Name: culturing in vivo-like murine astrocytes using the fast, simple, and inexpensive awesam protocol
Uploaded: 2018-01-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol at JoVE.com

Мы признаем, финансирование от Европейского совета научных исследований (FP7/260916), Александр фон Гумбольдт-Stiftung (Александр Kovalevskaja) и Deutsche Forschungsgemeinschaft (DE1951 и SFB889).

В соответствии с руководящими принципами для немецких животных были проведены все животных эксперименты, описанные здесь.
Примечание: График и основные этапы протокола приведены на рисунке 1.
1. Подготовка
<ol><li>
Подготовьте следующие ?...

<ol>
	<li>Puschmann, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+3D+cell+culture+system+minimizes+cellular+stress+and+maintains+the+in+vivo-like+morphological+complexity+of+astroglial+cells.">Bioactive 3D cell culture system minimizes cellular stress and maintains the in vivo-like morphological complexity of astroglial cells.</a> Glia. 61 (3), 432-440 (2013).</li><li>Puschmann, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HB-EGF+affects+astrocyte+morphology,+proliferation,+differentiation,+and+the+expression+of+intermediate+filament+proteins.">HB-EGF affects astrocyte morphology, proliferation, differentiation, and the expression of intermediate filament proteins.</a> J Neurochem. 128 (6), 878-889 (2014).</li><li>Foo, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+method+for+the+purification+and+culture+of+rodent+astrocytes.">Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes.</a> Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).</li><li>Wolfes, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+culturing+stellate+astrocytes+reveals+spatially+distinct+Ca2++signaling+and+vesicle+recycling+in+astrocytic+processes.">A novel method for culturing stellate astrocytes reveals spatially distinct Ca2+ signaling and vesicle recycling in astrocytic processes.</a> J Gen Physiol. 149 (4), (2016).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).</li><li>Krencik, R., Zhang, S. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+functional+astroglial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 6 (11), 1710-1717 (2011).</li><li>Morita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+regulation+of+calcium+oscillation+in+astrocytes+by+growth+factors+and+pro-inflammatory+cytokines+via+the+mitogen-activated+protein+kinase+cascade.">Dual regulation of calcium oscillation in astrocytes by growth factors and pro-inflammatory cytokines via the mitogen-activated protein kinase cascade.</a> J Neurosci. 23 (34), 10944-10952 (2003).</li><li>Saura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+cells+in+astroglial+cultures:+a+cautionary+note.">Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note.</a> J Neuroinflammation. 4, 26 (2007).</li><li>Raponi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100B+expression+defines+a+state+in+which+GFAP-expressing+cells+lose+their+neural+stem+cell+potential+and+acquire+a+more+mature+developmental+stage.">S100B expression defines a state in which GFAP-expressing cells lose their neural stem cell potential and acquire a more mature developmental stage.</a> Glia. 55 (2), 165-177 (2007).</li><li>Royo, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+AAV+serotypes+stably+transduce+primary+hippocampal+and+cortical+cultures+with+high+efficiency+and+low+toxicity.">Specific AAV serotypes stably transduce primary hippocampal and cortical cultures with high efficiency and low toxicity.</a> Brain Res. 1190, 15-22 (2008).</li><li>Malarkey, E. B., Parpura, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+characteristics+of+vesicular+fusion+in+astrocytes:+examination+of+synaptobrevin+2-laden+vesicles+at+single+vesicle+resolution.">Temporal characteristics of vesicular fusion in astrocytes: examination of synaptobrevin 2-laden vesicles at single vesicle resolution.</a> J Physiol. 589, 4271-4300 (2011).</li><li>Zamanian, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analysis+of+reactive+astrogliosis.">Genomic analysis of reactive astrogliosis.</a> J Neurosci. 2 (18), 6391-6410 (2012).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)+signaling+in+astrocytes+from+Ip3r2(-/-)+mice+in+brain+slices+and+during+startle+responses+in+vivo.">Ca(2+) signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo.</a> Nat Neurosci. 18 (5), 708-717 (2015).</li><li>Shigetomi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+microdomains+within+entire+astrocyte+territories+and+endfeet+with+GCaMPs+expressed+using+adeno-associated+viruses.">Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses.</a> J Gen Physiol. 141 (5), 633-647 (2013).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Transgenic+Mouse+Lines+for+Selectively+Targeting+Astrocytes+and+Studying+Calcium+Signals+in+Astrocyte+Processes+In+Situ+and+In+Vivo.">New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes In Situ and In Vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li><li>Otsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dynamics+in+astrocyte+processes+during+neurovascular+coupling.">Calcium dynamics in astrocyte processes during neurovascular coupling.</a> Nat Neurosci. 18 (2), 210-218 (2015).</li><li>Agarwal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Opening+of+the+Mitochondrial+Permeability+Transition+Pore+Induces+Microdomain+Calcium+Transients+in+Astrocyte+Processes.">Transient Opening of the Mitochondrial Permeability Transition Pore Induces Microdomain Calcium Transients in Astrocyte Processes.</a> Neuron. 93 (3), 587-605 (2017).</li></ol>

Четыре шага в рамках Протокола критические: 1) подготовка HBEGF концентрации точно 5 нг/мл, поскольку небольшое увеличение концентрации может привести к незрелых культур, например, 10 нг/мл HBEGF де будет дифференцировать астроциты4; 2) избежать пузырей в растворах, содержащих...

Астроциты влияние функции мозга через трофические поддержки, поток крови, синаптических сигнализации и пластичности и межклеточные связи - все из которых являются механизмы, которые сосредоточены вокруг тонких Астроцитарная процессов. Протокол AWESAM, описанный здесь позволяет исследования этих процессов без помех от нейронов и другие глии, который является полезным например, потому что выражение многих белков и даже Ca2 + сигнализации пересекаются через различные мозг клеток типы. Кроме того этот метод преодолевает ограничения ранее имеющихся методов. В частности, наш протокол обеспечивает в естественных условиях-как морфология (севрюга астроциты с тонкими процессов) и экспрессии генов в быстро, легко и дешевые манере.
Морфология клеток, экспрессии генов и многие другие нормативные процессы непосредственно зависят от окружающей среды. В культуре блюдо это относится к факторов, выпущенное окружающие клетки, но и среда, в которой выращиваются клетки. Для астроциты HBEGF сообщалось ранее побудить севрюга морфология1 , но был также найден де дифференцировать астроциты2. Однако, более низкие концентрации HBEGF впоследствии использовались для генерации более в естественных условиях-как астроциты, как определены через РНК последовательности в двух разных протоколов3,4. Кроме того, экзоцитоз морфология изменяется с средний состав, независимо от протокола4: Neurobasal среды с низкой концентрацией HBEGF является оптимальным для выращивания севрюга астроциты, в то время как другие средние композиции (например, Сыворотка содержащих DMEM) производят полигональных клетки (даже в астроциты свежезаваренным изолированные immunopanning).
Протокол AWESAM преодолевает недостатки предыдущих методов для выращивания монокультур экзоцитоз4. Предыдущие методы для выращивания монокультур экзоцитоз имеют следующие недостатки: многоугольной морфологии, который несвойственной севрюга астроциты в vivo (MD метод)5; продолжительность и стоимость протокола (подготовка астроциты из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток занимает три месяца и требует много реагентов, включая дорогих факторы роста)6; низкое количество материала (метод immunopanning)3; и де дифференциация астроциты и требование 3D матрицы (Puschmann и др.) 1 , 2. напротив, обеспечивает протокол AWESAM: в естественных условиях-как морфология (севрюга астроциты с тонкими процессов); быстрый, легкий и дешевый метод; большие количества материала; и в естественных условиях-как по сравнению с immunopanned и MD астроциты экспрессии генов. Кроме того, 2D культура позволяет для изучения Ca2 + сигнализации и везикул, рециркуляции в тонкие процессы и в мероприятиях рядом мембраны (например, TIRF микроскопии возможен не в 3D культур).
MD метод широко использовался с момента его опубликования в 1980 году5, предлагая простой и быстрый метод для полигональных экзоцитоз монокультур. Короче говоря, метод MD влечет за собой рост клетки смешанных мозга в сыворотке крови плода теленка (FCS)-содержащих DMEM, следуют покачивая шаги, которые обогащают для астроциты (как все другие типы отсоединить от блюдо клеток головного мозга) и далее культуры в той же среде. DMEM дополнена FCS используется для многих других типов клеток, фибробластов и адипоцитов до рака различных клеточных линий, все из которых доля полигональных морфологии, проявляемой MD астроциты в культуре. До начала 2000-х7, мало мысли было уделено СМИ с учетом астроциты, конкретно в пользу их типичные севрюга морфологии найдено в естественных условиях. Один протокол, опубликованные в 2011 году достичь таких севрюга Морфология: вызывается метод immunopanning, он использует сыворотки свободный среднего, оптимизированный для культивирования астроциты3. С помощью этого метода, клетки мозга свежевыделенных подвергаются ряд блюд, покрытых антителами, которые целевой ячейки определенного типа клеток поверхности белки, чтобы обогатить астроциты. Несмотря на более в естественных условиях-как морфология и выражение профиль immunopanned астроциты, большинство в vitro исследования по-прежнему полагаются на методе экзоцитоз MD. MD метод является простым и быстрым, в то время как метод immunopanning включает в себя более сложным и длительным шаги в первый день культуры (например дольше Пищеварение энзима, тщательно наслаивать растворов различной плотности, immunopanning себя, и несколько центрифугирования шаги - все перед покрытием). Однако, используя более специализированных средних, метод AWESAM предлагает скорость метода MD и в естественных условиях-как морфология immunopanning протокола.
В целом, протокол AWESAM полезно для изучения более в естественных условиях-как астроциты в 2D монокультур, изолированных от нейронов и глии других (как ранее характеризуется4 , immunostainings, иммуноблотов и РНК последовательности). Это позволяет для изучения тонких Астроцитарная процессов и обеспечивает большую доступность для визуализации спонтанное Ca2 + сигнализации и события близко к мембране (например, образы, TIRF микроскопия).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="898">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:171px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">25300054</td>
			<td style="width:167px;">warm in 37 &#186;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>warm in 37 &#186;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B-27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>50X stock</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>100X stock</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin / streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td>50 stock; penicillin: 5000 U/ml; streptomycin: 5000 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>without L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HBEGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>4643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14170112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">FCS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010049</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100 &#956;m nylon cell strainer</td>
			<td>BD</td>
			<td style="width:344px;">352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trypan Blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hera Cell 240i cell culture incubator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Laboratory shaker</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>Rotamax 120&#160;</td>
			<td>use inside cell culture incubator</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing in vivo-like murine astrocytes using the fast, simple, and inexpensive awesam protocol

AWESAM ( Лоw-стоимость электроннойasy stellate strocyte мethod) протокол влечет за собой быстрый, простой и недорогой способ для генерации большого количества в естественных условиях-как мыши и крысы экзоцитоз монокультур : Клетки головного мозга могут быть изолированы от различных мозга, и после недели культуры клеток, не Астроцитарная клетки стряхнуть, поместив культуры блюда на шейкер для 6 h в инкубаторе. Оставшиеся астроциты затем пассированной на новые пластины с носителем экзоцитоз специфичные (называемых NB + H). NB + H содержит низкой концентрации гепарина привязки EGF-подобный фактор роста (HBEGF), который используется вместо сыворотки в среде. После роста в NB + H, AWESAM астроциты имеют севрюга морфологии и функция тонкой процессов. Кроме того, эти астроциты, имеют больше в естественных условиях-как выражение гена чем астроциты, созданные ранее опубликованные методы. CA2 + изображений, везикул динамики и другие события недалеко от мембраны может таким образом изучены в тонкой Астроцитарная процессов в пробирке, например, с использованием живой клетки конфокальный или TIRF микроскопии. В частности AWESAM Астроциты также экспонат спонтанное Ca2 + сигнализации аналогичны астроциты в естественных условиях.

Астроциты, которые совместно культивируемых с нейронами и выращенные в NB + средний появляются севрюга после 2 недель культуры (рис. 2). В дополнение к NB + средний, совместно культивируемых Астроциты также подвергаются неизвестных нейрон производные факт?...

Watch this Scientific Journal Video about Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol at JoVE.com

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

Протокол AWESAM, описанный здесь является оптимальным для культивирования мышиных астроциты в отрыве от других клеток головного мозга в быстрый, простой и недорогой способ. Астроциты AWESAM выставку спонтанное Ca2 + сигнализации, морфология и ген выражение профили аналогичны астроциты в естественных условиях.

Культивирование в естественных условиях-как мышиных астроциты, используя протокол быстрый, простой и недорогой AWESAM

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

The overall goal of this procedure is to produce in vivo like astrocyte monocultures using a simple, fast, and economical method. This method can help answer key questions in the astroglibiology field, such as what are the economics of astrocyte physical release or uptake. The main advantage of this technique is the resulting cells closely resemble astrocytes in vivo by morphology, mRNA and protein expression, and intercellular calcium fluctuations.To begin this procedure, prepare the dissection area by placing two 10 cm petri dishes filled with dissection medium on ice in a laminar flow dissection hood. For each brain area to be isolated, prepare a 15 mL tube filled with 14 mL of dissection medium and keep on ice. Next, spray the dissection tools with 70%ethanol and place them next to the dissection microscope in the hood.If working with embryonic tissue, first remove the embryos from the uterus and open the embryonic sacs. Immediately, cut off the heads with scissors. When all heads are cut off, transfer them into pre-cooled dissection medium.Once the heads are submerged in the medium, open the skin and skull with forceps and pinch off the cerebellum. Then carefully lever the rest of the brain up and out of the skull. After that, separate the cortex from the underlying mid-brain structure.Place the forceps within the longitudinal fissure between the hemispheres and move them in between the cortex and mid-brain structures of one hemisphere to pinch each hemisphere free. Subsequently, remove all meninges from each hemisphere and separate the hippocampi. If the hippocampal astrocytes are required, transfer each hippocampus into a 15 mL tube filled with 14 mL of dissection medium on ice.After that, cut any cortical tissue to be used for generating astrocytes into pieces no larger than one cubic milliliter. Then collect all pieces of cortical tissue in a separate 15 mL tube filled with dissection medium on ice. Once all tissue pieces are collected, wait for them to settle to the bottom of the tube.Then aspirate as much medium as possible. Following that, add 2-3 mL of 0.05%tripsen EDTA and incubate the samples in a 37 degree Celsius water bath for twenty minutes. Afterward, carefully aspirate the tripsen EDTA leaving tissue pieces in a minimum amount of liquid at the bottom of the tube.Next, add 5 mL of pre-cooled dissection medium to wash off the remaining tripsen EDTA and pipette to the side of the upper tube to achieve mixing of the tissue pieces. Then, aspirate the dissection medium and leave the tissue pieces in as little liquid as possible. Repeat this washing step with pre-cooled dissection medium twice.After the final washing step, add 1 mL of room temperature D-Mem Plus, and triturate the tissue by pipetting up and down without introducing bubbles. Astrocytes are quite sensitive to pH, so it's important to avoid producing bubbles as this may change the pH of the solution. Next, place a 100 micron cell strainer in the opening of a 50 mL tube and pre-wet the filter with 4.5 mL with pre-cooled D-Mem Plus.Pipette 1 mL of the dissociated tissue suspension onto the cell strainer and add another 4.5 mL of pre-cooled D-Mem Plus to wash the cells through it. On day in vitro seven after the dissection, place the 10 cm dishes with cells in D-Mem Plus on a shaker in the incubator and shake the dishes at 110 RPM for 6 hours. 20 to 30 minutes before the end of the six hours shaking, pre-warm 1 XPBS, D-Mem Plus, NB+H, and 0.25%tripsen EDTA to 37 degrees in the water bath.After 6 hours of shaking, take the culture dishes off the shaker and immediately replace the medium with 10 mL of pre-warmed 1 XPBS per dish. Subsequently, removed PBS and add 3 mL of pre-warmed tripsen EDTA per dish. Then incubate the samples for four minutes at 37 degrees Celsius.If preparing samples for Western Blot or RNA sequencing, do not add Tripsen EDTA. Instead, replace the PBS with 12 mL of pre-warmed NB+H, after which cultures can be placed back in the incubator. Next, add 5 mL of pre-warmed D-Mem Plus to 3 mL of tripsen EDTA in each dish.Pipette the cells off the dish and collect the cell suspension in a 50 mL tube. After that, centrifuge the cell suspension at 3220 times G at 20 degrees Celsius for 4 minutes. Then, remove the supernatant and re-suspend the cell palate in 1 mL of pre-warmed NB+H.These images show that G-camp transduced ausam astrocytes exhibit spontaneous calcium ion events throughout the astrocyte networks including in the thin processes. Here, a calcium ion wave travels through several astrocytes from left to right in the images of distinct time points, where light color depicts areas of high-calcium ion concentrations and black areas represent extra cellular regions. In this graph, calcium ion concentration changes in the color-coded regions over time, which are shown as G-camp fluorescent intensity traces, illustrating how a calcium ion signaling wave spreads across several astrocytes.Once mastered, this technique can be done in one hour and fifteen minutes if it is performed properly. Following this procedure, other methods like life cell imaging in combination with transfection or viral transduction experiments can be performed to answer additional questions like which events occur in astrocyte membranes. After watching this video, you should have a good understanding of how to prepare in vivo like astrocyte motor cultures in a simple, fast, and economical way.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Быстрый Micro-ионтофорезом глутамата и ГАМК: полезный инструмент по расследованию Synaptic интеграции

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Consensus Brain-derived Protein, Extraction Protocol for the Study of Human and Murine Brain Proteome Using Both 2D-DIGE and Mini 2DE Immunoblotting

Консенсус мозга, полученных Белок, Добыча протокол по изучению человека и мыши мозга Proteome использованием как 2D-Dige и мини 2DE Иммуноблоттинг

Two-dimensional gel electrophoresis (2DE) is a powerful tool to uncover proteome modifications potentially related to different physiological or ...

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Моделирование Астроцитома Патогенез<em&gt; In Vitro</em&gt; И<em&gt; В Vivo</em&gt; Использование кортикальной астроциты или нервные стволовые клетки из условного, генной инженерии мышей

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

Простой и недорогой метод для определения холодную чувствительность и адаптация в мышах

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Протокол трехмерной конфокальной морфометрического анализа астроцитов

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

Простой способ измерить изменения в Reward обращаемость за помощью<em&gt; Дрозофилы</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

Простой Одношаговый Вскрытие Протокол целом монтажа подготовки взрослых<em&gt; Drosophila</em&gt; Мозги

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Analyzing the Size, Shape, and Directionality of Networks of Coupled Astrocytes

Анализируя размер, форму и направленность сетей спаренных астроциты

It has become increasingly clear that astrocytes modulate neuronal function not only at the synaptic and single-cell levels, but also at the network ...

An Emerging Target Paradigm to Evoke Fast Visuomotor Responses on Human Upper Limb Muscles

Новые целевые парадигмы, чтобы вызвать быстрые visuomotor ответы на человека верхней конечности мышц

To reach towards a seen object, visual information has to be transformed into motor commands. Visual information such as the object&#8217;s color, shape, ...

In vitro Modeling for Neurological Diseases using Direct Conversion from Fibroblasts to Neuronal Progenitor Cells and Differentiation into Astrocytes

Моделирование in vitro для неврологических заболеваний с использованием прямого преобразования из фибробластов в нейронные клетки-предшественники и дифференциация в астроциты

Research on neurological disorders focuses primarily on the impact of neurons on disease mechanisms. Limited availability of animal models severely ...