della proteina dell&#39;adattatore 88 (MyD88) - il percorso dipendente da MyD88. Tutti i TLR, ad eccezione di TLR3, utilizzano questo percorso per attivare il fattore nucleare kappa-light-chain-enhancer delle cellule B attivate (NF-κB) e mitogen-associate proteine ​​chinasi (MAPK), portando all&#39;espressione di mediatori pro-infiammatori come TNF- Α, IL-6 e IL-8. Il secondo percorso utilizza l&#39;interferone-β (TRIF) che induce l&#39;adattatore che contiene il dominio TIR - il percorso indipendente dal TRIF o MyD88 - per attivare i fattori regolatori interferon (IFN) e NF-κB, con conseguente produzione di Tipo I IFN. Segnalazione TLR intattaÈ fondamentale per la nostra protezione quotidiana dalle infezioni microbiche e virali; I difetti nei percorsi di segnalazione TLR possono portare ad un&#39;immunodeficienza e spesso sono dannosi per la salute umana. 7 Tuttavia, la segnalazione TLR è una &quot;spada a doppio taglio&quot; e un&#39;eccessiva attivazione TLR non controllata è dannosa. Le risposte TLR overattive contribuiscono alla patogenesi in molte malattie infiammatorie acute e croniche 8 , 9 . Per esempio, la sepsi, caratterizzata da infiammazioni sistemiche e da lesioni multi-organi, è dovuta principalmente alle risposte immunitarie acute e superiori alle infezioni, con TLR2 e TLR4 che svolgono un ruolo cruciale nella patofisiologia delle sepsi 10 , 11 , 12 . Inoltre, TLR5 è stato trovato per contribuire all&#39;infiammazione polmonare cronica dei pazienti con fibrosi cistica 13, 14 . Inoltre, la segnalazione TLR endosomale non corretta (es., TLR7 e TLR9) è fortemente associata allo sviluppo e alla progressione di diverse malattie autoimmuni, tra cui il sistema lupus eritematoso (SLE) e l&#39;artrite reumatoide (RA) 15 , 16 . Queste linee di prova convergenti identificano la segnalazione TLR come un potenziale obiettivo terapeutico per molte malattie infiammatorie 17 . Anche se la regolazione farmacologica delle risposte TLR è prevista per essere vantaggiosa in molte condizioni infiammatorie, purtroppo attualmente esistono pochissimi composti clinicamente disponibili per inibire la segnalazione TLR 9 , 17 , 18 . Ciò è dovuto in parte alla complessità e alla ridondanza dei percorsi TLR coinvolti nell&#39;omeostasi immunitaria e nella patologia della malattia. Pertanto, alla ricerca di romanzo, potenGli agenti terapeutici che mirano ad individuare più percorsi di segnalazione TLR potrebbero colmare un divario fondamentale e superare la sfida di avanzare gli inibitori TLR nella clinica. Alla luce dei rapidi progressi della nanoscienza e della nanotecnologia, le nanotecnologie emergono come modulatori TLR di nuova generazione a causa delle loro proprietà uniche 19 , 20 , 23 . La dimensione della nanoscala permette a queste nano-terapeutiche di avere una migliore distribuzione bio e una circolazione sostenibile 24 , 25 , 26 . Possono essere ulteriormente funzionalizzati per soddisfare i profili farmacodinamici e farmacocinetici desiderati 27 , 28 , 29 . Più emozionante, la bio-attività di queste novità nanodispositivi deriva dalle loro proprietà intrinseche, che possono essere personalizzate perSpecifiche applicazioni mediche, piuttosto che semplicemente agire come veicolo di consegna per un agente terapeutico. Ad esempio, una nanoparticella di tipo lipoproteina ad alta densità (HDL) è stata progettata per inibire la segnalazione TLR4 mediante scavenging del TLR4 ligando LPS 23 . Inoltre, abbiamo sviluppato un sistema ibrido a nanoparticelle peptide-oro, in cui i peptidi decorati possono alterare le proprietà superficiali delle nanoparticelle d&#39;oro e consentire loro di avere varie attività bio-attività 30 , 31 , 32 , 33 . Questo li rende una classe speciale di droga (o &quot;nano-droga&quot;) come la nano-terapeutica di nuova generazione. In questo protocollo, presentiamo un approccio per identificare una nuova classe di ibridi peptidi-nanoparticelle (peptide-GNP) che possano inibire potentemente in molti percorsi di segnalazione TLR nelle cellule immunitarie fagocitiche 32 , </suP&gt; 33 . L&#39;approccio si basa sulle linee cellulari reporter THP-1 commercialmente disponibili. Le cellule reporter sono costituite da due costrutti reporter stabili e innescati: uno porta un gene secretato di ematogenica alcalina fosfatasi (SEAP) sotto il controllo di un promotore indottabile dai fattori di trascrizione NF-κB e dalla proteina 1 dell&#39;attivatore (AP-1); L&#39;altro contiene un gene segreto del reporter del luciferasi sotto il controllo di promotori indotti da fattori di regolazione dell&#39;interferone (IRF). Sulla stimolazione TLR, la trasduzione del segnale porta all&#39;attivazione di NF-κB / AP-1 e / o IRFs, che accendono i geni del reporter in segreto SEAP e / o luciferasi; Tali eventi possono essere facilmente rilevati utilizzando i relativi reagenti del substrato con uno spettrofotometro o un luminometro. Utilizzando questo approccio per schermare la nostra biblioteca precedentemente stabilita di ibridi peptidici GNP, abbiamo individuato i candidati di piombo che possono inibire potentemente i percorsi di segnalazione TLR4. L&#39;attività inibitoria del peptide-Ibridi GNP sono stati quindi convalidati utilizzando un altro approccio biochimico di immunoblotting e valutato su altri percorsi TLR. Questo approccio consente una rapida e efficace screening di nuovi agenti che mirano a percorsi di segnalazione TLR.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>THP-1-XBlue reporter cell</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>thpx-sp</td>
			<td>keep cell culture passage under 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1-Dual repoter cell</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>thpd-nfis</td>
			<td>keep cell culture passage under 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 (no L-glutamine)</td>
			<td>GE Health Care</td>
			<td>SH30096.02</td>
			<td>Warm up to 37 &#176;C before use; add supplements to make a complete medium R10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (qualified)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12484028</td>
			<td>Heat inactivated; 10% in RPMI-1640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30034.02</td>
			<td>2 mM in the complete medium R10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>1 mM in the complete medium R10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline, 1X, without calcium, magnesium</td>
			<td>GE Health Care</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td>Use for cell washing and reagent preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QUANTI-Blue</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>rep-qb1</td>
			<td>SEAP substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QUANTI-Luc</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>rep-qlc2</td>
			<td>Luciferase substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-zn-1</td>
			<td>Selection antibiotics for reporter cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>anti-bl-1</td>
			<td>Selection antibiotics for reporter cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO) for molecular biology</td>
			<td>Sigmal-Aldrich</td>
			<td>D8418-100ML</td>
			<td>Use for reagent preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) for molecular biology</td>
			<td>Sigmal-Aldrich</td>
			<td>P1585-1MG</td>
			<td>Use for cell differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli K12</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-eklps</td>
			<td>TLR4 ligand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pam3CSK4</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-pms</td>
			<td>TLR2/1 ligand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly (I:C) HMW</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-pic</td>
			<td>TLR3 ligand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flagellin from S. Typhimurium (FLA-ST), ultrapure</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-epstfla</td>
			<td>TLR5 ligand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax Plus 384 microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Read colorimetric assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite M200 Pro multimode microplate reader with injectors</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Read luminiscience</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge 22R centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Temperature controlled micro-centrifugator (up to 18,000 g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra X-15R centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Temperature controlled general purpose centrifugator (for cell culture use)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar assay plate, 96-well white with clear flat bottom, tissue culure treated</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>3903</td>
			<td>Used for luminiscence assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

screening bioactive nanoparticles in phagocytic immune cells for inhibitors of toll-like receptor signaling

La regolazione farmacologica delle risposte Toll-like (TLR) risponde molto nel trattamento di molte malattie infiammatorie. Tuttavia, sono stati finora disponibili composti limitati per attenuare la segnaletica TLR e non sono stati utilizzati inibitori TLR clinicamente riconosciuti (ad eccezione dell&#39;idrochlorochina anti-malaria droga) nell&#39;uso clinico. Alla luce dei rapidi progressi nella nanotecnologia, la manipolazione della reattività immunitaria utilizzando dispositivi nano può fornire una nuova strategia per trattare queste malattie. In questo esempio, presentiamo un metodo di screening ad alta velocità per identificare rapidamente nuove nanoparticelle bioattive che inibiscono la segnalazione TLR nelle cellule immunitarie fagocitiche. Questa piattaforma di screening è stata costruita su cellule reporter THP-1 con test di colore e luciferasi. Le cellule reporter sono costruite dalla linea cellulare monocitica umana THP-1 mediante l&#39;integrazione stabile di due costruttori reporter indotti. Uno esprime un gene secretato ematico alcalino fosfatasi (SEAP)Sotto il controllo di un promotore indotta dai fattori di trascrizione NF-κB e AP-1 e l&#39;altra esprime un gene reporter del luciferasi secreto sotto il controllo di promotori indotti da fattori di regolazione dell&#39;interferone (IRF). Su stimolazione TLR, le cellule reporter attivano Fattori di trascrizione e successivamente producono SEAP e / o luciferasi, che possono essere rilevati utilizzando i relativi reagenti del substrato. Utilizzando una biblioteca di ibridi peptidi-oro nanoparticelle (GNP) stabiliti nei nostri studi precedenti, abbiamo individuato un ibrido peptidico-GNP che potrebbe inibire efficacemente i due bracci della cascata di segnalazione TLR4 innescata dal suo ligando prototipo, lipopolisaccaride (LPS). I risultati sono stati convalidati da tecniche biochimiche standard incluso l&#39;immunoblotting. Ulteriori analisi hanno stabilito che questo ibrido di piombo ha un ampio spettro inibitore, che agisce su più vie TLR, tra cui TLR2, 3, 4 e 5. Questo approccio sperimentale consente una rapida valutazione del whetheNanoparticle (o altri composti terapeutici) può modulare la segnalazione specifica di TLR nelle cellule immunitarie fagocitiche.

L&#39;approccio sperimentale complessivo è illustrato in Figura 1 . Le due linee di reporter THP-1, THP-1-XBlue e THP-1-Dual, vengono utilizzate per velocizzare le risposte TLR analizzando rispettivamente l&#39;attivazione di NF-κB / AP-1 e IRF. L&#39;attivazione di NF-κB / AP-1 può essere rilevata con il saggio colorimetrico SEAP, mentre l&#39;attivazione di IRF viene monitorata mediante luminescenza di luciferasi. Le cellule THP-1 monocitiche possono e...

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Screening Bioactive Nanoparticles in Phagocytic Immune Cells for Inhibitors of Toll-like Receptor Signaling

La segnalazione di TLR (Toll-like receptor) ha un ruolo importante nella fisiopatologia di molte malattie infiammatorie umane e la regolazione delle risposte TLR mediante nanoparticelle bioattive è prevista per essere vantaggiosa in molte condizioni infiammatorie. Le cellule reporter THP-1 forniscono una piattaforma di screening versatile e robusta per identificare nuovi inibitori della segnalazione TLR.

Screening delle nanoparticelle bioattive in cellule immunitarie fagocitiche per gli inibitori della segnalazione di ricetrasmettitori simili

Pharmacological regulation of Toll-like receptor (TLR) responses holds great promise in the treatment of many inflammatory diseases. However, there have ...

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