Name: stereological estimation of dopaminergic neuron number in the mouse substantia nigra using the optical fractionator and standard microscopy equipment
Uploaded: 2017-09-01T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stereological Estimation of Dopaminergic Neuron Number in the Mouse Substantia Nigra Using the Optical Fractionator and Standard Microscopy Equipment at JoVE.

Los autores agradecemos a Keali Röhm, Louisa Frieß y Heike Menzel por su asistencia técnica especializada; a Helga Brünner para el cuidado de los animales; y Chistopher S. Ward para la generación y distribución del disector óptico grid plugin para el software ImageJ.

se siguieron todas las guías internacionales, nacionales o institucionales aplicables para el cuidado y uso de animales. El protocolo fue aprobado por las autoridades locales en el Regierung von Unterfranken, Würzburg, Alemania.
 1. procesamiento de tejido e inmunohistoquímica <ol><li>Euthanize ratones con CO 2 o cualquier otro método aprobaron.</li>
	<li>Transcardially de ratones machos de C56Bl/6N de 12 semanas de edad Perfuse seis con 10 mL de 0.1 M tampón fosfato salino ...

<ol>
	<li>Ip, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV1/2-induced+overexpression+of+A53T-alpha-synuclein+in+the+substantia+nigra+results+in+degeneration+of+the+nigrostriatal+system+with+Lewy-like+pathology+and+motor+impairment:+a+new+mouse+model+for+Parkinson's+disease.">AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson's disease.</a> Acta Neuropathol Commun. 5 (1), 11 (2017).</li><li>Ip, C. W., Beck, S. K., Volkmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocytes+reduce+nigrostriatal+deficits+in+the+6-hydroxydopamine+mouse+model+of+Parkinson's+disease.">Lymphocytes reduce nigrostriatal deficits in the 6-hydroxydopamine mouse model of Parkinson's disease.</a> J Neural Transm (Vienna). 122 (12), 1633-1643 (2015).</li><li>West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+stereological+estimation+of+the+total+number+of+neurons+in+thesubdivisions+of+the+rat+hippocampus+using+the+optical+fractionator.">Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator.</a> Anat Rec. 231 (4), 482-497 (1991).</li><li>Schmitz, C., Hof, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design-based+stereology+in+neuroscience.">Design-based stereology in neuroscience.</a> Neuroscience. 130 (4), 813-831 (2005).</li><li>Tieu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+neurotoxic+animal+models+of+Parkinson's+disease.">A guide to neurotoxic animal models of Parkinson's disease.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 1 (1), e009316 (2011).</li><li>Abercrombie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+nuclear+population+from+microtome+sections.">Estimation of nuclear population from microtome sections.</a> Anat Rec. 94, 239-247 (1946).</li><li>Rose, R. D., Rohrlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+sectioned+cells+via+mathematical+reconstruction.">Counting sectioned cells via mathematical reconstruction.</a> J Comp Neurol. 263 (3), 365-386 (1987).</li><li>Weibel, E. R., Gomez, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+principle+for+counting+tissue+structures+on+random+sections.">A principle for counting tissue structures on random sections.</a> J Appl Physiol. 17, 343-348 (1962).</li><li>West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design-based+stereological+methods+for+counting+neurons.">Design-based stereological methods for counting neurons.</a> Prog Brain Res. 135, 43-51 (2002).</li><li>Keuker, J. I., Vollmann-Honsdorf, G. K., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+use+the+optical+fractionator:+an+example+based+on+the+estimation+of+neurons+in+the+hippocampal+CA1+and+CA3+regions+of+tree+shrews.">How to use the optical fractionator: an example based on the estimation of neurons in the hippocampal CA1 and CA3 regions of tree shrews.</a> Brain Res Brain Res Protoc. 7 (3), 211-221 (2001).</li><li>Mouton, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+age+and+lipopolysaccharide+(LPS)-mediated+peripheral+inflammation+on+numbers+of+central+catecholaminergic+neurons.">The effects of age and lipopolysaccharide (LPS)-mediated peripheral inflammation on numbers of central catecholaminergic neurons.</a> Neurobiol Aging. 33 (2), e427-e436 (2012).</li><li>Barreto, G. E., Sun, X., Xu, L., Giffard, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+proliferation+following+stroke+in+the+mouse+depends+on+distance+from+the+infarct.">Astrocyte proliferation following stroke in the mouse depends on distance from the infarct.</a> PLoS One. 6 (11), e27881 (2011).</li><li>Robinson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microstructural+and+microglial+changes+after+repetitive+mild+traumatic+brain+injury+in+mice.">Microstructural and microglial changes after repetitive mild traumatic brain injury in mice.</a> J Neurosci Res. 95 (4), 1025-1035 (2017).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2001).</li><li>. Grid_Overlay.java Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html">https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html</a> (2010)</li><li>. cell_counter.jar Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html">https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html</a> (2010)</li><li>Baquet, Z. C., Williams, D., Brody, J., Smeyne, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+model-based+(2D)+and+design-based+(3D)+stereological+methods+for+estimating+cell+number+in+the+substantia+nigra+pars+compacta+(SNpc)+of+the+C57BL/6J+mouse.">A comparison of model-based (2D) and design-based (3D) stereological methods for estimating cell number in the substantia nigra pars compacta (SNpc) of the C57BL/6J mouse.</a> Neuroscience. 161 (4), 1082-1090 (2009).</li><li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cytoarchitectonic+and+chemoarchitectonic+analysis+of+the+dopamine+cell+groups+in+the+substantia+nigra,+ventral+tegmental+area,+and+retrorubral+field+in+the+mouse.">A cytoarchitectonic and chemoarchitectonic analysis of the dopamine cell groups in the substantia nigra, ventral tegmental area, and retrorubral field in the mouse.</a> Brain Struct Funct. 217 (2), 591-612 (2012).</li><li>German, D. C., Manaye, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbrain+dopaminergic+neurons+(nuclei+A8,+A9,+and+A10):+three-dimensional+reconstruction+in+the+rat.">Midbrain dopaminergic neurons (nuclei A8, A9, and A10): three-dimensional reconstruction in the rat.</a> J Comp Neurol. 331 (3), 297-309 (1993).</li><li>Smeyne, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+Effects+of+MPTP+and+Paraquat+on+Dopaminergic+Neurons+and+Microglia+in+the+Substantia+Nigra+Pars+Compacta+of+C57BL/6+Mice.">Assessment of the Effects of MPTP and Paraquat on Dopaminergic Neurons and Microglia in the Substantia Nigra Pars Compacta of C57BL/6 Mice.</a> PLoS One. 11 (10), e0164094 (2016).</li></ol>

Estereología se inicia con el proceso de tejido. La serie corte de tejido SN debe realizarse cuidadosamente para evitar la pérdida de las secciones durante el análisis estereológicos. Además, un paso esencial es marcar un hemisferio para distinguir la derecha de la izquierda SN realización de estereología. Colocar un pequeño agujero en la parte superior del tronco encefálico genera los mejores resultados en el estudio presentado. Por otra parte, desde el trabajo con las exigencias de método fraccionador óptico...

La cuantificación del número de célula neuronal es fundamental en la investigación de la enfermedad de Parkinson preclínica para determinar el nivel de la neurodegeneración en la substantia nigra (SN)1,2. La estimación imparcial Estereológicas del número de células en una región de interés se considera el estándar de oro3,4,5.
Antes del advenimiento de estereología imparcial, se evaluó el número de neuronas en secciones mediante la manipulación de células contadas perfiles para corregir para las probabilidades variables que las neuronas entran en vista en una sección. Uno de los métodos más utilizados fue la corrección de un recuento cuantificados descritos por Abercrombie6. Este método tratado de tomar en cuenta que las células se pueden cuantificar más de una vez si fragmentos de la misma célula se encuentran en las secciones delgadas adyacentes. Por lo tanto, Abercrombie y otros autores generaron ecuaciones que requieren supuestos sobre la forma, tamaño y orientación de las células contadas7,8. Sin embargo, estos supuestos fueron generalmente no se dio cuenta y por lo tanto condujo a errores sistemáticos y divergencia del número real de la célula (es decir, sesgo). Por otra parte, no podría reducirse el sesgo de muestreo adicional3.
Para la estimación Estereológicas de números de celular mediante el fraccionador óptico, se aplican principios matemáticos para estimar directamente el número de células en un volumen definido, 3 dimensiones. La ventaja de este método es que no involucra supuestos sobre la forma, tamaño y orientación de las células se contaron. Así, el número estimado de la célula está más cercano de los verdaderos valores y acercarse a medida que el tamaño de muestra aumenta (es decir, imparciales)3. Porque muchas reglas deben seguirse cuando se usa la estereología para mantener el método imparcial, se han desarrollado sistemas de estereología comercial lista para usar (para revisión, ver Schmitz y Hof, 2005,4). Sistemas especializados de estereología implementan métodos estereológicos basados en diseño con sondas de priori definidos y planes de muestreo para evaluaciones estereológicos que conducen a la independencia de la forma, tamaño, distribución espacial y orientación de la células para ser analizado4,9. Sin embargo, los sistemas de estereología comercialmente disponibles son caros; Esto puede limitar la aplicación en una nueva investigación.
El objetivo de este estudio fue desarrollar una técnica útil para la estimación Estereológicas basado en el diseño de recuentos de células dopaminérgicas en el ratón SN, empleando el método de fraccionamiento óptica y uso de equipo de microscopia estándar (es decir, luz microscopio, microscopio estándar de software y un motor x, y, z etapa). Para ello, se presenta una guía paso a paso sobre cómo procesar el tejido de cerebro de ratón y cómo estimar el número de células del SN mediante estereología imparcial basada en diseño. Además, se proporcionan plantillas para el cálculo de los números de celular Estimado y los coeficientes de error (CE).
El método descrito aquí no se limita al análisis del SN, pero puede ser adaptado para su uso en otras regiones anatómicamente definidas del cerebro de ratón o rata. Por ejemplo, estereología imparcial se ha utilizado para estimar el número de células neuronales en el hipocampo10 y el locus coeruleus11. Además, tipos de células distintos de neuronas, como12 y microglia astrocitos13, pueden ser evaluados también. Por lo tanto, este método puede ser útil para los científicos que pretenden implementar estereología imparcial en sus investigaciones, pero no están dispuestos a gastar mucho dinero para comprar un sistema de estereología.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1019">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">Paxinos mouse atlas</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:467px;">The Mouse Brain George Paxinos Keith B.J.FranklinCopyright @2001 by Academic Press CD Rom designet &#38; created by Paul Halasz</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">brain matrix slicer mouse</td>
			<td style="width:217px;">Zivic Instruments&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BSMAS 001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">paraformaldehyde</td>
			<td style="width:217px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1040051000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">sucrose /D(+) Saccharose&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;">4621.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">isopentane</td>
			<td style="width:217px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;">3927.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">glycerol</td>
			<td style="width:217px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1040931000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:217px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">32205-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name</td>
			<td style="width:217px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">phosphate buffered saline ingredients:</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">sodium chloride</td>
			<td style="width:217px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">31434-1KG-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td style="width:217px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1048731000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">di-sodium hydrogen phosphate dihydrate</td>
			<td style="width:217px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1065801000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">potassium chloride</td>
			<td style="width:217px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1049360500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">normal goat serum</td>
			<td style="width:217px;">Dako</td>
			<td style="width:119px;">X0907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">bovine serum albumin</td>
			<td style="width:217px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A4503-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:217px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">X100-100ml</td>
			<td>detergent</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">3,3-Diaminobenzidine-tetrahydrochlorid/DAB tablets 10mg pH 7.0</td>
			<td style="width:217px;">Kem En Tec</td>
			<td style="width:119px;">4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:216px;">H2O2/ Hydrogen peroxide 30%</td>
			<td style="width:217px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1072090250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">avidin/biotin reagent</td>
			<td style="width:217px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">32050</td>
			<td>Standard Ultra Sensitive ABC Staining Kit, 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">rabbit anti mouse tyrosine hydroxylase antibody</td>
			<td style="width:217px;">abcam</td>
			<td style="width:119px;">Ab112</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">biotinylated goat-anti-rabbit IgG H+L</td>
			<td style="width:217px;">vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">BA-1000</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">StereoInvestigator version 11.07</td>
			<td style="width:217px;">MBF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BX53 microscope</td>
			<td style="width:217px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Visiview</td>
			<td style="width:217px;">Visitron Systems GmbH</td>
			<td style="width:119px;">3.3.0.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Axiophot2</td>
			<td style="width:217px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:217px;">NIH</td>
			<td style="width:119px;">Version 4.7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tissue-TEK OCT</td>
			<td style="width:217px;">Sakura</td>
			<td style="width:119px;">4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">dry ice</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">grid overlay plugin</td>
			<td style="width:217px;">Wayne Rasband</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">cell counter plugin</td>
			<td style="width:217px;">Kurt de Vos</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html).&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">optical disector macro</td>
			<td style="width:217px;">Christopher Ward</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">C57Bl/6N male mice</td>
			<td style="width:217px;">Charles River, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SuperFrost Plus coated object slides</td>
			<td style="width:217px;">Langenbrinck, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">25G needle Microlance 3</td>
			<td style="width:217px;">BD&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">300400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">REGLO Analog Infusion pump</td>
			<td style="width:217px;">Ismatec</td>
			<td style="width:119px;">ISM 829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">StereoInvestigator system</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:467px;">StereoInvestigator version 11.07</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BX53 microscope</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:467px;">BX53 microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">self-assorted stereology</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:467px;">Visiview</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Axiophot2</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:467px;">Axiophot2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereological estimation of dopaminergic neuron number in the mouse substantia nigra using the optical fractionator and standard microscopy equipment

En la investigación de la enfermedad de Parkinson preclínica, el análisis del tracto nigroestriatal, incluyendo la cuantificación de la pérdida de neuronas dopaminérgicas en el nigra del substantia, es esencial. Para estimar el número de neuronas dopaminérgicas total, estereología imparcial usando el método de fraccionamiento óptico es considerado el estándar de oro. Porque la teoría detrás del método óptico fraccionador es complejo y porque estereología es difícil de lograr sin equipos especializados, existen varios sistemas de estereología completa disponible en el mercado que incluyen el software necesario, puramente para celular con razones. Desde adquirir una configuración de estereología especializados no siempre es factible, por muchas razones, este informe describe un método para la estimación Estereológicas de células neuronales dopaminérgicas cuenta con equipo de microscopia estándar, incluyendo un microscopio de luz, un motorizado de tabla de objeto (x, y, z plano) con software tratamiento de imágenes y una computadora para el análisis. Se da una explicación paso a paso sobre cómo realizar Estereológicas cuantificación mediante el método de fraccionamiento óptico, y se proporcionan archivos preprogramados para el cálculo del estimado del recuento. Para evaluar la exactitud de este método, se realizó una comparación con datos obtenidos de un aparato de estereología comercialmente disponibles. Un número similar de células fueron encontrado usando este protocolo y el dispositivo de la estereología, demostrando así la precisión de este protocolo de estereología imparcial.

El método presentado, el número estimado de TH + las neuronas dopaminérgicas en la derecha SN oscilado entre células 7.363 y 7.987 y en la izquierda SN, entre las células 7.446 y 7.904. Así, la media de las neuronas dopaminérgicas (± SEM) fue 7.647 ± 83 células para la derecha SN y 7.675 ± 66 para la izquierda SN. La CE calculado para cada animal fue inferior a 0.08 (gama: 0.079 0.073) (figura 7). Para determinar la comparabilidad de este método c...

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Stereological Estimation of Dopaminergic Neuron Number in the Mouse Substantia Nigra Using the Optical Fractionator and Standard Microscopy Equipment

Este trabajo presenta un protocolo paso a paso para la estimación imparcial estereológicos del número de células neuronales dopaminérgicas en la sustancia negra de ratón utilizando equipo de microscopía estándar (es decir, un microscopio de luz, una tabla de objeto motorizado (x, y, z plano) y software de dominio público para el análisis de imagen digital.

Estereológicos estimación de número de la neurona dopaminérgica en el Nigra del Substantia de ratón usando el fraccionador óptico y equipo de microscopía estándar

In pre-clinical Parkinson&#39;s disease research, analysis of the nigrostriatal tract, including quantification of dopaminergic neuron loss within the ...

The overall goal of this protocol is to describe the design-based stereological estimation of dopaminergic cell number in the mouse SN using standard microscopy equipment. This method is useful to estimate the number of dopaminergic neurons in the mouse substantia nigra for preclinical Parkinson's disease research using design-based unbiased stereology. The main advantage of this technique is that it can be accomplished with standard microscopy equipment without need for a commercially available complete stereology setup.Demonstrating the procedure will be Louisa Friez, a technician from my laboratory. Begin by placing a paraformaldehyde fixed mouse brain into a brain matrix and making a cut plus 0.74 millimeters from bregma. Transfer the caudal part of the brain including the SN into 4%PFA in 0.1 molar and fix overnight at four degrees Celsius.The next day, exchange the PFA for 30%sucrose in 0.1 molar PBS and incubate for another two days at four degrees Celsius to cryo protect the sample. After two days when the brain has sunk in the sucrose, place the tissue into a Cryomold filled with optimal cutting temperature compound and slowly freeze the tissue in liquid dry ice cooled isopentane. Use a cryostat to serially cut 30 micron cryo sections in the coronal plane.Mark the right hemisphere by puncturing a small hole into the upper region of the brain stem. Collect four series of sections starting at minus 2.46 millimeters from bregma and ending at 4.04 millimeters from bregma. Transfer each series of sections into a tube filled with cryoprotectant and store at minus 20 degrees Celsius.Capture digital images of tyrosine hydroxylase immunohistochemically stained SN sections using imaging software coupled to a microscope. Start by determining the actual mount and thickness of the sections at three randomly selected counting sites per section. First click on view top offset to define the top of the section.Then click on stop view top. Thereafter, click on view bottom offset and then click on stop view bottom. Write down the thickness of the section.Calculate the guard zone by subtracting three microns from the top offset and type the result into the top offset box. Then subtract the 13 micron height of the optical dissector from the top offset number and type the result into the bottom offset box. Select the following parameters, steps 14, size 1.00.Select the directory to save the file. Click on sequence to start the acquisition. After the images have been acquired, click on processing and select the following parameters, all planes from sequence, montage and the fast and stitching boxes with an image overlap of 10%Start to stitch the images by clicking on start.This will generate stack images for analysis. To begin, open the image by clicking on file and open. Set the image scale by using the analyze and set scale command.From this step, change the defined size from pixels to microns. Select the plugins then grid then grid type lines command to randomly insert a grid. Check the random offset box.Define the size of one square within the grid as 130 microns by 130 microns to equal 16, 900 square microns. Change image type from 16-bit to RGB color by clicking on image then type then RGB color. Locate the substantia nigra pars compacta.Encircle the region with the paintbrush tool using a brush width of 11. Undo the set scale command by clicking on analyze then set scale then click to remove scale to calculate in pixels rather than microns. Take a screenshot, save the image file and open the new file with ImageJ.Select brush and a brush width of 25. Mark every grid square that contacts the SN for placement of an optical dissector. Select one grid square that includes parts of the SN.Measure the upper left corner of the square with the cursor in ImageJ to define the starting x and y coordinates.Select the spreadsheet template entitled optical dissector position and calculate the optical dissector position. Then estimate the cell number using the calculation of cell count spreadsheet as described in the written portion of the protocol. This low power image shows a section of mouse brain after TH staining for dopaminergic neurons.Higher magnification depicts TH positive dopaminergic neurons. The inset shows the boxed region at increased magnification. This image shows one series of TH stained SN sections covering the whole mouse SN from rostral to caudal.Each section is separated from the consecutive section by 120 microns. The number of TH positive neurons in the right and left mouse SN were estimated using the method shown in this video and using a commercially available stereology system. As seen here, both methods resulted in comparable cell counts and there were no significant differences between data sets.Don't forget that working with paraformaldehyde can be extremely hazardous and precautions such as wearing of personal protection equipment like protective gloves should always be taken while performing this procedure. After watching this video, you should have a good understanding of how to perform unbiased stereological estimation of dopaminergic neuron number in the mouse substantia nigra using the optical fraction method and standard microscopy equipment.

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Neuroscience

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In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

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