Name: screening bioactive nanoparticles in phagocytic immune cells for inhibitors of toll-like receptor signaling
Uploaded: 2017-07-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Screening Bioactive Nanoparticles in Phagocytic Immune Cells for Inhibitors of Toll-like Receptor Signaling at JoVE.com

Los autores desean reconocer el apoyo del Programa de Profesor de Cita Especial en las Instituciones de Aprendizaje Superior de Shanghai (HY), el fondo inicial del Hospital Popular de Shanghai (HY), el apoyo de la Fundación Gaofeng de Medicina Clínica de Shanghai Jiaotong University School of Medicine (HY), y la financiación de la Fundación de Crohn y Colitis de Canadá (CCFC) (SET y HY).

1. Preparación de medio de cultivo celular y reactivos <ol><li> Preparar el medio de cultivo celular completo R10 añadiendo los suplementos de suero bovino fetal al 10% (FBS), L-glutamina 2 mM y piruvato sódico 1 mM en el medio RPMI-1640. <ol><li> Preparar el medio de cultivo de selección R10-Z añadiendo los antibióticos Zeocin (200 μg / mL) a R10 para mantener la expresión de SEAP bajo el control de la activación de NF-κB / AP-1. Para seleccionar las células que expresan ambos genes inform...

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Desde TLRs están involucrados en la patogénesis de muchas enfermedades inflamatorias, que han surgido como objetivos terapéuticos para la modulación de las respuestas inmunes y las condiciones inflamatorias. Sin embargo, el desarrollo clínico de la terapéutica para inhibir TLR señalización vías ha tenido un éxito limitado hasta la fecha. El medicamento antipalúdico hidroxicloroquina que inhibe TLR7 y TLR9 está en uso clínico 35 , 36 . Del mismo modo...

Los receptores Toll-like (TLRs) son uno de los elementos clave en el sistema inmune innato que contribuye a la primera línea de defensa contra las infecciones. TLRs son responsables de la detección de patógenos invasores mediante el reconocimiento de un repertorio de patógenos asociados patrones moleculares (o PAMPs) y el montaje de las reacciones de defensa a través de una cascada de la señal de transducción [ 1 , 2] . Hay 10 humanos TLRs identificados; Excepto TLR10 para el cual el ligando (s) permanece incierto, cada TLR puede reconocer un grupo distinto, conservado de PAMPs. Por ejemplo, TLR2 y TLR4, localizados principalmente en la superficie celular, pueden detectar lipoproteínas y glicolípidos de bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, respectivamente; Mientras que TLR3, TLR7 / 8 y TLR9, presentes principalmente en los compartimentos endosómicos, pueden detectar productos de ARN y ADN de virus y bacterias 3 . Cuando estimulados por PAMPs, TLRs desencadenar respuestas inmunes esenciales mediante la liberación de pro-infMediadores lammatorios, reclutamiento y activación de células inmunitarias efectoras y coordinación de sucesivos eventos inmunes adaptativos 4 . La TLR señalización transducción puede ser simplemente categorizado en dos vías principales 5 , 6 . Una es dependiente del factor de diferenciación mieloide de proteína adaptador 88 (MyD88) - la vía dependiente de MyD88. Todos TLRs excepto TLR3 utilizar esta vía para activar el factor nuclear kappa-cadena de luz-potenciador de células B activadas (NF-κ B) y mitógeno asociado a proteínas quinasas (MAPK), dando lugar a la expresión de mediadores pro-inflamatorios como TNF- Α, IL-6 e IL-8. La segunda vía utiliza interferón-β (TRIF) que induce el adaptador TIR-dominio y que depende de TRIF o MyD88 independiente para activar los factores reguladores del interferón (IFN) y NF-κB, dando como resultado la producción de IFN de tipo I. Señalización TLR intactaEs fundamental para nuestra protección diaria de infecciones microbianas y virales; Defectos en las vías de señalización TLR puede conducir a la inmunodeficiencia y son a menudo perjudiciales para la salud humana. 7 Sin embargo, la señalización de TLR es una &quot;espada de doble filo&quot; y la activación de TLR excesiva y no controlada es perjudicial. Las respuestas de TLR hiperactivas contribuyen a la patogénesis en muchas enfermedades inflamatorias humanas agudas y crónicas 8 , 9 . Por ejemplo, la sepsis que se caracteriza por inflamación sistémica y lesión multiorgánica, se debe principalmente a respuestas inmunes agudas y abrumadoras hacia las infecciones, con TLR2 y TLR4 desempeñando un papel crucial en la fisiopatología de la sepsis 10 , 11 , 12 . Además, TLR5 se ha encontrado para contribuir a la inflamación pulmonar crónica de los pacientes con fibrosis quística 13, 14 . Además, señalización endosomal TLR desregulada (por ejemplo, TLR7 y TLR9) está fuertemente asociada con el desarrollo y la progresión de varias enfermedades autoinmunes como el lupus eritematoso sistémico (LES) y la artritis reumatoide (AR) 15 , 16 . Estas líneas convergentes de evidencia de identificar TLR señalización como un potencial objetivo terapéutico para muchas enfermedades inflamatorias [ 17] . Aunque se anticipa que la regulación farmacológica de las respuestas de TLR es beneficiosa en muchas afecciones inflamatorias, desafortunadamente, actualmente hay muy pocos compuestos clínicamente disponibles para inhibir la señalización de TLR 9 , 17 , 18 . Esto se debe en parte a la complejidad y redundancia de las vías TLR implicadas en la homeostasis inmune y la patología de la enfermedad. Por lo tanto, en busca de novela, potenT de agentes terapéuticos para dirigirse múltiples vías de señalización de TLR podría puentear una brecha fundamental, y superar el reto de avanzar los inhibidores de TLR en la clínica. A la luz de los rápidos avances en nanociencia y nanotecnología, los nanodispositivos están emergiendo como los moduladores TLR de nueva generación debido a sus propiedades únicas 19 , 20 , 23 . El tamaño de nanoescala permite que estos nano-terapéuticos tengan una mejor distribución biológica y una circulación sostenida 24 , 25 , 26 . Pueden funcionalizarse adicionalmente para cumplir los perfiles farmacodinámicos y farmacocinéticos deseados 27 , 28 , 29 . Más emocionante, la bioactividad de estos nuevos nanodispositivos surge de sus propiedades intrínsecas, que pueden ser adaptadas paraAplicaciones médicas específicas, en lugar de simplemente actuar como vehículo de administración de un agente terapéutico. Por ejemplo, una nanopartícula similar a lipoproteína de alta densidad (HDL) fue diseñada para inhibir la señalización de TLR4 mediante la eliminación del ligando TLR4 LPS 23 . Además, hemos desarrollado un sistema híbrido de nanopartículas péptido-oro, donde los péptidos decorados pueden alterar las propiedades superficiales de las nanopartículas de oro, y permitirles tener varias bioactividades 30 , 31 , 32 , 33 . Esto los convierte en una clase especial de droga (o &quot;nano-droga&quot;) como la nano-terapéutica de próxima generación. En este protocolo, presentamos un enfoque para identificar una nueva clase de péptido-nanopartícula de oro (péptido-GNP) híbridos que pueden potentemente inhibir múltiples TLR vías de señalización en células inmunes fagocíticas 32 , </suP&gt; 33 . El enfoque se basa en líneas de células informadoras THP-1 comercialmente disponibles. Las células reportero- res consisten en dos construcciones repórter inducibles, estables: una lleva un gen secretado de fosfatasa alcalina embrionaria (SEAP) bajo el control de un promotor inducible por los factores de transcripción NF-κB y la proteína activadora 1 (AP-1); El otro contiene un gen reportero de luciferasa secretado bajo el control de promotores inducibles por factores reguladores de interferón (IRF). Tras la estimulación con TLR, la transducción de señales conduce a la activación de NF-κB / AP-1 y / o IRFs, que convierte los genes informadores en SEAP y / o luciferasa secretas; Tales acontecimientos pueden detectarse fácilmente usando sus correspondientes reactivos sustrato con un espectrofotómetro o luminómetro. Usando este enfoque para examinar nuestra biblioteca previamente establecida de híbridos péptido-GNP, hemos identificado candidatos de plomo que pueden potentemente inhibir las vías de señalización TLR4. La actividad inhibidora del péptido de plomo-GNP híbridos fue validado mediante otro enfoque bioquímico de inmunoblotting, y evaluado en otros TLR vías. Este enfoque permite un rastreo rápido y eficaz de nuevos agentes dirigidos a las vías de señalización de TLR.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>THP-1-XBlue reporter cell</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>thpx-sp</td>
			<td>keep cell culture passage under 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1-Dual repoter cell</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>thpd-nfis</td>
			<td>keep cell culture passage under 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 (no L-glutamine)</td>
			<td>GE Health Care</td>
			<td>SH30096.02</td>
			<td>Warm up to 37 &#176;C before use; add supplements to make a complete medium R10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (qualified)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12484028</td>
			<td>Heat inactivated; 10% in RPMI-1640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30034.02</td>
			<td>2 mM in the complete medium R10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>1 mM in the complete medium R10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline, 1X, without calcium, magnesium</td>
			<td>GE Health Care</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td>Use for cell washing and reagent preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QUANTI-Blue</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>rep-qb1</td>
			<td>SEAP substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QUANTI-Luc</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>rep-qlc2</td>
			<td>Luciferase substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-zn-1</td>
			<td>Selection antibiotics for reporter cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>anti-bl-1</td>
			<td>Selection antibiotics for reporter cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO) for molecular biology</td>
			<td>Sigmal-Aldrich</td>
			<td>D8418-100ML</td>
			<td>Use for reagent preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) for molecular biology</td>
			<td>Sigmal-Aldrich</td>
			<td>P1585-1MG</td>
			<td>Use for cell differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli K12</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-eklps</td>
			<td>TLR4 ligand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pam3CSK4</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-pms</td>
			<td>TLR2/1 ligand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly (I:C) HMW</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-pic</td>
			<td>TLR3 ligand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flagellin from S. Typhimurium (FLA-ST), ultrapure</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-epstfla</td>
			<td>TLR5 ligand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax Plus 384 microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Read colorimetric assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite M200 Pro multimode microplate reader with injectors</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Read luminiscience</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge 22R centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Temperature controlled micro-centrifugator (up to 18,000 g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra X-15R centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Temperature controlled general purpose centrifugator (for cell culture use)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar assay plate, 96-well white with clear flat bottom, tissue culure treated</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>3903</td>
			<td>Used for luminiscence assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

screening bioactive nanoparticles in phagocytic immune cells for inhibitors of toll-like receptor signaling

La regulación farmacológica de las respuestas de los receptores Toll-like (TLR) es muy prometedora en el tratamiento de muchas enfermedades inflamatorias. Sin embargo, ha habido compuestos limitados disponibles hasta ahora para atenuar la señalización de TLR y no ha habido ningún inhibidor de TLR clínicamente aprobado (excepto el fármaco antipalúdico hidroxicloroquina) en uso clínico. A la luz de los rápidos avances en nanotecnología, la manipulación de la respuesta inmune usando nano-dispositivos puede proporcionar una nueva estrategia para tratar estas enfermedades. En el presente documento, presentamos un método de selección de alto rendimiento para identificar rápidamente nuevas nanopartículas bioactivas que inhiben la señalización de TLR en células inmunitarias fagocíticas. Esta plataforma de cribado está construida sobre células reporteras basadas en células THP-1 con ensayos colorimétricos y de luciferasa. Las células reporteras se manipulan por ingeniería genética a partir de la línea celular monocítica THP-1 humana mediante la integración estable de dos construcciones informadoras inducibles. Uno expresa un gen secretado de fosfatasa alcalina embrionaria (SEAP)Bajo el control de un promotor inducible por los factores de transcripción NF-κB y AP-1, y el otro expresa un gen informador de luciferasa secretado bajo el control de promotores inducibles por factores reguladores de interferón (IRFs). Los factores de transcripción y posteriormente producen SEAP y / o luciferasa, que se pueden detectar usando sus correspondientes reactivos sustrato. Utilizando una biblioteca de híbridos de nanopartículas de péptido-oro (GNP) establecida en nuestros estudios anteriores como ejemplo, identificamos un híbrido péptido-GNP que podría inhibir eficazmente los dos brazos de la cascada de señalización TLR4 desencadenada por su ligando prototípico, lipopolisacárido (LPS). Los hallazgos fueron validados por técnicas bioquímicas estándar incluyendo inmunotransferencia. Otros análisis establecieron que este híbrido de plomo tenía un amplio espectro inhibitorio, actuando sobre múltiples vías TLR, incluyendo TLR2, 3, 4 y 5. Este enfoque experimental permite una evaluación rápida deRa (u otros compuestos terapéuticos) pueden modular la señalización TLR específica en células inmunes fagocíticas.

El enfoque experimental general se ilustra en la Figura 1 . Las dos líneas de células informadoras THP-1, THP-1-XBlue y THP-1-Dual, se usan para examinar rápidamente las respuestas de TLR probando la activación de NF-κB / AP-1 e IRFs, respectivamente. La activación de NF-κB / AP-1 puede detectarse mediante el ensayo colorimétrico de SEAP, mientras que la activación de IRF es monitorizada por la luminiscencia de luciferasa. Las células monocíticas ...

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Screening Bioactive Nanoparticles in Phagocytic Immune Cells for Inhibitors of Toll-like Receptor Signaling

La señalización de receptores de tipo Toll-like (TLR) juega un papel importante en la fisiopatología de muchas enfermedades inflamatorias humanas y se anticipa que la regulación de las respuestas de TLR por nanopartículas bioactivas es beneficiosa en muchas afecciones inflamatorias. Las células informadoras basadas en células THP-1 proporcionan una plataforma de cribado versátil y robusta para identificar nuevos inhibidores de la señalización de TLR.

Proyección de nanopartículas bioactivas en células inmunológicas fagocíticas para inhibidores de la señalización de receptores de tipo Toll

Pharmacological regulation of Toll-like receptor (TLR) responses holds great promise in the treatment of many inflammatory diseases. However, there have ...

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Establecimiento y propagación de los tumores del retinoblastoma humanos en ratones con deficiencia inmune

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

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Un nuevo enfoque quirúrgico para la administración intratraqueal de agentes bioactivos en un modelo de ratón fetal

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and ...

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

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Una plataforma de detección de luciferasa basado multiplexado para interrogar cáncer asociado transducción de señales en las células cultivadas

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi)  holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable  ...

Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

Evaluación previa a la clínica de inhibidores de tirosina cinasa para el tratamiento de la leucemia aguda

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High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Ensayo de alto rendimiento basado en células citometría de flujo para detectar anticuerpos a la N-metil-D-aspartato receptor o dopamina-2 del receptor en suero humano

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

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Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells

Utilización del ensayo Soft Agar formación de colonias para identificar inhibidores de tumorigenicidad en células de cáncer de mama

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation ...

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El estudio de cáncer de páncreas Tallo Características de las células para el desarrollo de nuevas estrategias de tratamiento

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...