Name: generation and long-term maintenance of nerve-free hydra
Uploaded: 2017-07-07T14:00:00
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著者はDick Campbell博士（UC Irvine）に、神経を含まない動物の生成と維持のための元のプロトコール、注射器と注射針技術の適応に関するRui Wang、Danielle HagstromとDr. Rob Steele （UC Irvine）のコメントを寄稿した。この研究は、RCSAおよびNSFグラントCMMI-1463572によって支持された。

1.ダブルコルヒチン治療<ol><li> Hydra培地で0.4％のコルヒチン（重量/容量）溶液を3、4、17にする。 注意：コルヒチンは急性毒性であり、飲み込むと致死的であり、遺伝的欠陥を引き起こし、眼に損傷を引き起こす可能性がある。ヒュームフードで粉体を取り扱い、完全な個人用保護具（PPE）を着用してください。 </li><li>ペトリ皿中のコルヒチン溶液1mLあたり5H...

<ol>
	<li>Bode, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interstitial+cell+lineage+of+Hydra:+a+stem+cell+system+that+arose+early+in+evolution.">The interstitial cell lineage of Hydra: a stem cell system that arose early in evolution.</a> J. Cell. Sci. 109, 1155-1164 (1996).</li><li>Hager, G., David, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+of+differentiated+nerve+cells+in+hydra+is+determined+by+precursor+migration.">Pattern of differentiated nerve cells in hydra is determined by precursor migration.</a> Development. 124, 569-576 (1997).</li><li>Campbell, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+Hydra+interstitial+and+nerve+cells+by+means+of+colchicine.">Elimination of Hydra interstitial and nerve cells by means of colchicine.</a> J. Cell. Sci. 21, 1-13 (1976).</li><li>Marcum, B. A., Campbell, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Hydra+lacking+nerve+and+interstitial+cells.">Development of Hydra lacking nerve and interstitial cells.</a> J. Cell. Sci. 29, 17-33 (1978).</li><li>Burns, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3H-colchicine+binding:+Failure+to+detect+any+binding+to+soluble+proteins+from+various+lower+organisms.">3H-colchicine binding: Failure to detect any binding to soluble proteins from various lower organisms.</a> Exp. Cell. Res. 81, 285-292 (1973).</li><li>Lee, H. -. T., Campbell, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Behavior+of+an+Intergeneric+Chimera+of+Hydra+(Pelmatohydra+oligactis+Interstitial+Cells+Hydra+attenuata+Epithelial+Cells).">Development and Behavior of an Intergeneric Chimera of Hydra (Pelmatohydra oligactis Interstitial Cells Hydra attenuata Epithelial Cells).</a> Biol. Bull. 157 (2), 288-296 (1979).</li><li>Novak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+Hydra+viridis+with+Nerve+Cells+and+No+Interstitial+Cells,+or+with+Neither+of+These+Cell+Types.">Preparing Hydra viridis with Nerve Cells and No Interstitial Cells, or with Neither of These Cell Types.</a> Hydra: Research Methods. , 295-297 (1983).</li><li>Wanek, N., Marcum, B. A., Lee, H. -. T., Chow, M., Campbell, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+hydrostatic+pressure+on+morphogenesis+in+nerve-free+Hydra.">Effect of hydrostatic pressure on morphogenesis in nerve-free Hydra.</a> J. Exp. Zool. 211, 275-280 (1980).</li><li>Minobe, S., Koizumi, O., Sugiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+cell+differentiation+in+nerve-free+tissue+of+epithelial+Hydra+from+precursor+cells+introduced+by+grafting.">Nerve cell differentiation in nerve-free tissue of epithelial Hydra from precursor cells introduced by grafting.</a> Dev. Biol. 172 (1), 170-181 (1995).</li><li>Miljkovic-Licina, M., Chera, S., Ghila, L., Galliot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Head+regeneration+in+wild-type+hydra+requires+de+novo+neurogenesis.">Head regeneration in wild-type hydra requires de novo neurogenesis.</a> Development. 134 (6), 1191-1201 (2007).</li><li>Wenger, Y., Buzgariu, W., Galliot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+neurogenesis+in+Hydra+leads+to+compensatory+regulation+of+neurogenic+and+neurotransmission+genes+in+epithelial+cells.">Loss of neurogenesis in Hydra leads to compensatory regulation of neurogenic and neurotransmission genes in epithelial cells.</a> Phil. Trans. R. Soc. B. 371 (20150040), (2015).</li><li>Campbell, R. D., Josephson, R. K., Schwab, W. E., Rushforth, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitability+of+nerve-free+Hydra.">Excitability of nerve-free Hydra.</a> Nature. 262, 388-390 (1976).</li><li>Takaku, Y., Hwang, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innexin+gap+junctions+in+nerve+cells+coordinate+spontaneous+contractile+behavior+in+Hydra+polyps.">Innexin gap junctions in nerve cells coordinate spontaneous contractile behavior in Hydra polyps.</a> Sci. Rep. 4 (3573), (2014).</li><li>Marcum, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+Epithelial+Hydra.">Culturing Epithelial Hydra.</a> Hydra: Research Methods. , 287-290 (1983).</li><li>David, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+method+for+maceration+of+Hydra+tissue.">A quantitative method for maceration of Hydra tissue.</a> Wilhelm Roux Arch. Entwickl. Mech. Org. 171, 259-268 (1973).</li><li>Gr&#246;ger, H., Schmid, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Larval+development+in+Cnidaria:+A+connection+to+Bilateria.">Larval development in Cnidaria: A connection to Bilateria.</a> Genesis. 29 (3), 110-114 (2001).</li><li>Lenhoff, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water,+Culture+Solutions,+and+Buffers.">Water, Culture Solutions, and Buffers.</a> Hydra: Research Methods. , 29-34 (1983).</li><li>Shenk, M. A., Bode, H. R., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Cnox-2,+a+HOM/HOX+homeobox+gene+in+hydra,+is+correlated+with+axial+pattern+formation.">Expression of Cnox-2, a HOM/HOX homeobox gene in hydra, is correlated with axial pattern formation.</a> Development. 117, 657-667 (1993).</li><li>B&#246;ttger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+Gene+Transfer+Contributed+to+the+Evolution+of+Extracellular+Surface+Structures:+The+Freshwater+Polyp+Hydra+Is+Covered+by+a+Complex+Fibrous+Cuticle+Containing+Glycosaminoglycans+and+Proteins+of+the+PPOD+and+SWT+(Sweet+Tooth)+Families.">Horizontal Gene Transfer Contributed to the Evolution of Extracellular Surface Structures: The Freshwater Polyp Hydra Is Covered by a Complex Fibrous Cuticle Containing Glycosaminoglycans and Proteins of the PPOD and SWT (Sweet Tooth) Families.</a> PLoS One. 7 (12), (2012).</li><li>King, R. S., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+protocol+for+enhanced+detection+of+gene+expression+in+the+planarian+Schmidtea+mediterranea.">In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea.</a> BMC Dev. Biol. 13 (8), (2013).</li></ol>

ハイドラ間質細胞は、二重コルヒチン処理により除去することができる3,4 。最初の治療の後の日には、個々のヒドラ間の接触を防ぎ、 ヒドラの断片が変形したヒドラに融合するのを避けることが不可欠です。また、第2のコルヒチン処置は、そのような動物から残りの間質細胞を排除するのに十分ではない可能性があるため、最初の処置の後に無...

Hydraの神経系は神経網で構成されており、両方の上皮組織層に関連したニューロンがある。神経ネットは、低体温では密度が高く、体節では密度が低い。神経細胞は、分泌細胞、線虫細胞、生殖細胞およびニューロンを生じる多能性幹細胞である間質幹細胞に由来する。分裂細胞を死滅させる植物由来の毒素であるコルヒチン3,4 で処理することにより、 ヒドラ・ブルガリス（Hydra vulgaris）の間質細胞を排除することが可能である。コルヒチンは他の生物の微小管重合を阻害することが判明していますが、これまでの研究では、治療全体を通して微小管がヒドラに存在し、コルヒチンがHydra 3でこのように作用しないことが示唆されています。もう一歩udyは、 Tetrahymena pyriformis、Zea mays、ChlamydomonasおよびSchizosaccharomyces pombeを含むいくつかの生物において、コルヒチンがチューブリンに効率的に結合しないことを示唆している。コルヒチン処置は、内胚葉上皮細胞による間質細胞の食作用を誘導し、したがって、神経細胞、腺細胞および線維細胞がない動物の作製を可能にする。間質細胞が特にコルヒチン処置の影響を受けやすい理由は不明である。 Campbellは、有糸分裂後の間質細胞と間質幹細胞系統が損傷し貪食されていることを考えると、コルヒチンは有糸分裂活性に直接影響しないと結論している3 。注目すべきは、コルヒチン治療はハイドラ・ブルガリ（Hydra vulgaris）において良好に機能するが、 ヒドラ・オリゴアクシス（Hydra oligactis） 6のような他の種においてもうまく機能しないことが示されている。 </コルヒチンおよびヒドロキシ尿素を用いた改変治療は、神経を含まないHydra viridis 7を産生するために使用することができる。したがって、神経を含まないヒドラ （「上皮性ヒドラ 」とも呼ばれることもある）は、組織ホメオスタシスおよび再生における間質細胞系列からのこれらの特殊な細胞型の役割を研究するための有用なツールである。 ヒドラは、神経系なしで暮らすことができる動物の唯一の既知の例であるかもしれない。神経を含まないヒドラは、 ヒドラの再生、恒常性、および行動を調節する際に神経網の役割を解剖するのに特に有用なモデルとして役立つ。例えば、移植を介して間質細胞を神経を含まないHydraに導入することにより、神経細胞の分化を特徴付けることができた。さらに、神経を含まないヒドラは再生することができるため、代わりの、神経系に依存しない再生経路の調査を可能にする。そのような例の1つは、野生型ヒドラの神経系におけるcnox-2機能に依存することが示されているが、神経を含まないヒドラには存在しないようであり、代替的な頭部再生プロセスが存在し得ることを示唆する先端神経形成および頭形成である10 。 神経を含まないヒドラはまた、神経新生11の喪失後に、上皮細胞の発現および神経原性および神経伝達遺伝子の調節を研究するために使用されている11 。神経を含まないヒドラは自発収縮バースト12を示さず、これらのバーストは神経系によって調節されることを示している。しかし、神経を含まないHydraは体の柱を鉗子で挟むことに応答して収縮し、機械的刺激に応答する収縮はカップリングスルーによって媒介されることを示唆しているghギャップジャンクションを介して結合するが、自然収縮挙動は神経細胞のギャップジャンクションを介して結合することによって媒介される13 。 神経を含まないヒドラは、食物や還元型グルタチオン3を与えられても口を開けません。これは、食物の存在を検出して口を開けるように感覚ニューロンが必要であることを示唆しています3 。加えて、神経網は、開口部から内部の静水圧を自律的に調節することができず、特徴的な風船状の外観を呈する（ 図1B ）ため、浸透圧を感知する役割を果たすと思われる。頻繁な手動収縮による神経を含まないヒドラにおける静水圧の調節は、低体温および身体の柱におけるいくつかの異常な形態の喪失につながった。しかし、慢性的なデフレは成長への干渉をもたらした養子縁組、発芽、および組織組織8 。 神経を持たないヒドラは自分で食べることはできませんが、手動で動物を強制的に餌を与えて飼育することで、実験室で無期限に維持することは可能です。以前の刊行物は、無給餌のHydraを強制的に給餌する方法を記載しているが、これらのプロトコールは、マイクロピペットチップを使用することを必要としており、これを適切なサイズに注意深く引っ張る必要があり、チュービング14によってピペットに接続されたマウスピースを使用する。ここでは、より単純で、より安全で、より時間効率的な、給餌および飼育の方法が記載されている。 さらに、以前の研究では、固定された動物を個々の細胞に解離させて神経細胞が存在しないかどうかを検査し、細胞の形態学を調べた3,4,15）。 Hアルファ - チューブリンのチロシン化カルボキシル末端に対するモノクローナル抗体による免疫組織化学を、hypostome 13,16におけるニューロンの枯渇を確認するための浸軟の補完的方法として用いた。これまでの研究では、この抗体13を用いて、花柄のニューロンも視覚化することができることが示されているが、これらのニューロンは、身体の欄のものと同様に、免疫組織化学は、hypostomeにおける神経細胞の不在を確認するのに十分であり、細胞型形態に関する専門知識を必要としないが、間質幹細胞およびこれらの細胞の他の誘導体の欠如をチェックするために使用することはできない。解離および細胞形態学の研究はより厳密であり、治療の各段階の後に残っている各細胞型の数を定量的に説明することができる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="663">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:303px;">Colchicine</td>
			<td style="width:75px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:119px;">227120010</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 ml Syringe</td>
			<td style="width:75px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">301025</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Brine Shrimp Eggs</td>
			<td style="width:75px;">Brine Shrimp Direct</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:167px;">Can be purchased locally</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Brine Shrimp Hatchery Dish</td>
			<td style="width:75px;">Brine Shrimp Direct</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">60 mm x 15 mm Petri Dish</td>
			<td style="width:75px;">Celltreat</td>
			<td style="width:119px;">229663</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">30 G x 3/4&#34; Hypodermic Needle</td>
			<td style="width:75px;">Covidien</td>
			<td style="width:119px;">1188830340</td>
			<td style="width:167px;">A 27G needle may also be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2 x Fine-tip Tweezers</td>
			<td style="width:75px;">Dumont</td>
			<td style="width:119px;">0109-5-PO</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Rifampicin</td>
			<td style="width:75px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">557303</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Goat anti-mouse lgG, Pab (HRP Conjugate)</td>
			<td style="width:75px;">Enzo</td>
			<td style="width:119px;">ADI-SAB-100-J</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:75px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP9703-100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scalpel</td>
			<td style="width:75px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-920A</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:75px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10437028</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td style="width:75px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS Tablets</td>
			<td style="width:75px;">MP Bio</td>
			<td style="width:119px;">2810305</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Monoclonal Anti-Tubulin, Tyrosine</td>
			<td style="width:75px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T9028</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:75px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D2650</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Hydrogen Peroxide</td>
			<td style="width:75px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">216763</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:75px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X - 100</td>
			<td style="width:75px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T9284</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tween 20</td>
			<td style="width:75px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P1379</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Urethane</td>
			<td style="width:75px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">U2500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Air Pump</td>
			<td style="width:75px;">Tetra</td>
			<td style="width:119px;">77846-00</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glass Pasteur Pipette</td>
			<td style="width:75px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">53283-916</td>
			<td style="width:167px;">Length of the pipet does not matter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">15 ml Tube</td>
			<td style="width:75px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">89039-670</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">P320 Sandpaper</td>
			<td style="width:75px;">3M</td>
			<td style="width:119px;">IBGABBV00397</td>
			<td style="width:167px;">Can be purchased at local home improvement store</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and long-term maintenance of nerve-free hydra

Hydraの間質細胞系譜には、多分化能性幹細胞およびその誘導体（腺細胞、線虫細胞、生殖細胞および神経細胞）が含まれる。間質細胞は、分裂細胞を死滅させる植物由来の毒素であるコルヒチンを用いて2回連続して処理することにより排除することができ、間質幹細胞に由来する分化細胞の再生可能性を消去する。これは、神経細胞を欠いたヒドラの生成を可能にする。神経を含まないポリープは、浸透圧を供給し、排泄し、または調節するためにその口を開くことができない。しかし、そのような動物は、定期的に力を与えて餌をつけた場合、生存し、実験室で無期限に培養することができる。神経細胞の欠如は、動物の行動および再生を調節する際の神経系の役割の研究を可能にする。以前に公開された神経を含まないヒドラの維持のためのプロトコールは、手で引いたマイクロピペットを用いた口のピペット操作ヒドラを飼い 、清掃する。ここでは、神経を含まないヒドラの維持のための改善されたプロトコールが導入されている。細く絞った鉗子を使用して口を強制的に開け、新しく殺されたアルテミアを挿入する。強制給餌後、動物の体腔をシリンジおよび皮下注射針を用いて新鮮な培地でフラッシュして未消化物質を除去する（ここでは「バフィング」と呼ぶ）。鉗子とシリンジを使用して神経を含まないハイドラを強制送達するこの新しい方法は、手で引っ張ったマイクロピペットチップを用いた口のピペット操作の必要性を排除します。したがって、プロセスをより安全にし、大幅な時間効率化を実現します。下垂体内の神経細胞が確実に排除されるように、抗チロシン - チューブリンを用いた免疫組織化学を行う。

最初の8時間のコルヒチン処置の直後に、すべてのヒドラは生き残る。これらのHydraの一部は触手のスタブだけを残し（ 図3A ）、他の人は触手を完全になくします（ 図 3B ）。次の1〜2日間、触手はすべてのHydraが触手を紛失するまで収縮を続けます。治療から約1週間後、 Hydraは、触手...

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Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

コルヒチンによる二重治療により、分裂細胞を死滅させる植物由来の毒素である神経を含まないハイドラ尋常性疣贅が生成され得る。これらのヒドラは自分自身で食べることはできません。この論文では、研究室で神経フリーのヒドラ・ブルガリスの長期的な維持のための改善された方法について述べる。

神経フリーの生成と長期維持<em&gt;ヒドラ</em

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The ...

The overall goal of this procedure is to generate and efficiently maintain nerve-free hydra by manual force feeding and burping. This method can help answer key questions in the hydra field about the role of the nerve and various behaviors and biological processes. The main advantage of this technique is that it is simpler, safer and more time efficient than previously published protocols for feeding and burping.Using forceps to manipulate the hydra on the microscope can be difficult and frustrating at first, but it quickly gets easier with practice. Begin by adding Artemia cysts to a tall, narrow glass container that tapers at the bottom. Fill the container with Artemia water, taking care not to exceed one gram of cysts per one liter of water for a higher hatch yield.Cover the top of the container with parafilm and insert a 10 milliliter serological pipette through the parafilm, into the container. Taking care that the pipette tip reaches the bottom of the container. Attach a piece of tubing to an aquarium air pump, then fit the tubing around the pipette to provide air ration to the container.When the Artemia have hatched use an Artemia net to strain the shrimp from the culture and wash the animals for about 20 seconds in deionized water. At the end of the wash, transfer the Artemia into a dish with hydra medium. Under a stereo microscope, use a pair of fine forceps to euthanize the shrimp with light squeezing.Placing the freshly sacrificed Artemia close to the hydra to facilitate a fast feeding. Now grasp the first hydra by the foot with one pair of forceps and pinch the body of the hydra with a second pair of forceps to make the hydra contract. Tap the center of the hypostome to make the hydra open its mouth.If the mouth does not open, puncture the center of the hypostome with the forceps and slightly release the pressure on the tips to stretch out the mouth opening made by the puncture. Quickly insert as many Artemia as possible into the hydra's gastric cavity, until the cavity is full and no more Artemia can be inserted without damaging the hydra, accidentally pulling out any Artemia from inside the cavity or preventing the mouth from closing. If the mouth begins to close, stretch the mouth open with the forceps as just demonstrated, taking care that no Artemia already inside the animal, come out.If the hydra is too small for a whole Artemia, cut the shrimp with the scalpel and fit the hydra smaller pieces. If the Artemia does not stay inside the hydra, it maybe necessary to press the forceps against the Artemia, to hold the Artemia inside until the mouth closes. When all of the hydra have been fed, use a glass pasteur pipette to transfer the hydra into a dish with fresh hydra medium, supplemented with rifampicin, taking care to avoid accidental burping.Between eight and 20 hours after the feeding, use P320 or similar grid sandpaper, to smooth down the point of a 30 gauge hypothermic needle until the tip is flat. Attach the needle to a disposable one milliliter plastic syringe and fill the syringe with fresh rifampicin supplemented hydra medium. Place the hydra culture dish under the microscope and use fine forceps to hold the foot of the hydra.Tap at the center of the hypostome with the syringe needle. If the mouth doesn't open, insert forceps into the hypostome to open the mouth as just demonstrated. Next, use the syringe to very gently flush the medium into the gastric cavity, taking care not to blow away the hydra until all of the debris has been expelled.Then, use a glass pasteur pipette to transfer the burped hydra into a dish with fresh rifampicin supplemented hydra medium. Immediately following an initial eight hour culture treatment, all hydra survived. Some animals will have only tentacle stubs remaining, while others will have completely lost their tentacles.About one week following treatment, the hydra will demonstrate signs of small, stub-like tentacle regrowth before their eventual full regeneration, over the next seven days. After a second treatment, about 10%of the original number of animals that have undergone both treatments recover and grow to a size suitable for experimentation. Dual-treated hydra exhibit tentacles that appear thinner than those of untreated animals, have tissue that is more transparent and appear bloated due to the inability to open their mouths to relieve osmotic pressure.The nerve nets in the heads of untreated hydra display distinct fibers that radiate outward from the mouth, as well as obvious cell bodies. While the same fibers are absent in nerve-free hydra after double treatment with culturezine. Further co staining with DAPI reveals a reduced number of nuclei in nerve-free hydra compared to untreated controls, due to the loss of interstitial cell lineage cells induced by dual culture zine treatment.Once mastered, a single hydra feeding can be completed in under one minute if it is performed properly. After watching this video, you should have a good understanding of how to force feed and burp nerve-free hydra.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

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神経科学

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Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

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の長期カルシウムイメージングのためのアガロースマイクロチャンバー<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

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