Name: screening bioactive nanoparticles in phagocytic immune cells for inhibitors of toll-like receptor signaling
Uploaded: 2017-07-26T14:00:00
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著者は、上海第一人民病院（HY）からの出発基金、上海交通大学からのGaofeng Clinical Medicine Grant支援の上級機関（HY）の特別任命教授（東部奨学生）のためのプログラムからの支援を認めたいと思います（HY）、およびカナダのクローン病および大腸炎財団（CCFC）（SETおよびHY）からの資金提供を受けています。

1.細胞培養培地および試薬の調製<ol><li> RPMI-1640培地に10％ウシ胎児血清（FBS）、2mM L-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウムのサプリメントを加えて完全な細胞培養液R10を調製します。 <ol><li> NF-κB/ AP-1活性化の制御下でSEAPの発現を維持するためにR10に抗生物質Zeocin（200μg/ mL）を添加することにより、選択培地R10-Zを調製する。 SEAPとルシフェラーゼレポーター遺伝子の両方を発現...

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TLRは多くの炎症性疾患の病因に関与しているので、免疫応答および炎症状態の調節のための治療標的として浮上している。しかし、TLRシグナル伝達経路を阻害するための治療薬の臨床開発はこれまで成功していない。 TLR7およびTLR9を阻害する抗マラリア薬のヒドロキシクロロキンは、臨床使用35、36です。同様に、化合物の限られた数は、前臨床試...

Toll様受容体（TLR）は、感染に対する第一の防御線に寄与する先天性免疫系の重要な要素の1つである。 TLRは、病原体関連分子パターン（又はのPAMP）のレパートリーを認識し、シグナル伝達1,2のカスケードを介して防御反応を装着することによって侵入する病原体を検出するための責任があります。 10のヒトTLRが同定されている。リガンドが不明瞭なままであるTLR10を除いて、各TLRはPAMPの明確で保存されたグループを認識することができる。例えば、主に細胞表面上に位置するTLR2およびTLR4は、それぞれ、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌からのリポタンパク質および糖脂質を検出することができる。エンドソームコンパートメントに主に存在するTLR3、TLR7 / 8およびTLR9は、ウイルスおよび細菌由来のRNAおよびDNA産物を検出することができる3 。 PAMPによって刺激されると、TLRはpro-infを放出することによって必須の免疫応答を引き起こす炎症メディエーター、エフェクター免疫細胞の動員および活性化、およびその後の適応免疫イベントの調整4 。 TLRシグナル伝達は、単純に二つの主要な経路5,6に分類することができます。 1つは、アダプタータンパク質骨髄分化因子88（MyD88） - MyD88依存性経路に依存する。 TLR3を除くすべてのTLRは、この経路を利用して、活性化B細胞（NF-κB）およびマイトジェン関連プロテインキナーゼ（MAPK）の核因子κ軽鎖エンハンサーを活性化し、TNF- α、IL-6およびIL-8が含まれる。第2の経路は、インターフェロン（IFN）調節因子（IRF）およびNF-κBを活性化するTIRドメイン含有アダプター誘導性インターフェロン-β（TRIF）（TRIF依存性経路またはMyD88非依存性経路）を利用し、 I型IFNである。損なわれていないTLRシグナル伝達微生物およびウイルス感染からの私たちの毎日の防御にとって重要です。 TLRシグナル伝達経路の欠損は免疫不全を引き起こし、しばしばヒトの健康に有害である。 7 しかし、TLRシグナル伝達は「両刃の剣」であり、過度の制御されていないTLR活性化は有害である。過活動TLR応答は、多くの急性および慢性ヒトの炎症性疾患における病因8、9に貢献しています。全身性炎症および多臓器損傷によって特徴付けられる例えば、敗血症のために、TLR2およびTLR4は、敗血症の病態生理10、11、12で重要な役割を果たしていると、感染症に向けて急性、圧倒的な免疫応答の主な原因です。さらに、TLR5は、嚢胞性線維症の患者の慢性肺炎症に寄与することが分かっている13、 14 。また、異常調節エンドソームTLRシグナル（例えば、TLR7およびTLR9）が強く、全身性エリテマトーデス（SLE）及び関節リウマチ（RA）15、16を含むいくつかの自己免疫疾患の発症および進行に関連しています。これらの収束している証拠は、TLRシグナル伝達が多くの炎症性疾患の潜在的治療標的であることを示している17 。 TLR応答の薬理学的調節は、多くの炎症状態において有益であると予想されるが、残念ながら、現在TLR 9、17、18シグナル伝達を阻害するために臨床的に利用可能な非常に少ない化合物です。これは、免疫恒常性および疾患の病理に関与するTLR経路の複雑さおよび重複に一部原因がある。したがって、新しい、potenを探して複数のTLRシグナル伝達経路を標的とする治療剤は、基本的なギャップを埋めることができ、TLR阻害剤を臨床病院に進めるという課題を克服することができる。 ナノサイエンスおよびナノテクノロジーの急速な進歩に照らして、ナノデバイスは、それらのユニークな特性19、20、23のために次世代のTLRモジュレーターとして浮上しています。ナノスケールの大きさは、これらのナノ治療は、より良い生体分布および持続循環24、25、26を有することを可能にします。彼らはさらに、所望の薬力学を満たすために官能化することができると薬物動態は27、28、29プロファイル 。より興味深いことに、これらの新規なナノデバイスの生物活性は、それらの固有の特性から生じ、これは単に治療剤の送達媒体として作用するのではなく、特定の医療用途に使用することができる。例えば、ナノ粒子様高密度リポタンパク質（HDL）は、TLR4リガンドLPS 23を捕捉することによりTLR4シグナル伝達を阻害するように設計されました。加えて、我々は、装飾されたペプチドが金ナノ粒子の表面特性を変化させ、そしてそれらは、様々な生体活動30、31、32、33を有することを可能にすることができるペプチド、金ナノ粒子ハイブリッドシステムを開発しました。これにより、次世代のナノ治療薬としての特殊なクラスの薬物（または「ナノ薬物」）となります。 このプロトコールでは、貪食免疫細胞32中の複数のTLRシグナル伝達経路を強力に阻害することができるペプチド - 金ナノ粒子（ペプチド - GNP）ハイブリッドの新規なクラスを同定するためのアプローチを提示する32 。 </sup&gt; 33 。このアプローチは、市販のTHP-1レポーター細胞系に基づいている。レポーター細胞は、2つの安定した誘導性レポーター構築物からなる：転写因子NF-κBおよびアクチベータータンパク質1（AP-1）によって誘導されるプロモーターの制御下に分泌胚性アルカリホスファターゼ（SEAP）遺伝子を保持する。他方は、インターフェロン調節因子（IRF）によって誘導可能なプロモーターの制御下に分泌型ルシフェラーゼレポーター遺伝子を含む。 TLR刺激に際して、シグナル伝達はNF-κB/ AP-1および/またはIRFの活性化をもたらし、レポーター遺伝子をSEAPおよび/またはルシフェラーゼを秘密にする。そのような事象は、それらの対応する基質試薬を分光光度計または照度計で容易に検出することができる。以前に確立されたペプチドGNPハイブリッドのライブラリーをスクリーニングするこのアプローチを用いて、我々はTLR4シグナル伝達経路を強力に阻害し得る鉛候補を同定した。リードペプチド含有ペプチドの阻害活性は、次いでGNPハイブリッドをイムノブロッティングの別の生化学的手法を用いて検証し、他のTLR経路で評価した。このアプローチは、TLRシグナル伝達経路を標的とする新規薬剤の迅速で効果的なスクリーニングを可能にする。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>THP-1-XBlue reporter cell</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>thpx-sp</td>
			<td>keep cell culture passage under 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1-Dual repoter cell</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>thpd-nfis</td>
			<td>keep cell culture passage under 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 (no L-glutamine)</td>
			<td>GE Health Care</td>
			<td>SH30096.02</td>
			<td>Warm up to 37 &#176;C before use; add supplements to make a complete medium R10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (qualified)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12484028</td>
			<td>Heat inactivated; 10% in RPMI-1640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30034.02</td>
			<td>2 mM in the complete medium R10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>1 mM in the complete medium R10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline, 1X, without calcium, magnesium</td>
			<td>GE Health Care</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td>Use for cell washing and reagent preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QUANTI-Blue</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>rep-qb1</td>
			<td>SEAP substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QUANTI-Luc</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>rep-qlc2</td>
			<td>Luciferase substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-zn-1</td>
			<td>Selection antibiotics for reporter cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>anti-bl-1</td>
			<td>Selection antibiotics for reporter cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO) for molecular biology</td>
			<td>Sigmal-Aldrich</td>
			<td>D8418-100ML</td>
			<td>Use for reagent preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) for molecular biology</td>
			<td>Sigmal-Aldrich</td>
			<td>P1585-1MG</td>
			<td>Use for cell differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli K12</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-eklps</td>
			<td>TLR4 ligand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pam3CSK4</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-pms</td>
			<td>TLR2/1 ligand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly (I:C) HMW</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-pic</td>
			<td>TLR3 ligand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flagellin from S. Typhimurium (FLA-ST), ultrapure</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-epstfla</td>
			<td>TLR5 ligand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax Plus 384 microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Read colorimetric assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite M200 Pro multimode microplate reader with injectors</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Read luminiscience</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge 22R centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Temperature controlled micro-centrifugator (up to 18,000 g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra X-15R centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Temperature controlled general purpose centrifugator (for cell culture use)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar assay plate, 96-well white with clear flat bottom, tissue culure treated</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>3903</td>
			<td>Used for luminiscence assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

screening bioactive nanoparticles in phagocytic immune cells for inhibitors of toll-like receptor signaling

Toll様受容体（TLR）応答の薬理学的調節は、多くの炎症性疾患の治療において非常に有望である。しかし、これまでTLRシグナル伝達を弱めるために利用可能な化合物は限られており、臨床的に承認されたTLR阻害剤（抗マラリア薬ヒドロキシクロロキンを除く）は臨床的に使用されていない。ナノテクノロジーの急速な進歩に照らして、ナノデバイスを用いた免疫応答性の操作は、これらの疾患を治療するための新しい戦略を提供する可能性がある。本明細書では、貪食免疫細胞におけるTLRシグナル伝達を阻害する新規な生物活性ナノ粒子を迅速に同定するためのハイスループットスクリーニング法を提示する。このスクリーニングプラットフォームは、比色アッセイおよびルシフェラーゼアッセイを用いてTHP-1細胞ベースのレポーター細胞上に構築される。レポーター細胞は、2つの誘導性レポーター構築物の安定した組込みによって、ヒトTHP-1単球細胞株から操作される。 1つは、分泌された胚性アルカリホスファターゼ（SEAP）遺伝子を発現する転写因子NF-κBおよびAP-1によって誘導可能なプロモーターの制御下にあり、他方はインターフェロン調節因子（IRF）によって誘導可能なプロモーターの制御下で分泌型ルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する。TLR刺激に応答して、対応する基質試薬を用いて検出することができるSEAPおよび/またはルシフェラーゼを産生する。我々の以前の研究で確立されたペプチド - 金ナノ粒子（GNP）ハイブリッドのライブラリーを例として、プロトタイプのリガンドであるリポ多糖（LPS）によって引き起こされるTLR4シグナル伝達カスケードの2つのアームを効果的に阻害することができる1つのペプチド-NDPハイブリッドを同定した。この発見は、イムノブロッティングを含む標準的な生化学技術によって検証された。更なる分析により、この鉛ハイブリッドは、TLR2,3,4,5を含む複数のTLR経路に作用する広い阻害スペクトルを有することが確立された。この実験的アプローチにより、raナノ粒子（または他の治療化合物）は、貪食免疫細胞における特異的TLRシグナル伝達を調節することができる。

全体的な実験手法を図1に示します 。 2つのTHP-1レポーター細胞株、THP-1-XBlueおよびTHP-1-Dualを用いて、NF-κB/ AP-1およびIRFの活性化をそれぞれプロービングすることにより、TLR応答を迅速にスクリーニングする。 NF-κB/ AP-1の活性化は、SEAP比色アッセイによって検出することができるが、IRF活性化は、ルシフェラーゼルミネセ?...

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Screening Bioactive Nanoparticles in Phagocytic Immune Cells for Inhibitors of Toll-like Receptor Signaling

Toll様受容体（TLR）シグナル伝達は、多くのヒト炎症性疾患の病態生理学において重要な役割を果たし、生物活性ナノ粒子によるTLR応答の調節は、多くの炎症状態において有益であると予想される。 THP-1細胞ベースのレポーター細胞は、TLRシグナル伝達の新規インヒビターを同定するための多目的で堅牢なスクリーニングプラットフォームを提供する。

トール様受容体シグナル伝達の阻害剤に対する食作用性免疫細胞における生物活性ナノ粒子のスクリーニング

Pharmacological regulation of Toll-like receptor (TLR) responses holds great promise in the treatment of many inflammatory diseases. However, there have ...

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Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

急性白血病の治療のためのチロシンキナーゼ阻害剤の前臨床評価

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High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

ハイスループットフローサイトメトリー細胞ベースのアッセイN-メチル-D-アスパラギン酸受容体またはヒト血清中のドーパ​​ミン-2受容体に対する抗体を検出する

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

乳癌細胞におけるエストロゲン調節マイクロRNAのプロファイリング

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Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation ...