Name: screening bioactive nanoparticles in phagocytic immune cells for inhibitors of toll-like receptor signaling
Uploaded: 2017-07-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Screening Bioactive Nanoparticles in Phagocytic Immune Cells for Inhibitors of Toll-like Receptor Signaling at JoVE.com

Forfatterne vil gjerne anerkjenne støtten fra programmet for professor i spesialavtale (Eastern Scholar) ved Shanghai Institutions of Higher Learning (HY), startfondet fra Shanghai First People&#39;s Hospital (HY), Gaofeng Clinical Medicine Grant-støtte fra Shanghai Jiaotong University School of Medicine (HY), og finansieringen fra Crohns og Colitis Foundation of Canada (CCFC) (SET og HY).

1. Fremstilling av cellekulturmedier og reagenser <ol><li> Forbered det komplette cellekulturmediet R10 ved å tilsette kosttilskuddene av 10% føtalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin og 1 mM natriumpyruvat i RPMI-1640-mediumet. <ol><li> Forbered utvalgskulturmediet R10-Z ved å tilsette antibiotika Zeocin (200 μg / ml) til R10 for å opprettholde ekspresjonen av SEAP under kontroll av NF-KB / AP-1-aktivering. For å velge for celler som uttrykker både SEAP- og luciferase-reportergener, tilsett b...

<ol>
	<li>Akira, S., Takeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+signalling.">Toll-like receptor signalling.</a> Nat Rev Immunol. 4 (7), 499-511 (2004).</li><li>Beutler, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLRs+and+innate+immunity.">TLRs and innate immunity.</a> Blood. 113 (7), 1399-1407 (2009).</li><li>Gay, N. J., Symmons, M. F., Gangloff, M., Bryant, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+localization+of+Toll-like+receptor+signalling+complexes.">Assembly and localization of Toll-like receptor signalling complexes.</a> Nat Rev Immunol. 14 (8), 546-558 (2014).</li><li>Palm, N. W., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+recognition+receptors+and+control+of+adaptive+immunity.">Pattern recognition receptors and control of adaptive immunity.</a> Immunol Rev. 227 (1), 221-233 (2009).</li><li>Kawasaki, T., Kawai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+signaling+pathways.">Toll-like receptor signaling pathways.</a> Front Immunol. 5, 461 (2014).</li><li>Uematsu, S., Akira, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptors+and+Type+I+interferons.">Toll-like receptors and Type I interferons.</a> J Biol Chem. 282 (21), 15319-15323 (2007).</li><li>Maglione, P. J., Simchoni, N., Cunningham-Rundles, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+signaling+in+primary+immune+deficiencies.">Toll-like receptor signaling in primary immune deficiencies.</a> Ann N Y Acad Sci. 1356, 1-21 (2015).</li><li>Drexler, S. K., Foxwell, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+toll-like+receptors+in+chronic+inflammation.">The role of toll-like receptors in chronic inflammation.</a> Int J Biochem Cell Biol. 42 (4), 506-518 (2010).</li><li>O'Neill, L. A., Bryant, C. E., Doyle, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+targeting+of+Toll-like+receptors+for+infectious+and+inflammatory+diseases+and+cancer.">Therapeutic targeting of Toll-like receptors for infectious and inflammatory diseases and cancer.</a> Pharmacol Rev. 61 (2), 177-197 (2009).</li><li>Harter, L., Mica, L., Stocker, R., Trentz, O., Keel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+toll-like+receptor-2+and+-4+on+leukocytes+from+patients+with+sepsis.">Increased expression of toll-like receptor-2 and -4 on leukocytes from patients with sepsis.</a> Shock. 22 (5), 403-409 (2004).</li><li>Roger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+from+lethal+gram-negative+bacterial+sepsis+by+targeting+Toll-like+receptor+4.">Protection from lethal gram-negative bacterial sepsis by targeting Toll-like receptor 4.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (7), 2348-2352 (2009).</li><li>Tsujimoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Toll-like+receptors+in+the+development+of+sepsis.">Role of Toll-like receptors in the development of sepsis.</a> Shock. 29 (3), 315-321 (2008).</li><li>Blohmke, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR5+as+an+anti-inflammatory+target+and+modifier+gene+in+cystic+fibrosis.">TLR5 as an anti-inflammatory target and modifier gene in cystic fibrosis.</a> J Immunol. 185 (12), 7731-7738 (2010).</li><li>Hartl, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immunity+in+cystic+fibrosis+lung+disease.">Innate immunity in cystic fibrosis lung disease.</a> J Cyst Fibros. 11 (5), 363-382 (2012).</li><li>Celhar, T., Fairhurst, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptors+in+systemic+lupus+erythematosus:+potential+for+personalized+treatment.">Toll-like receptors in systemic lupus erythematosus: potential for personalized treatment.</a> Front Pharmacol. 5, 265 (2014).</li><li>Chen, J. Q., Szodoray, P., Zeher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-Like+Receptor+Pathways+in+Autoimmune+Diseases.">Toll-Like Receptor Pathways in Autoimmune Diseases.</a> Clin Rev Allergy Immunol. 50 (1), 1-17 (2016).</li><li>Hennessy, E. J., Parker, A. E., O'Neill, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Toll-like+receptors:+emerging+therapeutics.">Targeting Toll-like receptors: emerging therapeutics.</a> Nat Rev Drug Discov. 9 (4), 293-307 (2010).</li><li>Hedayat, M., Netea, M. G., Rezaei, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+Toll-like+receptors:+a+decade+of+progress+in+combating+infectious+diseases.">Targeting of Toll-like receptors: a decade of progress in combating infectious diseases.</a> Lancet Infect Dis. 11 (9), 702-712 (2011).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+DNA+nanoparticles+as+immunomodulatory+reagents+that+activate+regulatory+T+cells.">Engineering DNA nanoparticles as immunomodulatory reagents that activate regulatory T cells.</a> J Immunol. 188 (10), 4913-4920 (2012).</li><li>Lemos, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+STING+adaptor+attenuates+experimental+autoimmune+encephalitis.">Activation of the STING adaptor attenuates experimental autoimmune encephalitis.</a> J Immunol. 192 (12), 5571-5578 (2014).</li><li>Hess, K. L., Andorko, J. I., Tostanoski, L. H., Jewell, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyplexes+assembled+from+self-peptides+and+regulatory+nucleic+acids+blunt+toll-like+receptor+signaling+to+combat+autoimmunity.">Polyplexes assembled from self-peptides and regulatory nucleic acids blunt toll-like receptor signaling to combat autoimmunity.</a> Biomaterials. 118, 51-62 (2017).</li><li>Tostanoski, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+Polyelectrolyte+Multilayers+to+Promote+Immunological+Tolerance.">Design of Polyelectrolyte Multilayers to Promote Immunological Tolerance.</a> ACS Nano. , (2016).</li><li>Foit, L., Thaxton, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+high-density+lipoprotein-like+nanoparticles+potently+inhibit+cell+signaling+and+production+of+inflammatory+mediators+induced+by+lipopolysaccharide+binding+Toll-like+receptor+4.">Synthetic high-density lipoprotein-like nanoparticles potently inhibit cell signaling and production of inflammatory mediators induced by lipopolysaccharide binding Toll-like receptor 4.</a> Biomaterials. 100, 67-75 (2016).</li><li>He, C., Hu, Y., Yin, L., Tang, C., Yin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+particle+size+and+surface+charge+on+cellular+uptake+and+biodistribution+of+polymeric+nanoparticles.">Effects of particle size and surface charge on cellular uptake and biodistribution of polymeric nanoparticles.</a> Biomaterials. 31 (13), 3657-3666 (2010).</li><li>Hirn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+size-dependent+and+surface+charge-dependent+biodistribution+of+gold+nanoparticles+after+intravenous+administration.">Particle size-dependent and surface charge-dependent biodistribution of gold nanoparticles after intravenous administration.</a> Eur J Pharm Biopharm. 77 (3), 407-416 (2011).</li><li>Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+nanoparticle+design+for+overcoming+biological+barriers+to+drug+delivery.">Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery.</a> Nat Biotechnol. 33 (9), 941-951 (2015).</li><li>Arvizo, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+pharmacokinetics,+tumor+uptake+and+biodistribution+by+engineered+nanoparticles.">Modulating pharmacokinetics, tumor uptake and biodistribution by engineered nanoparticles.</a> PLoS One. 6 (9), e24374 (2011).</li><li>Ernsting, M. J., Murakami, M., Roy, A., Li, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+controlling+the+pharmacokinetics,+biodistribution+and+intratumoral+penetration+of+nanoparticles.">Factors controlling the pharmacokinetics, biodistribution and intratumoral penetration of nanoparticles.</a> J Control Release. 172 (3), 782-794 (2013).</li><li>Lin, P. J., Tam, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+the+pharmacokinetic/pharmacodynamic+properties+of+therapeutic+nucleotides+using+lipid+nanoparticle+systems.">Enhancing the pharmacokinetic/pharmacodynamic properties of therapeutic nucleotides using lipid nanoparticle systems.</a> Future Med Chem. 7 (13), 1751-1769 (2015).</li><li>Yang, H., Fung, S. Y., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programming+the+cellular+uptake+of+physiologically+stable+peptide-gold+nanoparticle+hybrids+with+single+amino+acids.">Programming the cellular uptake of physiologically stable peptide-gold nanoparticle hybrids with single amino acids.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 50 (41), 9643-9646 (2011).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+Acid+Structure+Determines+the+Immune+Responses+Generated+by+Peptide-Gold+Nanoparticle+Hybrids.">Amino Acid Structure Determines the Immune Responses Generated by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids.</a> Particle &amp; Particle Systems Characterization. 30 (12), 1039-1043 (2013).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+Acid-Dependent+Attenuation+of+Toll-like+Receptor+Signaling+by+Peptide-Gold+Nanoparticle+Hybrids.">Amino Acid-Dependent Attenuation of Toll-like Receptor Signaling by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids.</a> ACS Nano. 9 (7), 6774-6784 (2015).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+pH+modulation+by+peptide-gold+nanoparticle+hybrids+enables+potent+anti-inflammatory+activity+in+phagocytic+immune+cells.">Endosomal pH modulation by peptide-gold nanoparticle hybrids enables potent anti-inflammatory activity in phagocytic immune cells.</a> Biomaterials. 111, 90-102 (2016).</li><li>Ospelt, C., Gay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLRs+and+chronic+inflammation.">TLRs and chronic inflammation.</a> Int J Biochem Cell Biol. 42 (4), 495-505 (2010).</li><li>Kuznik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+endosomal+TLR+inhibition+by+antimalarial+drugs+and+imidazoquinolines.">Mechanism of endosomal TLR inhibition by antimalarial drugs and imidazoquinolines.</a> J Immunol. 186 (8), 4794-4804 (2011).</li><li>Lee, S. J., Silverman, E., Bargman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+antimalarial+agents+in+the+treatment+of+SLE+and+lupus+nephritis.">The role of antimalarial agents in the treatment of SLE and lupus nephritis.</a> Nat Rev Nephrol. 7 (12), 718-729 (2011).</li><li>Mullarkey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+endotoxin+response+by+e5564,+a+novel+Toll-like+receptor+4-directed+endotoxin+antagonist.">Inhibition of endotoxin response by e5564, a novel Toll-like receptor 4-directed endotoxin antagonist.</a> J Pharmacol Exp Ther. 304 (3), 1093-1102 (2003).</li><li>Barochia, A., Solomon, S., Cui, X., Natanson, C., Eichacker, P. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eritoran+tetrasodium+(E5564)+treatment+for+sepsis:+review+of+preclinical+and+clinical+studies.">Eritoran tetrasodium (E5564) treatment for sepsis: review of preclinical and clinical studies.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 7 (4), 479-494 (2011).</li><li>Rossignol, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety,+pharmacokinetics,+pharmacodynamics,+and+plasma+lipoprotein+distribution+of+eritoran+(E5564)+during+continuous+intravenous+infusion+into+healthy+volunteers.">Safety, pharmacokinetics, pharmacodynamics, and plasma lipoprotein distribution of eritoran (E5564) during continuous intravenous infusion into healthy volunteers.</a> Antimicrob Agents Chemother. 48 (9), 3233-3240 (2004).</li><li>Rossignol, D. P., Wong, N., Noveck, R., Lynn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+pharmacodynamic+activity+of+eritoran+tetrasodium,+a+TLR4+antagonist,+during+intermittent+intravenous+infusion+into+normal+volunteers.">Continuous pharmacodynamic activity of eritoran tetrasodium, a TLR4 antagonist, during intermittent intravenous infusion into normal volunteers.</a> Innate Immun. 14 (6), 383-394 (2008).</li><li>Tidswell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+2+trial+of+eritoran+tetrasodium+(E5564),+a+toll-like+receptor+4+antagonist,+in+patients+with+severe+sepsis.">Phase 2 trial of eritoran tetrasodium (E5564), a toll-like receptor 4 antagonist, in patients with severe sepsis.</a> Crit Care Med. 38 (1), 72-83 (2010).</li><li>Opal, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+eritoran,+an+antagonist+of+MD2-TLR4,+on+mortality+in+patients+with+severe+sepsis:+the+ACCESS+randomized+trial.">Effect of eritoran, an antagonist of MD2-TLR4, on mortality in patients with severe sepsis: the ACCESS randomized trial.</a> JAMA. 309 (11), 1154-1162 (2013).</li><li>Fung, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+screening+of+marine+sponge+extracts+for+anti-inflammatory+agents+combined+with+chemical+genomics+identifies+girolline+as+an+inhibitor+of+protein+synthesis.">Unbiased screening of marine sponge extracts for anti-inflammatory agents combined with chemical genomics identifies girolline as an inhibitor of protein synthesis.</a> ACS Chem Biol. 9 (1), 247-257 (2014).</li></ol>

Siden TLR er involvert i patogenesen av mange inflammatoriske sykdommer, har de oppstått som terapeutiske mål for modulering av immunresponser og inflammatoriske tilstander. Den kliniske utviklingen av terapeutiske midler for å hemme TLR-signalveier har imidlertid hatt begrenset suksess til dags dato. Det antimalariale legemiddelhydroksyklorokinet som hemmer TLR7 og TLR9 er i klinisk bruk 35 , 36 . Tilsvarende har bare et begrenset antall forbindelser utvikle...

Toll-lignende reseptorer (TLRs) er en av hovedelementene i det medfødte immunsystemet som bidrar til den første forsvarslinjen mot infeksjoner. TLR er ansvarlige for å sensere invaderende patogener ved å gjenkjenne et repertoar av patogenassosierte molekylære mønstre (eller PAMPs) og montering av forsvarsreaksjoner gjennom en kaskade av signaltransduksjon 1 , 2 . Det er 10 menneskelige TLR identifisert; Unntatt TLR10 som ligandene forblir uklare, kan hver TLR gjenkjenne en distinkt, konservert gruppe PAMPs. For eksempel kan TLR2 og TLR4, primært lokalisert på celleoverflaten, detektere lipoproteiner og glykolipider fra Gram-positive og Gram-negative bakterier, henholdsvis; Mens TLR3, TLR7 / 8 og TLR9, hovedsakelig tilstede i endosomale rom, kan registrere RNA og DNA-produkter fra virus og bakterier 3 . Når stimulert av PAMP, utløser TLRs viktige immunrespons ved å slippe pro-infLammatoriske mediatorer, rekruttering og aktivering av effektorimmunceller, og koordinering av påfølgende adaptive immunforsvar 4 . TLR-signaltransduksjonen kan enkelt kategoriseres i to hovedbaner 5 , 6 . Den ene er avhengig av adapter-myeloiddifferensieringsfaktoren 88 (MyD88) - den MyD88-avhengige banen. Alle TLR-er unntatt TLR3 benytter denne banen for å aktivere kappa-lette kjedeforsterker med kaktaktor av aktiverte B-celler (NF-KB) og mitogen-assosierte proteinkinaser (MAPKs), som fører til ekspresjon av proinflammatoriske mediatorer som TNF- A, IL-6 og IL-8. Den andre stien bruker TIR-domene-inneholdende adapter-inducerende interferon-β (TRIF) - TRIF-avhengig eller MyD88-uavhengig sti - for å aktivere interferon (IFN) regulatoriske faktorer (IRFs) og NF-KB, noe som resulterer i produksjon av Type I IFNer. Intact TLR-signaleringEr avgjørende for vår daglige beskyttelse mot mikrobielle og virusinfeksjoner; Mangler i TLR-signalveier kan føre til immunsvikt og er ofte skadelig for menneskers helse. 7 Imidlertid er TLR-signalering et &quot;dobbeltkantet sverd&quot; og overdreven, ukontrollert TLR-aktivering er skadelig. Overaktive TLR-responser bidrar til patogenesen i mange akutte og kroniske humane inflammatoriske sykdommer 8 , 9 . For eksempel er sepsis som er preget av systemisk betennelse og multiorgan skade, hovedsakelig på grunn av akutte, overveldende immunresponser mot infeksjoner, med TLR2 og TLR4 som spiller en avgjørende rolle i sepsispatofysiologien 10 , 11 , 12 . I tillegg har TLR5 vist seg å bidra til kronisk lungebetennelse hos pasienter med cystisk fibrose 13, 14 . Videre er dysregulert endosomal TLR-signalering (f.eks. TLR7 og TLR9) sterkt forbundet med utvikling og progresjon av flere autoimmune sykdommer, inkludert systemisk lupus erythematosus (SLE) og reumatoid artritt (RA) 15 , 16 . Disse konvergerende bevislinjene identifiserer TLR-signalering som et potensielt terapeutisk mål for mange inflammatoriske sykdommer 17 . Selv om farmakologisk regulering av TLR-responser forventes å være gunstig i mange inflammatoriske tilstander, er det dessverre for øyeblikket svært få forbindelser klinisk tilgjengelige for å hemme TLR-signalering 9 , 17 , 18 . Dette skyldes delvis kompleksiteten og redundansen av TLR-banene involvert i immune homeostasis og sykdomspatologi. Derfor søker etter roman, potenT terapeutiske midler for å målrette flere TLR signalveier kunne bygge bro over et grunnleggende gap, og overvinne utfordringen med å fremme TLR-hemmere inn i klinikken. I lys av de raske fremskrittene innen nanovitenskap og nanoteknologi, utvikler nanodevices som neste generasjons TLR modulatorer på grunn av deres unike egenskaper 19 , 20 , 23 . Nanoskala-størrelsen gjør at disse nano-terapeutika har bedre biodistribusjon og vedvarende sirkulasjon 24 , 25 , 26 . De kan funksjonaliseres ytterligere for å tilfredsstille de ønskede farmakodynamiske og farmakokinetiske profiler 27 , 28 , 29 . Mer spennende, oppstår bioaktiviteten til disse nye nanoteknikkene fra deres inneboende egenskaper, som kan skreddersys forSpesifikke medisinske applikasjoner, i stedet for bare å virke som et transportmiddel for et terapeutisk middel. For eksempel ble en HDD-lignende nanopartikkel med høy tetthet utformet for å hemme TLR4-signalering ved å fjerne TLR4-liganden LPS 23 . I tillegg har vi utviklet et peptid-gull nanopartikkel-hybridsystem, der de dekorerte peptidene kan endre overflateegenskapene til gullnanopartiklene, og tillate dem å ha ulike bioaktiviteter 30 , 31 , 32 , 33 . Dette gjør dem til en spesiell klasse av narkotika (eller &quot;nanoteknologi&quot;) som neste generasjons nano-terapeutikk. I denne protokollen presenterer vi en tilnærming til å identifisere en ny klasse av peptid-gull nanopartikler (peptid-GNP) hybrider som potensielt kan hemme flere TLR signalveier i fagocytiske immunceller 32 , </suP&gt; 33 . Tilnærmingen er basert på kommersielt tilgjengelige THP-1 reportercellelinjer. Reportercellene består av to stabile, inducerbare reporterkonstruksjoner: en bærer et sekretert embryonalt alkalisk fosfatase-gen (SEAP) under kontroll av en promotor som er inducerbar ved transkripsjonsfaktorene NF-KB og aktivatorprotein 1 (AP-1); Den andre inneholder et utskilt luciferase-reportergen under kontroll av promotorer som er inducerbare av interferon regulatoriske faktorer (IRFs). Ved TLR-stimulering fører signaltransduksjonen til aktiveringen av NF-KB / AP-1 og / eller IRFer, som slår på reportergenene til hemmelig SEAP og / eller luciferase; Slike hendelser kan lett oppdages ved hjelp av deres tilsvarende substratreagenser med et spektrofotometer eller luminometer. Ved å bruke denne tilnærmingen til å skjerme vårt tidligere etablerte bibliotek av peptid-GNP-hybrider, identifiserte vi blykandidater som potensielt kan hemme TLR4-signalveier. Den hemmende aktivitet av blypeptid-BNP-hybrider ble deretter validert ved hjelp av en annen biokjemisk tilnærming til immunoblotting, og evaluert på andre TLR-veier. Denne tilnærmingen tillater rask og effektiv screening av nye agenter som retter seg mot TLR-signalveier.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>THP-1-XBlue reporter cell</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>thpx-sp</td>
			<td>keep cell culture passage under 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1-Dual repoter cell</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>thpd-nfis</td>
			<td>keep cell culture passage under 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 (no L-glutamine)</td>
			<td>GE Health Care</td>
			<td>SH30096.02</td>
			<td>Warm up to 37 &#176;C before use; add supplements to make a complete medium R10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (qualified)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12484028</td>
			<td>Heat inactivated; 10% in RPMI-1640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30034.02</td>
			<td>2 mM in the complete medium R10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>1 mM in the complete medium R10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline, 1X, without calcium, magnesium</td>
			<td>GE Health Care</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td>Use for cell washing and reagent preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QUANTI-Blue</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>rep-qb1</td>
			<td>SEAP substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QUANTI-Luc</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>rep-qlc2</td>
			<td>Luciferase substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-zn-1</td>
			<td>Selection antibiotics for reporter cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>anti-bl-1</td>
			<td>Selection antibiotics for reporter cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO) for molecular biology</td>
			<td>Sigmal-Aldrich</td>
			<td>D8418-100ML</td>
			<td>Use for reagent preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) for molecular biology</td>
			<td>Sigmal-Aldrich</td>
			<td>P1585-1MG</td>
			<td>Use for cell differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli K12</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-eklps</td>
			<td>TLR4 ligand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pam3CSK4</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-pms</td>
			<td>TLR2/1 ligand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly (I:C) HMW</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-pic</td>
			<td>TLR3 ligand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flagellin from S. Typhimurium (FLA-ST), ultrapure</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-epstfla</td>
			<td>TLR5 ligand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax Plus 384 microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Read colorimetric assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite M200 Pro multimode microplate reader with injectors</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Read luminiscience</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge 22R centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Temperature controlled micro-centrifugator (up to 18,000 g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra X-15R centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Temperature controlled general purpose centrifugator (for cell culture use)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar assay plate, 96-well white with clear flat bottom, tissue culure treated</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>3903</td>
			<td>Used for luminiscence assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

screening bioactive nanoparticles in phagocytic immune cells for inhibitors of toll-like receptor signaling

Farmakologisk regulering av Toll-lignende reseptor (TLR) -svar holder stort løfte i behandlingen av mange inflammatoriske sykdommer. Det har imidlertid vært begrenset tilgjengelige forbindelser så langt for å dempe TLR-signalering, og det har ikke vært klinisk godkjente TLR-hemmere (unntatt anti-malarialt hydroksyklorokin) i klinisk bruk. I lys av raske fremskritt innen nanoteknologi, kan manipulering av immunresponsivitet ved hjelp av nano-enheter gi en ny strategi for å behandle disse sykdommene. Her presenterer vi en høy gjennomsiktig screeningsmetode for raskt å identifisere nye bioaktive nanopartikler som hemmer TLR-signalering i fagocytiske immunceller. Denne screeningsplattformen er bygget på THP-1-cellebaserte reporterceller med kolorimetriske og luciferase-analyser. Reportercellene er konstruert fra den humane THP-1 monocytiske cellelinjen ved stabil integrasjon av to inducerbare reporterkonstruksjoner. En uttrykker et utskilt embryonalt alkalisk fosfatase (SEAP) -genUnder kontroll av en promotor inducerbar av transkripsjonsfaktorene NF-KB og AP-1, og den andre uttrykker et utskilt luciferase-reportergen under kontroll av promotorer som er inducerbare av interferon regulatoriske faktorer (IRFs). Etter TLR-stimulering aktiverer reportercellene Transkripsjonsfaktorer og deretter produsere SEAP og / eller luciferase, som kan detekteres under anvendelse av deres tilsvarende substratreagenser. Ved å bruke et bibliotek av hybrider av peptid-gull nanopartikkel (GNP) som ble etablert i våre tidligere studier som et eksempel, identifiserte vi en peptid-GNP-hybrid som effektivt kunne hemme de to armene av TLR4-signalkaskaden utløst av sin prototypiske ligand, lipopolysakkarid (LPS). Funnene ble validert ved standard biokjemiske teknikker, inkludert immunoblotting. Videre analyse fastslår at denne bly hybrid hadde et bredt hemmende spektrum, som virker på flere TLR-veier, inkludert TLR2, 3, 4 og 5. Denne eksperimentelle tilnærmingen tillater en rask vurdering av hvemRa nanopartikkel (eller andre terapeutiske forbindelser) kan modulere spesifikk TLR-signalering i fagocytiske immunceller.

Den samlede eksperimentelle tilnærmingen er illustrert i figur 1 . De to THP-1-reportercellelinjer, THP-1-XBlue og THP-1-Dual, brukes til å raskt skjerme TLR-responsene ved å undersøke aktiveringen av henholdsvis NF-KB / AP-1 og IRF. Aktivering av NF-KB / AP-1 kan detekteres ved hjelp av SEAP-kolorimetrisk analyse, mens IRF-aktivering overvåkes ved luciferase luminescens. De monocytiske THP-1-cellene kan lett avledes i makrofager for å skjerme nanodevi...

Watch this Scientific Journal Video about Screening Bioactive Nanoparticles in Phagocytic Immune Cells for Inhibitors of Toll-like Receptor Signaling at JoVE.com

Screening Bioactive Nanoparticles in Phagocytic Immune Cells for Inhibitors of Toll-like Receptor Signaling

Toll-lignende reseptor (TLR) signalering spiller en viktig rolle i patofysiologien til mange humane inflammatoriske sykdommer, og regulering av TLR-responser av bioaktive nanopartikler forventes å være gunstig ved mange inflammatoriske tilstander. THP-1-cellebaserte reporterceller gir en allsidig og robust screeningsplattform for å identifisere nye inhibitorer av TLR-signalering.

Screening av bioaktive nanopartikler i phagocytiske immunceller for inhibitorer av Toll-lignende Receptor Signalering

Pharmacological regulation of Toll-like receptor (TLR) responses holds great promise in the treatment of many inflammatory diseases. However, there have ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Medicine

Cellular Processes

Cell Signaling

SCIENTISTS IN ACTION

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

High Content Screening in Neurodegenerative Diseases

Høyt innhold Screening i nevrodegenerative sykdommer

The functional annotation of genomes, construction of molecular networks and novel drug target identification, are important challenges that need to be ...

A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and ...

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Screening for Melanom Modifiers ved hjelp av en Sebrafisk stedegen Tumor Model

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells

En Multiplexed Luciferase-basert screening plattform for avhør kreft-assosiert Signal Transduksjon i dyrkede celler

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi)  holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable  ...

Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

Pre-kliniske Evaluering av tyrosinkinasehemmere for behandling av akutt leukemi

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

High-throughput Flow Cytometry cellebasert analyse for å påvise antistoffer mot N-metyl-D-aspartat-reseptoren, eller dopamin-2-reseptor i Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Profilering av Østrogen-regulerte MicroRNAs i brystkreftceller

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells

Utnyttelse i Soft Agar Colony Forming analyse for å identifisere hemmere av tumorgenisitet i brystkreftceller

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation ...