Name: stereological estimation of dopaminergic neuron number in the mouse substantia nigra using the optical fractionator and standard microscopy equipment
Uploaded: 2017-09-01T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stereological Estimation of Dopaminergic Neuron Number in the Mouse Substantia Nigra Using the Optical Fractionator and Standard Microscopy Equipment at JoVE.

الكتاب ممتنون لروم كيلي ولويزا Frieß، ومنزل هايك لخبراء المساعدة التقنية؛ إلى هيلغا برنر لرعاية الحيوان؛ وإلى جناح س. تشيستوفير لتوليد وتوزيع ديسيكتور البصرية شبكة البرنامج المساعد للبرنامج إيماجيج.

اتبعت جميع التوجيهية الدولية والوطنية، و/أو المؤسسية المطبق لرعاية واستخدام الحيوانات. واعتمد البروتوكول السلطات المحلية في اونترفرانكين فون ريجيرونج، ويرزبيرج، ألمانيا-
 1-تجهيز الأنسجة وإيمونوهيستوتشيميستري <ol><li>الفئران يوثانيزي CO 2 أو أي دولة أخرى وافقت الأسلو...

<ol>
	<li>Ip, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV1/2-induced+overexpression+of+A53T-alpha-synuclein+in+the+substantia+nigra+results+in+degeneration+of+the+nigrostriatal+system+with+Lewy-like+pathology+and+motor+impairment:+a+new+mouse+model+for+Parkinson's+disease.">AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson's disease.</a> Acta Neuropathol Commun. 5 (1), 11 (2017).</li><li>Ip, C. W., Beck, S. K., Volkmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocytes+reduce+nigrostriatal+deficits+in+the+6-hydroxydopamine+mouse+model+of+Parkinson's+disease.">Lymphocytes reduce nigrostriatal deficits in the 6-hydroxydopamine mouse model of Parkinson's disease.</a> J Neural Transm (Vienna). 122 (12), 1633-1643 (2015).</li><li>West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+stereological+estimation+of+the+total+number+of+neurons+in+thesubdivisions+of+the+rat+hippocampus+using+the+optical+fractionator.">Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator.</a> Anat Rec. 231 (4), 482-497 (1991).</li><li>Schmitz, C., Hof, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design-based+stereology+in+neuroscience.">Design-based stereology in neuroscience.</a> Neuroscience. 130 (4), 813-831 (2005).</li><li>Tieu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+neurotoxic+animal+models+of+Parkinson's+disease.">A guide to neurotoxic animal models of Parkinson's disease.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 1 (1), e009316 (2011).</li><li>Abercrombie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+nuclear+population+from+microtome+sections.">Estimation of nuclear population from microtome sections.</a> Anat Rec. 94, 239-247 (1946).</li><li>Rose, R. D., Rohrlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+sectioned+cells+via+mathematical+reconstruction.">Counting sectioned cells via mathematical reconstruction.</a> J Comp Neurol. 263 (3), 365-386 (1987).</li><li>Weibel, E. R., Gomez, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+principle+for+counting+tissue+structures+on+random+sections.">A principle for counting tissue structures on random sections.</a> J Appl Physiol. 17, 343-348 (1962).</li><li>West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design-based+stereological+methods+for+counting+neurons.">Design-based stereological methods for counting neurons.</a> Prog Brain Res. 135, 43-51 (2002).</li><li>Keuker, J. I., Vollmann-Honsdorf, G. K., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+use+the+optical+fractionator:+an+example+based+on+the+estimation+of+neurons+in+the+hippocampal+CA1+and+CA3+regions+of+tree+shrews.">How to use the optical fractionator: an example based on the estimation of neurons in the hippocampal CA1 and CA3 regions of tree shrews.</a> Brain Res Brain Res Protoc. 7 (3), 211-221 (2001).</li><li>Mouton, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+age+and+lipopolysaccharide+(LPS)-mediated+peripheral+inflammation+on+numbers+of+central+catecholaminergic+neurons.">The effects of age and lipopolysaccharide (LPS)-mediated peripheral inflammation on numbers of central catecholaminergic neurons.</a> Neurobiol Aging. 33 (2), e427-e436 (2012).</li><li>Barreto, G. E., Sun, X., Xu, L., Giffard, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+proliferation+following+stroke+in+the+mouse+depends+on+distance+from+the+infarct.">Astrocyte proliferation following stroke in the mouse depends on distance from the infarct.</a> PLoS One. 6 (11), e27881 (2011).</li><li>Robinson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microstructural+and+microglial+changes+after+repetitive+mild+traumatic+brain+injury+in+mice.">Microstructural and microglial changes after repetitive mild traumatic brain injury in mice.</a> J Neurosci Res. 95 (4), 1025-1035 (2017).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2001).</li><li>. Grid_Overlay.java Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html">https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html</a> (2010)</li><li>. cell_counter.jar Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html">https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html</a> (2010)</li><li>Baquet, Z. C., Williams, D., Brody, J., Smeyne, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+model-based+(2D)+and+design-based+(3D)+stereological+methods+for+estimating+cell+number+in+the+substantia+nigra+pars+compacta+(SNpc)+of+the+C57BL/6J+mouse.">A comparison of model-based (2D) and design-based (3D) stereological methods for estimating cell number in the substantia nigra pars compacta (SNpc) of the C57BL/6J mouse.</a> Neuroscience. 161 (4), 1082-1090 (2009).</li><li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cytoarchitectonic+and+chemoarchitectonic+analysis+of+the+dopamine+cell+groups+in+the+substantia+nigra,+ventral+tegmental+area,+and+retrorubral+field+in+the+mouse.">A cytoarchitectonic and chemoarchitectonic analysis of the dopamine cell groups in the substantia nigra, ventral tegmental area, and retrorubral field in the mouse.</a> Brain Struct Funct. 217 (2), 591-612 (2012).</li><li>German, D. C., Manaye, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbrain+dopaminergic+neurons+(nuclei+A8,+A9,+and+A10):+three-dimensional+reconstruction+in+the+rat.">Midbrain dopaminergic neurons (nuclei A8, A9, and A10): three-dimensional reconstruction in the rat.</a> J Comp Neurol. 331 (3), 297-309 (1993).</li><li>Smeyne, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+Effects+of+MPTP+and+Paraquat+on+Dopaminergic+Neurons+and+Microglia+in+the+Substantia+Nigra+Pars+Compacta+of+C57BL/6+Mice.">Assessment of the Effects of MPTP and Paraquat on Dopaminergic Neurons and Microglia in the Substantia Nigra Pars Compacta of C57BL/6 Mice.</a> PLoS One. 11 (10), e0164094 (2016).</li></ol>

ويبدأ ستيريولوجي مع معالجة الأنسجة. يجب أن يتم قطع الأنسجة SN المسلسل بعناية لمنع الخسائر في الأقسام أثناء تحليل ستيريولوجيكال. بالإضافة إلى ذلك، خطوة أساسية للاحتفال واحد نصف الكرة الأرضية بغية تمييز الحق من اليسار SN عند تنفيذ ستيريولوجي. وضع ثقب صغير في الجزء العلوي من جذع الدماغ تولد نت...

التحديد الكمي لعدد الخلايا العصبية يعتبر عنصرا محوريا في أبحاث مرض باركنسون قبل الإكلينيكية لتحديد مستوى نيوروديجينيريشن داخل المادة الرمادية (SN)1،2. ويعتبر تقدير عدد الخلايا في منطقة لمصلحة ستيريولوجيكال غير متحيزة معيار الذهب3،،من45.
قبل مجيء ستيريولوجي غير منحازة، تم تقييم عدد الخلايا العصبية في الأقسام عن طريق التلاعب في التشكيلات الجانبية للخلية التي تم جردها لتصحيح للاحتمالات متغير أن الخلايا العصبية حيز البصر في مقطع. إحدى الطرق الأكثر استخداماً هو تصحيح عدد خلايا كمياً تصفها ابركرومبي6. هذا الأسلوب وحاول أن تأخذ في الاعتبار أن الخلايا يمكن قياسها كمياً أكثر من مرة إذا تم العثور على أجزاء من نفس الخلية في أقسام رقيقة المتاخمة. وبالتالي، ابركرومبي ومؤلفين آخرين إنشاء المعادلات التي تتطلب افتراضات بشأن شكل وحجم، والتوجه ل الخلايا التي تم جردها7،8. بيد هذه الافتراضات عادة لم تتحقق وذلك أدى إلى أخطاء منهجية، والاختلاف من عدد الخلايا الفعلية (أي تحيز). وعلاوة على ذلك، يمكن تخفيض التحيز ليس بأخذ العينات الإضافية3.
لتقدير أرقام الخلية باستخدام فراكتيوناتور الضوئية ستيريولوجيكال، يتم تطبيق المبادئ الرياضية مباشرة تقدير أرقام الخلية مباشرة في مجلد محدد، ثلاثي الأبعاد. وميزة هذا الأسلوب أنها لا تنطوي على افتراضات بشأن شكل وحجم، والتوجه للخلايا يتم حسابها. وهكذا، أرقام الخلية المقدرة هي أقرب إلى القيم الحقيقية والاقتراب كما يزيد حجم العينة (أي، غير متحيز)3. نظراً لأن العديد من القواعد يجب أن يتبع عند استخدام ستيريولوجي للاحتفاظ الطريقة غير متحيزة، وضعت نظم جاهزة للاستخدام التجاري ستيريولوجي (للاستعراض، انظر شميتز وهوف، 20054). نظم ستيريولوجي المتخصصة تنفيذ أساليب ستيريولوجيكال التصميم القائم مع خطط أخذ العينات والمسابير مسبقاً تعريف لتقييمات ستيريولوجيكال التي تؤدي إلى الاستقلال عن الشكل والحجم، والتوزيع المكاني، وتوجه الخلايا يتم تحليلها4،9. ومع ذلك، نظم ستيريولوجي المتاحة تجارياً غالية الثمن؛ وهذا قد يحد من تنفيذ في بحث جديد.
كان الهدف من هذه الدراسة لتطوير تقنية يمكن استخدامها لتقدير ستيريولوجيكال المستندة إلى تصميم عدد خلايا تتميز في الماوس SN، استخدام الأسلوب فراكتيوناتور الضوئية واستخدام معدات الفحص المجهري القياسي (أي، خفيفة المجهر مجهر القياسية والبرامج ويجهز x، y، z المرحلة). لهذا، يرد دليل خطوة بخطوة حول كيفية معالجة أنسجة المخ الماوس وكيفية تقدير أرقام الخلية التعطيل باستخدام ستيريولوجي غير منحازة على أساس التصميم. وعلاوة على ذلك، يتم توفير قوالب لحساب أرقام الخلية المقدرة ومعاملات للخطأ (CE).
الأسلوب الموصوفة هنا لا يقتصر على تحليل التعطيل، ولكن يمكن تكييفها للاستخدام في المناطق الأخرى المحددة تشريحيا الدماغ الماوس أو الفئران. على سبيل المثال، استخدمت ستيريولوجي غير منحازة لتقدير أرقام الخلايا العصبية في قرن آمون10 و كوروليس موضع11. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تقييم أنواع الخلايا عدا الخلايا العصبية، مثل أستروسيتيس12 و microglia13، كذلك. ولذلك، هذا الأسلوب يمكن أن تكون مفيدة للعلماء الذين تعتزم تنفيذ ستيريولوجي غير متحيزة في أبحاثهم ولكنهم ليسوا على استعداد لإنفاق الكثير من المال لشراء نظام ستيريولوجي.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1019">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">Paxinos mouse atlas</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:467px;">The Mouse Brain George Paxinos Keith B.J.FranklinCopyright @2001 by Academic Press CD Rom designet &#38; created by Paul Halasz</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">brain matrix slicer mouse</td>
			<td style="width:217px;">Zivic Instruments&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BSMAS 001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">paraformaldehyde</td>
			<td style="width:217px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1040051000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">sucrose /D(+) Saccharose&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;">4621.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">isopentane</td>
			<td style="width:217px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;">3927.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">glycerol</td>
			<td style="width:217px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1040931000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:217px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">32205-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name</td>
			<td style="width:217px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">phosphate buffered saline ingredients:</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">sodium chloride</td>
			<td style="width:217px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">31434-1KG-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td style="width:217px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1048731000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">di-sodium hydrogen phosphate dihydrate</td>
			<td style="width:217px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1065801000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">potassium chloride</td>
			<td style="width:217px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1049360500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">normal goat serum</td>
			<td style="width:217px;">Dako</td>
			<td style="width:119px;">X0907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">bovine serum albumin</td>
			<td style="width:217px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A4503-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:217px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">X100-100ml</td>
			<td>detergent</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">3,3-Diaminobenzidine-tetrahydrochlorid/DAB tablets 10mg pH 7.0</td>
			<td style="width:217px;">Kem En Tec</td>
			<td style="width:119px;">4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:216px;">H2O2/ Hydrogen peroxide 30%</td>
			<td style="width:217px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1072090250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">avidin/biotin reagent</td>
			<td style="width:217px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">32050</td>
			<td>Standard Ultra Sensitive ABC Staining Kit, 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">rabbit anti mouse tyrosine hydroxylase antibody</td>
			<td style="width:217px;">abcam</td>
			<td style="width:119px;">Ab112</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">biotinylated goat-anti-rabbit IgG H+L</td>
			<td style="width:217px;">vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">BA-1000</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">StereoInvestigator version 11.07</td>
			<td style="width:217px;">MBF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BX53 microscope</td>
			<td style="width:217px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Visiview</td>
			<td style="width:217px;">Visitron Systems GmbH</td>
			<td style="width:119px;">3.3.0.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Axiophot2</td>
			<td style="width:217px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:217px;">NIH</td>
			<td style="width:119px;">Version 4.7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tissue-TEK OCT</td>
			<td style="width:217px;">Sakura</td>
			<td style="width:119px;">4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">dry ice</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">grid overlay plugin</td>
			<td style="width:217px;">Wayne Rasband</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">cell counter plugin</td>
			<td style="width:217px;">Kurt de Vos</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html).&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">optical disector macro</td>
			<td style="width:217px;">Christopher Ward</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">C57Bl/6N male mice</td>
			<td style="width:217px;">Charles River, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SuperFrost Plus coated object slides</td>
			<td style="width:217px;">Langenbrinck, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">25G needle Microlance 3</td>
			<td style="width:217px;">BD&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">300400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">REGLO Analog Infusion pump</td>
			<td style="width:217px;">Ismatec</td>
			<td style="width:119px;">ISM 829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">StereoInvestigator system</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:467px;">StereoInvestigator version 11.07</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BX53 microscope</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:467px;">BX53 microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">self-assorted stereology</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:467px;">Visiview</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Axiophot2</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:467px;">Axiophot2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereological estimation of dopaminergic neuron number in the mouse substantia nigra using the optical fractionator and standard microscopy equipment

في بحوث مرض باركنسون قبل الإكلينيكية، تحليل المسالك نيجروسترياتال، بما في ذلك تحديد مقدار الخسارة العصبية تتميز داخل أسود الدماغ، أمرا أساسيا. لتقدير عدد الخلايا العصبية تتميز الإجمالي، يعتبر غير متحيز ستيريولوجي باستخدام الأسلوب فراكتيوناتور الضوئية حاليا معيار الذهب. لأن النظرية وراء الأسلوب فراكتيوناتور الضوئية المعقدة ونظرا لأن ستيريولوجي أمر يصعب تحقيقه دون المعدات المتخصصة، عدة نظم ستيريولوجي كاملة المتاحة تجارياً التي تشمل البرمجيات اللازمة موجودة، محض لعد أسباب الخلية. منذ شراء إعداد ستيريولوجي متخصصة ليست دائماً ممكنة، لأسباب كثيرة، يصف هذا التقرير وسيلة لتقدير ستيريولوجيكال من الخلايا العصبية تتميز بحساب استخدام معدات الفحص المجهري القياسية، بما في ذلك مجهر خفيفة، يجهز كائن الجدول (x، y، z الطائرة) مع برامج التصوير، وجهاز كمبيوتر للتحليل. ويرد شرح خطوة بخطوة حول كيفية إجراء التقدير الكمي ستيريولوجيكال باستخدام الأسلوب فراكتيوناتور الضوئية، ويتم توفير ملفات مبرمجة مسبقاً لحساب عدد خلايا المقدرة. وأجرى لتقييم مدى دقة هذا الأسلوب، مقارنة بالبيانات التي تم الحصول عليها من جهاز ستيريولوجي متاحة تجارياً. أرقام الخلية القابلة للمقارنة تم العثور على استخدام هذا البروتوكول والجهاز ستيريولوجي، مما يدل على دقة هذا البروتوكول بالنسبة ستيريولوجي غير متحيزة.

استخدام أسلوب عرضها، العدد المقدر لل + تتميز الخلايا العصبية في حق التعطيل وتراوحت بين الخلايا 7,363 و 7,987، وفي اليسار التعطيل، بين الخلايا 7,446 و 7,904. وبالتالي، كان متوسط عدد الخلايا العصبية تتميز (± SEM) 7,647 الخلايا 83 ± ± 7,675 66 لليسار التعطيل وحق التعطيل. CE المحسوبة لكل الحيوانا?...

Watch this Scientific Journal Video about Stereological Estimation of Dopaminergic Neuron Number in the Mouse Substantia Nigra Using the Optical Fractionator and Standard Microscopy Equipment at JoVE.

Stereological Estimation of Dopaminergic Neuron Number in the Mouse Substantia Nigra Using the Optical Fractionator and Standard Microscopy Equipment

يعرض هذا العمل بروتوكول خطوة بخطوة لتقدير إعداد الخلايا العصبية تتميز ستيريولوجيكال غير متحيزة في أسود الدماغ الماوس باستخدام معدات الفحص المجهري القياسي (أي، مجهر ضوء، يجهز كائن جدول (x, y, z الطائرة)، وبرمجيات المجال العام لتحليل الصور الرقمية.

ستيريولوجيكال تقدير عدد الخلايا العصبية تتميز في أسود الدماغ الماوس باستخدام فراكتيوناتور الضوئية ومعدات مجهرية القياسية

In pre-clinical Parkinson&#39;s disease research, analysis of the nigrostriatal tract, including quantification of dopaminergic neuron loss within the ...

The overall goal of this protocol is to describe the design-based stereological estimation of dopaminergic cell number in the mouse SN using standard microscopy equipment. This method is useful to estimate the number of dopaminergic neurons in the mouse substantia nigra for preclinical Parkinson's disease research using design-based unbiased stereology. The main advantage of this technique is that it can be accomplished with standard microscopy equipment without need for a commercially available complete stereology setup.Demonstrating the procedure will be Louisa Friez, a technician from my laboratory. Begin by placing a paraformaldehyde fixed mouse brain into a brain matrix and making a cut plus 0.74 millimeters from bregma. Transfer the caudal part of the brain including the SN into 4%PFA in 0.1 molar and fix overnight at four degrees Celsius.The next day, exchange the PFA for 30%sucrose in 0.1 molar PBS and incubate for another two days at four degrees Celsius to cryo protect the sample. After two days when the brain has sunk in the sucrose, place the tissue into a Cryomold filled with optimal cutting temperature compound and slowly freeze the tissue in liquid dry ice cooled isopentane. Use a cryostat to serially cut 30 micron cryo sections in the coronal plane.Mark the right hemisphere by puncturing a small hole into the upper region of the brain stem. Collect four series of sections starting at minus 2.46 millimeters from bregma and ending at 4.04 millimeters from bregma. Transfer each series of sections into a tube filled with cryoprotectant and store at minus 20 degrees Celsius.Capture digital images of tyrosine hydroxylase immunohistochemically stained SN sections using imaging software coupled to a microscope. Start by determining the actual mount and thickness of the sections at three randomly selected counting sites per section. First click on view top offset to define the top of the section.Then click on stop view top. Thereafter, click on view bottom offset and then click on stop view bottom. Write down the thickness of the section.Calculate the guard zone by subtracting three microns from the top offset and type the result into the top offset box. Then subtract the 13 micron height of the optical dissector from the top offset number and type the result into the bottom offset box. Select the following parameters, steps 14, size 1.00.Select the directory to save the file. Click on sequence to start the acquisition. After the images have been acquired, click on processing and select the following parameters, all planes from sequence, montage and the fast and stitching boxes with an image overlap of 10%Start to stitch the images by clicking on start.This will generate stack images for analysis. To begin, open the image by clicking on file and open. Set the image scale by using the analyze and set scale command.From this step, change the defined size from pixels to microns. Select the plugins then grid then grid type lines command to randomly insert a grid. Check the random offset box.Define the size of one square within the grid as 130 microns by 130 microns to equal 16, 900 square microns. Change image type from 16-bit to RGB color by clicking on image then type then RGB color. Locate the substantia nigra pars compacta.Encircle the region with the paintbrush tool using a brush width of 11. Undo the set scale command by clicking on analyze then set scale then click to remove scale to calculate in pixels rather than microns. Take a screenshot, save the image file and open the new file with ImageJ.Select brush and a brush width of 25. Mark every grid square that contacts the SN for placement of an optical dissector. Select one grid square that includes parts of the SN.Measure the upper left corner of the square with the cursor in ImageJ to define the starting x and y coordinates.Select the spreadsheet template entitled optical dissector position and calculate the optical dissector position. Then estimate the cell number using the calculation of cell count spreadsheet as described in the written portion of the protocol. This low power image shows a section of mouse brain after TH staining for dopaminergic neurons.Higher magnification depicts TH positive dopaminergic neurons. The inset shows the boxed region at increased magnification. This image shows one series of TH stained SN sections covering the whole mouse SN from rostral to caudal.Each section is separated from the consecutive section by 120 microns. The number of TH positive neurons in the right and left mouse SN were estimated using the method shown in this video and using a commercially available stereology system. As seen here, both methods resulted in comparable cell counts and there were no significant differences between data sets.Don't forget that working with paraformaldehyde can be extremely hazardous and precautions such as wearing of personal protection equipment like protective gloves should always be taken while performing this procedure. After watching this video, you should have a good understanding of how to perform unbiased stereological estimation of dopaminergic neuron number in the mouse substantia nigra using the optical fraction method and standard microscopy equipment.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

في التصوير المجراة من الحبل الشوكي عن طريق الماوس ثنائي الفوتون المجهري

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Imaging Odor-Evoked Activities in the Mouse Olfactory Bulb using Optical Reflectance and Autofluorescence Signals

التصوير رائحة مستدعى الأنشطة في لمبة الماوس الشم باستخدام الانعكاس الضوئية وإشارات تألق ذاتي

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. ...

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

في Electroporation البيضة في الدماغ المتوسط ​​الفرخ لدراسة وظيفة الجينات في الخلية العصبية الدوبامين التنمية

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

Comprehensive Profiling of Dopamine Regulation in Substantia Nigra and Ventral Tegmental Area

شامل التنميط من لائحة الدوبامين في المادة السوداء والمنطقة الجوفية السقيفية

Dopamine is a vigorously studied neurotransmitter in the CNS. Indeed, its involvement in locomotor activity and reward-related behaviour has fostered five ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

توجه الدوبامين العصبية التمايز من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

على الموصل العصبي العضلي: قياس المشبك الحجم، التغييرات تجزئة ومتشابك الكثافة البروتين عن طريق متحد البؤر مضان المجهر

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

مراقبة البصرية من البروتين العصبية باستخدام حمض أميني مصطنعة مشفرة وراثيا في الخلايا العصبية

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

The Optical Fractionator Technique to Estimate Cell Numbers in a Rat Model of Electroconvulsive Therapy

تقنية الكسور البصرية لتقدير أرقام الخلايا في نموذج الجرذ من العلاج إليكتروكونفولزيف

Stereological methods are designed to describe quantitative parameters without making assumptions about size, shape, orientation and distribution of cells ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

صور حية من GLUT4 البروتين الاتجار بالماوس الخلايا العصبية طائي الأولية باستخدام الفحص المجهري Deconvolution

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

A Microbiomechanical System for Studying Varicosity Formation and Recovery in Central Neuron Axons

نظام ميكروبيوميتشانيكال لدراسة تشكيل فاريكوسيتي والانتعاش في محاور عصبية من الخلايا العصبية المركزية

Axonal varicosities are enlarged structures along the shafts of axons with a high degree of heterogeneity. They are present not only in brains with ...