Name: screening bioactive nanoparticles in phagocytic immune cells for inhibitors of toll-like receptor signaling
Uploaded: 2017-07-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Screening Bioactive Nanoparticles in Phagocytic Immune Cells for Inhibitors of Toll-like Receptor Signaling at JoVE.com

Os autores gostariam de reconhecer o apoio do Programa para Professor de Nomeação Especial (Eastern Scholar) nas Instituições de Aprendizagem Superior de Shanghai (HY), o fundo de partida do Hospital das Primeiras Pessoas de Xangai (HY), o apoio da Grant Gaudeng Clinical Medicine Grant de Shanghai Jiaotong Faculdade de Medicina da Universidade (HY) e o financiamento da Fundação Crohn e Colite do Canadá (CCFC) (SET e HY).

1. Preparação de meios de cultura celular e reagentes <ol><li> Prepare o meio de cultura celular R10 completo adicionando os suplementos de 10% de soro bovino fetal (FBS), L-glutamina 2 mM e piruvato de sódio 1 mM no meio RPMI-1640. <ol><li> Prepare o meio de cultura de seleção R10-Z adicionando os antibióticos Zeocin (200 μg / mL) a R10 para manter a expressão de SEAP sob o controle de NF-κ B / AP-1 ativação. Para selecionar células que expressam os genes repórter SEAP e luciferase, adic...

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Uma vez que os TLRs estão envolvidos na patogênese de muitas doenças inflamatórias, eles emergiram como alvos terapêuticos para a modulação de respostas imunes e condições inflamatórias. No entanto, o desenvolvimento clínico de terapêuticas para inibir as vias de sinalização TLR teve sucesso limitado até à data. O fármaco antipalúdico hidroxicloroquina que inibe TLR7 e TLR9 está em uso clínico 35 , 36 . Da mesma forma, apenas um número limit...

Os receptores Toll-like (TLRs) são um dos elementos-chave no sistema imune inato que contribuem para a primeira linha de defesa contra infecções. Os TLRs são responsáveis ​​por detectar invasores patógenos, reconhecendo um repertório de padrões moleculares associados a patógenos (ou PAMPs) e a montagem de reações de defesa através de uma cascata de transdução de sinal 1 , 2 . Existem 10 TLR humanos identificados; Exceto TLR10 para o qual o (s) ligando (s) permanecem obscuros, cada TLR pode reconhecer um grupo distinto e conservado de PAMPs. Por exemplo, TLR2 e TLR4, localizados principalmente na superfície celular, podem detectar lipoproteínas e glicolípidos de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, respectivamente; Enquanto TLR3, TLR7 / 8 e TLR9, principalmente presentes nos compartimentos endossômicos, podem detectar produtos de ARN e DNA de vírus e bactérias 3 . Quando estimulados por PAMPs, os TLRs desencadeiam respostas imunes essenciais ao libertar pro-infMediadores lacônicos, recrutando e ativando células imunes efectoras e coordenando eventos imunes adaptativos subseqüentes 4 . A transdução de sinalização TLR pode ser simplesmente categorizada em duas vias principais 5 , 6 . Um é dependente do fator de diferenciação mielóide da proteína adaptadora 88 (MyD88) - a via dependente de MyD88. Todos os TLRs, com exceção do TLR3, utilizam esta via para ativar o fator nuclear kappa-cadeia leve-intensificador de células B ativadas (NF-kB) e proteína quinases associadas a mitógenos (MAPKs), levando à expressão de mediadores pró-inflamatórios, como TNF- Α, IL-6 e IL-8. A segunda via utiliza o interferão-β indutor de adaptador contendo TIR (TRIF) - o caminho dependente de TRIF ou independente de MyD88 - para ativar fatores reguladores de interferão (IFN) e NF-κ B, resultando na produção de IFN tipo I. Sinalização TLR intactaÉ fundamental para a nossa proteção diária contra infecções microbianas e virais; Defeitos nas vias de sinalização TLR podem levar à imunodeficiência e muitas vezes prejudicam a saúde humana. 7 No entanto, a sinalização TLR é uma &quot;espada de dois gumes&quot; e a ativação excessiva e descontrolada do TLR é prejudicial. As respostas TLR hiperativas contribuem para a patogênese em muitas doenças inflamatórias humanas agudas e crônicas 8 , 9 . Por exemplo, a sepsis caracterizada por inflamação sistêmica e lesão multiorgânica é principalmente devido a respostas imunes agudas e esmagadoras em relação a infecções, com TLR2 e TLR4 desempenhando um papel crucial na fisiopatologia da sepse 10 , 11 , 12 . Além disso, TLR5 foi encontrado para contribuir para a inflamação pulmonar crônica de pacientes com fibrose cística 13, 14 . Além disso, a sinalização TLR endossomal desregulada (por exemplo, TLR7 e TLR9) está fortemente associada ao desenvolvimento e progressão de várias doenças auto-imunes, incluindo lúpus eritematoso sistêmico (LES) e artrite reumatóide (RA) 15 , 16 . Essas linhas convergentes de evidência identificam a sinalização TLR como um potencial alvo terapêutico para muitas doenças inflamatórias 17 . Embora a regulação farmacológica das respostas de TLR seja antecipada a ser benéfica em muitas condições inflamatórias, infelizmente, atualmente existem poucos compostos clinicamente disponíveis para inibir a sinalização TLR 9 , 17 , 18 . Isto é em parte devido à complexidade e redundância das vias TLR envolvidas na homeostase imune e na patologia da doença. Portanto, procurando por romance, PotenT agentes terapêuticos para direcionar múltiplas vias de sinalização de TLR podem preencher um fosso fundamental e superar o desafio de avançar os inibidores de TLR na clínica. À luz dos rápidos avanços em nanociências e nanotecnologias, os nanodispositivos estão emergindo como os moduladores de TLR de próxima geração devido às suas propriedades únicas 19 , 20 , 23 . O tamanho da nanoescala permite que estes nano-terapêuticos tenham melhor distribuição biológica e circulação sustentada 24 , 25 , 26 . Eles podem ser ainda funcionalizados para atender aos perfis farmacodinâmicos e farmacocinéticos desejados 27 , 28 , 29 . Mais emocionante, a bio-atividade desses novos nanodispositivos surge de suas propriedades intrínsecas, que podem ser adaptadas paraAplicações médicas específicas, em vez de simplesmente atuar como um veículo de entrega para um agente terapêutico. Por exemplo, uma nanopartícula parecida com a lipoproteína de alta densidade (HDL) foi projetada para inibir a sinalização TLR4, eliminando o ligando TLR4 LPS 23 . Além disso, desenvolvemos um sistema híbrido de nanopartículas de péptido-ouro, onde os péptidos decorados podem alterar as propriedades superficiais das nanopartículas de ouro e permitir-lhes ter várias atividades biológicas 30 , 31 , 32 , 33 . Isso os torna uma classe especial de drogas (ou &quot;nano-drogas&quot;) como a nova geração de nano-terapêutica. Neste protocolo, apresentamos uma abordagem para identificar uma nova classe de híbridos de nanopartículas de péptido-ouro (péptido-PNP) que podem inibir potentemente múltiplas vias de sinalização de TLR em células imunes fagocíticas 32 , </suP&gt; 33 . A abordagem é baseada em linhas celulares repórter THP-1 comercialmente disponíveis. As células repórter consistem em duas construções repórter estáveis ​​e induzíveis: uma carrega um gene secretado de fosfatase alcalina embrionária (SEAP) sob o controlo de um promotor induzível pelos factores de transcrição NF-κB e proteína activadora 1 (AP-1); O outro contém um gene repórter de luciferase segregado sob o controle de promotores indutíveis por fatores reguladores de interferão (IRFs). Após a estimulação de TLR, a transdução de sinal leva à ativação de NF-κB / AP-1 e / ou IRFs, que liga os genes repórter ao SEAP secreto e / ou à luciferase; Tais eventos podem ser facilmente detectados usando seus reagentes de substrato correspondentes com um espectrofotômetro ou um luminômetro. Usando essa abordagem para pesquisar nossa biblioteca previamente estabelecida de híbridos peptídicos-PNP, identificamos candidatos líderes que podem inibir potentemente as vias de sinalização TLR4. A atividade inibitória do péptido principal -Os híbridos PNP foram então validados usando outra abordagem bioquímica de imunotransferência e avaliados em outras vias TLR. Esta abordagem permite o rastreio rápido e eficaz de novos agentes que visam as vias de sinalização TLR.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>THP-1-XBlue reporter cell</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>thpx-sp</td>
			<td>keep cell culture passage under 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1-Dual repoter cell</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>thpd-nfis</td>
			<td>keep cell culture passage under 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 (no L-glutamine)</td>
			<td>GE Health Care</td>
			<td>SH30096.02</td>
			<td>Warm up to 37 &#176;C before use; add supplements to make a complete medium R10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (qualified)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12484028</td>
			<td>Heat inactivated; 10% in RPMI-1640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30034.02</td>
			<td>2 mM in the complete medium R10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>1 mM in the complete medium R10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline, 1X, without calcium, magnesium</td>
			<td>GE Health Care</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td>Use for cell washing and reagent preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QUANTI-Blue</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>rep-qb1</td>
			<td>SEAP substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QUANTI-Luc</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>rep-qlc2</td>
			<td>Luciferase substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-zn-1</td>
			<td>Selection antibiotics for reporter cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>anti-bl-1</td>
			<td>Selection antibiotics for reporter cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO) for molecular biology</td>
			<td>Sigmal-Aldrich</td>
			<td>D8418-100ML</td>
			<td>Use for reagent preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) for molecular biology</td>
			<td>Sigmal-Aldrich</td>
			<td>P1585-1MG</td>
			<td>Use for cell differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli K12</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-eklps</td>
			<td>TLR4 ligand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pam3CSK4</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-pms</td>
			<td>TLR2/1 ligand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly (I:C) HMW</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-pic</td>
			<td>TLR3 ligand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flagellin from S. Typhimurium (FLA-ST), ultrapure</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-epstfla</td>
			<td>TLR5 ligand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax Plus 384 microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Read colorimetric assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite M200 Pro multimode microplate reader with injectors</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Read luminiscience</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge 22R centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Temperature controlled micro-centrifugator (up to 18,000 g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra X-15R centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Temperature controlled general purpose centrifugator (for cell culture use)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar assay plate, 96-well white with clear flat bottom, tissue culure treated</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>3903</td>
			<td>Used for luminiscence assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

screening bioactive nanoparticles in phagocytic immune cells for inhibitors of toll-like receptor signaling

A regulação farmacológica das respostas do receptor Toll-like (TLR) é de grande promessa no tratamento de muitas doenças inflamatórias. No entanto, tem havido compostos limitados disponíveis até agora para atenuar a sinalização de TLR e não houve nenhum inibidor de TLR clinicamente aprovado (exceto o medicamento antipalúdico hidroxicloroquina) em uso clínico. À luz dos avanços rápidos na nanotecnologia, a manipulação da capacidade de resposta imune usando nano-dispositivos pode fornecer uma nova estratégia para tratar essas doenças. Aqui, apresentamos um método de rastreio de alto rendimento para identificar rapidamente novas nanopartículas bioativas que inibem a sinalização TLR em células imunes fagocíticas. Esta plataforma de triagem é construída em células repórter baseadas em células THP-1 com ensaios colorimétricos e de luciferase. As células repórter são manipuladas a partir da linha celular monocítica THP-1 humana por integração estável de duas construções repórter induzíveis. Um deles expressa um gene secretado de fosfatase alcalina embrionária (SEAP)Sob o controle de um promotor induzível pelos fatores de transcrição NF-κB e AP-1 e o outro expressa um gene repórter de luciferase segregado sob o controle de promotores induzíveis por fatores reguladores de interferão (IRFs). Na estimulação de TLR, as células repórter ativam Fatores de transcrição e subseqüentemente produz SEAP e / ou luciferase, que podem ser detectados usando seus reagentes de substrato correspondentes. Usando uma biblioteca de nanopartículas de nanopartículas peptídicas-ouro (GNP) estabelecidas em nossos estudos anteriores como exemplo, identificamos um híbrido peptídico-GNP que poderia efetivamente inibir os dois braços da cascata de sinalização TLR4 desencadeada pelo seu ligando protótipo, lipopolissacarídeo (LPS). Os resultados foram validados por técnicas bioquímicas padrão, incluindo imunotransferência. Uma análise posterior estabeleceu que esse híbrido principal tinha um amplo espectro inibitório, atuando em múltiplas vias TLR, incluindo TLR2, 3, 4 e 5. Esta abordagem experimental permite uma avaliação rápida deA nanopartícula (ou outros compostos terapêuticos) pode modular a sinalização TLR específica em células imunes fagocíticas.

A abordagem experimental global está ilustrada na Figura 1 . As duas linhas de células repórter THP-1, THP-1-XBlue e THP-1-Dual, são utilizadas para visualizar rapidamente as respostas TLR, avaliando a ativação de NF-κB / AP-1 e IRFs, respectivamente. A ativação de NF-κB / AP-1 pode ser detectada pelo ensaio colorimétrico SEAP, enquanto que a ativação IRF é monitorada por luminescência de luciferase. As células monocíticas de THP-1 podem ser...

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Screening Bioactive Nanoparticles in Phagocytic Immune Cells for Inhibitors of Toll-like Receptor Signaling

A sinalização do receptor Toll-like (TLR) desempenha um papel importante na fisiopatologia de muitas doenças inflamatórias humanas, e a regulação das respostas de TLR por nanopartículas bioativas é antecipada para ser benéfica em muitas condições inflamatórias. As células repórter baseadas em células THP-1 fornecem uma plataforma de triagem versátil e robusta para identificar novos inibidores da sinalização TLR.

Triagem de Nanopartículas Bioativas em Células Imunes Fagocíticas para Inibidores da Sinalização de Receptores Toll-like

Pharmacological regulation of Toll-like receptor (TLR) responses holds great promise in the treatment of many inflammatory diseases. However, there have ...

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