Name: generation and long-term maintenance of nerve-free hydra
Uploaded: 2017-07-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra at JoVE.com

Yazarlar, şırınga ve iğne tekniğine uyum konusunda yardım için sinirsiz hayvanlar üretmek ve sürdürmek için orijinal protokol olan Bayan Rui Wang ile Bayan Danielle Hagstrom ve Dr. Rob Steele&#39;in görüşleri için Dr. Dick Campbell&#39;e (UC Irvine) teşekkür ederler. (UC Irvine) el yazması üzerine yorumlar. Bu çalışma RCSA ve NSF hibe CMMI-1463572 tarafından desteklenmiştir.

1. Çift Kolşisin Tedavisi <ol><li> Hydra medium 3 , 4 , 17&#39;de % 0.4 kolşisin (ağırlık / hacim) solüsyonu yapın. Dikkat: Kolşisin akut toksiktir, yutulduğunda ölümcüldür, genetik kusurlara neden olabilir ve göz hasarına neden olabilir. Tozu bir duman davlumbağında tutun ve eksiksiz Kişisel Koruyucu Donanım (PPE) giyin. </li><li> Karpitte oda sıcaklığında 8 saat süre...

<ol>
	<li>Bode, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interstitial+cell+lineage+of+Hydra:+a+stem+cell+system+that+arose+early+in+evolution.">The interstitial cell lineage of Hydra: a stem cell system that arose early in evolution.</a> J. Cell. Sci. 109, 1155-1164 (1996).</li><li>Hager, G., David, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+of+differentiated+nerve+cells+in+hydra+is+determined+by+precursor+migration.">Pattern of differentiated nerve cells in hydra is determined by precursor migration.</a> Development. 124, 569-576 (1997).</li><li>Campbell, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+Hydra+interstitial+and+nerve+cells+by+means+of+colchicine.">Elimination of Hydra interstitial and nerve cells by means of colchicine.</a> J. Cell. Sci. 21, 1-13 (1976).</li><li>Marcum, B. A., Campbell, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Hydra+lacking+nerve+and+interstitial+cells.">Development of Hydra lacking nerve and interstitial cells.</a> J. Cell. Sci. 29, 17-33 (1978).</li><li>Burns, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3H-colchicine+binding:+Failure+to+detect+any+binding+to+soluble+proteins+from+various+lower+organisms.">3H-colchicine binding: Failure to detect any binding to soluble proteins from various lower organisms.</a> Exp. Cell. Res. 81, 285-292 (1973).</li><li>Lee, H. -. T., Campbell, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Behavior+of+an+Intergeneric+Chimera+of+Hydra+(Pelmatohydra+oligactis+Interstitial+Cells+Hydra+attenuata+Epithelial+Cells).">Development and Behavior of an Intergeneric Chimera of Hydra (Pelmatohydra oligactis Interstitial Cells Hydra attenuata Epithelial Cells).</a> Biol. Bull. 157 (2), 288-296 (1979).</li><li>Novak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+Hydra+viridis+with+Nerve+Cells+and+No+Interstitial+Cells,+or+with+Neither+of+These+Cell+Types.">Preparing Hydra viridis with Nerve Cells and No Interstitial Cells, or with Neither of These Cell Types.</a> Hydra: Research Methods. , 295-297 (1983).</li><li>Wanek, N., Marcum, B. A., Lee, H. -. T., Chow, M., Campbell, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+hydrostatic+pressure+on+morphogenesis+in+nerve-free+Hydra.">Effect of hydrostatic pressure on morphogenesis in nerve-free Hydra.</a> J. Exp. Zool. 211, 275-280 (1980).</li><li>Minobe, S., Koizumi, O., Sugiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+cell+differentiation+in+nerve-free+tissue+of+epithelial+Hydra+from+precursor+cells+introduced+by+grafting.">Nerve cell differentiation in nerve-free tissue of epithelial Hydra from precursor cells introduced by grafting.</a> Dev. Biol. 172 (1), 170-181 (1995).</li><li>Miljkovic-Licina, M., Chera, S., Ghila, L., Galliot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Head+regeneration+in+wild-type+hydra+requires+de+novo+neurogenesis.">Head regeneration in wild-type hydra requires de novo neurogenesis.</a> Development. 134 (6), 1191-1201 (2007).</li><li>Wenger, Y., Buzgariu, W., Galliot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+neurogenesis+in+Hydra+leads+to+compensatory+regulation+of+neurogenic+and+neurotransmission+genes+in+epithelial+cells.">Loss of neurogenesis in Hydra leads to compensatory regulation of neurogenic and neurotransmission genes in epithelial cells.</a> Phil. Trans. R. Soc. B. 371 (20150040), (2015).</li><li>Campbell, R. D., Josephson, R. K., Schwab, W. E., Rushforth, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitability+of+nerve-free+Hydra.">Excitability of nerve-free Hydra.</a> Nature. 262, 388-390 (1976).</li><li>Takaku, Y., Hwang, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innexin+gap+junctions+in+nerve+cells+coordinate+spontaneous+contractile+behavior+in+Hydra+polyps.">Innexin gap junctions in nerve cells coordinate spontaneous contractile behavior in Hydra polyps.</a> Sci. Rep. 4 (3573), (2014).</li><li>Marcum, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+Epithelial+Hydra.">Culturing Epithelial Hydra.</a> Hydra: Research Methods. , 287-290 (1983).</li><li>David, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+method+for+maceration+of+Hydra+tissue.">A quantitative method for maceration of Hydra tissue.</a> Wilhelm Roux Arch. Entwickl. Mech. Org. 171, 259-268 (1973).</li><li>Gr&#246;ger, H., Schmid, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Larval+development+in+Cnidaria:+A+connection+to+Bilateria.">Larval development in Cnidaria: A connection to Bilateria.</a> Genesis. 29 (3), 110-114 (2001).</li><li>Lenhoff, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water,+Culture+Solutions,+and+Buffers.">Water, Culture Solutions, and Buffers.</a> Hydra: Research Methods. , 29-34 (1983).</li><li>Shenk, M. A., Bode, H. R., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Cnox-2,+a+HOM/HOX+homeobox+gene+in+hydra,+is+correlated+with+axial+pattern+formation.">Expression of Cnox-2, a HOM/HOX homeobox gene in hydra, is correlated with axial pattern formation.</a> Development. 117, 657-667 (1993).</li><li>B&#246;ttger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+Gene+Transfer+Contributed+to+the+Evolution+of+Extracellular+Surface+Structures:+The+Freshwater+Polyp+Hydra+Is+Covered+by+a+Complex+Fibrous+Cuticle+Containing+Glycosaminoglycans+and+Proteins+of+the+PPOD+and+SWT+(Sweet+Tooth)+Families.">Horizontal Gene Transfer Contributed to the Evolution of Extracellular Surface Structures: The Freshwater Polyp Hydra Is Covered by a Complex Fibrous Cuticle Containing Glycosaminoglycans and Proteins of the PPOD and SWT (Sweet Tooth) Families.</a> PLoS One. 7 (12), (2012).</li><li>King, R. S., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+protocol+for+enhanced+detection+of+gene+expression+in+the+planarian+Schmidtea+mediterranea.">In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea.</a> BMC Dev. Biol. 13 (8), (2013).</li></ol>

Hydra interstisyel hücreler, çift kolşisin tedavisi 3 , 4 ile ortadan kaldırılabilir. İlk tedaviyi izleyen günlerde, Hydra parçalarının deforme olmuş Hydra&#39;ya kaynaşmasını önlemek için bireysel Hydra arasındaki temastan kaçınmak önemlidir. Ayrıca, ilk tedaviyi takiben yiyebilen hayvanlar kaldırılmalıdır çünkü ikinci kolşisin tedavisi bu tür hayvanlardan kalan interstisyel hücreleri ortadan ka...

Hydra&#39;nın sinir sistemi, her iki epiteliyal doku katmanı 1 ile ilişkili sinir hücrelerinden oluşan bir sinir ağından oluşur. Sinir ağı hipostom ve pedunkülde yoğunlaşır ve vücut kolonu 2&#39;de daha az yoğun olur. Sinir hücreleri, sekresyon hücreleri, nematositleri, germ hücreleri ve nöronları oluşturan multipotent kök hücreler olan interstisyel kök hücrelerden kaynaklanır 1 . Bölücü hücreleri öldüren bitki kaynaklı bir toksin olan kolşisin 3 , 4 ile tedavi ederek Hydra vulgaris&#39;in interstisyel hücrelerini ortadan kaldırmak mümkündür. Kolşisin, diğer organizmalarda mikrotübül polimerizasyonunu inhibe ettiği tespit edilmesine rağmen, bir önceki çalışmada, tüm tedavi boyunca Hydra&#39;da mikrotübüllerin bulunduğunu ve bu da kolchisinin Hydra 3&#39;de bu şekilde davranmadığını ortaya koymuştur. Başka bir stUdy, Tetrahymena pyriformis, Zea mays, Chlamydomonas ve Schizosaccharomyces pombe gibi bazı organizmalarda kolşisin tübüline etkili bir şekilde bağlanmadığını ve bu farkı açıklayabileceğini önermektedir. Kolşisin tedavisi interstisyel hücrelerin endoderm epitel hücreleri 3 tarafından fagositozunu indükler ve böylece sinir hücreleri, bez hücreleri ve nematositlerden yoksun olan hayvanların yaratılmasına izin verir. İnterstisyel hücrelerin neden özellikle kolşisin tedavisine duyarlı olduğu belirsizdir. Hem post-mitotik interstisyel hücreler hem de interstisyel kök hücre dizisi hasar görmüş ve fagositozlanmış olduğu göz önüne alındığında, Campbell, kolşisin mitotik aktiviteyi doğrudan etkilemediği sonucuna varmıştır3. Özellikle, kolşisin tedavisi Hydra vulgaris&#39;de iyi işliyor ancak Hydra oligactis 6 gibi diğer türlerde de çalışmadığı gösterilmiştir . </Em&gt; Sinirsiz Hydra viridis 7&#39;yi üretmek için kolşisin ve hidroksiüre ile değiştirilmiş bir tedavi kullanılabilir. Sinirsiz Hidra (bazen &quot;epitel Hydra &quot; 8 olarak da ifade edilir) doku homeostazı ve rejenerasyonundaki interstisyel hücre soylarından bu özel hücre tiplerinin rollerini incelemek için yararlı bir araçtır. Hidra , sinir sistemi olmadan yaşayabilen, bilinen tek hayvan örneği olabilir. Sinirsiz Hidra , Hydra rejenerasyonunu, homeostazı ve davranışı düzenleyen sinir ağı rolünü kesmek için özellikle yararlı bir model olarak hizmet eder. Örneğin, interstisyel hücrelerin sinirsiz Hidra&#39;ya greft yoluyla verilmesi, sinir hücrelerinin farklılaşmasının karakterize edilmesi için oldukça bölgeye özel 9 sağlar . Dahası, sinirsiz Hydra yeniden üretebilir, çünküAlternatif, sinir sisteminden bağımsız rejenerasyon yolaklarının araştırılmasını mümkün kılmaktadır. Böyle bir örnek, vahşi tip Hydra&#39;da sinir sisteminde cnox-2 fonksiyonuna bağlı olduğu gösterilmiş olan apikal nevrojenez ve kafa oluşumudur, ancak sinirsiz Hydra&#39;da vazgeçilmez görünmektedir ve alternatif bir kafa rejenerasyon işlemi olabileceğini düşündürmektedir 10 . Sinirsiz Hidra ayrıca nörojenezin 11 kaybı sonrası epitel hücre ekspresyonunu ve nörojenik ve nörotransmisyon genlerinin düzenlenişini incelemek için kullanılmıştır. Sinirsiz Hidra spontan kontraksiyon patlamaları 12 göstermez, bu patlamaların sinir sistemi tarafından düzenlendiğini gösterir. Bununla birlikte, sinirsiz Hydra vücut sütununu forsepsle tutarak yanıt olarak kontrendikçe, mekanik uyarılara yanıt olarak daralmanın bağlanma yoluyla sağlandığını düşündürmektedirGh boşluk kavşakları, spontan kontraktil davranış ise sinir hücrelerindeki boşluk kavşaklarından geçerek sağlanır 13 . Sinirsiz Hidra ağızlarını yiyecek veya azalan glutatyon 3 ile birlikte açtığınızda açmaz; bu, duyusal nöronların gıdaların mevcudiyetini tespit etmek ve ağzın açılması için sinyal vermesi gerektiğini gösterir. Buna ek olarak sinir ağı, ozmotik basıncın algılanmasında bir rol oynuyor gibi görünmektedir, çünkü sinirsiz hayvanlar kendi ağızlarındaki açılma yoluyla iç hidrostatik basıncını özerk bir şekilde kontrol edememektedir, bu da karakteristik balon benzeri görünümünü 3 , 4&#39;e çıkarmaktadır ( Şekil 1B ). Sinirsiz Hidraktaki hidrostatik basıncın sık manuel deflasyonla düzenlenmesi hipostome ve vücut kolonunda bazı anormal morfolojilerin kaybına neden olmuştur. Bununla birlikte, kronik deflasyon büyümeye müdahale etmiştir.Tomurcuklanma ve doku organizasyonu 8 . Her ne kadar sinirsiz Hydra kendi başlarına beslenemez ve üreyemezse de, her hayvanı elle zorla besleyip burping ederek laboratuvarda süresiz olarak korumak mümkündür. Önceki yayınlar, sinirsiz Hydra&#39;nın zorla beslenmesi ve buruşturulması yöntemlerini tarif etmiştir, ancak bu protokoller elle uygun boyuta çekilmesi gereken mikropipet uçlarının yanı sıra pipete 14 boruyla bağlanmış bir ağızlığın kullanılmasıyla ilgilidir. Burada, daha basit, daha güvenli ve daha zamandan tasarruf sağlayan besleme ve burping yöntemi anlatılmıştır. Buna ek olarak, daha önceki çalışmalar, sabit hayvanların bireysel hücrelere ayrılması ve hücre morfolojisinin incelenmesi yoluyla 3 , 4 , 15 nolu sinir hücrelerinin yokluğunun kontrol edilmesini içermektedir. &#39;HHipostomda nöronların tükenmesini kontrol etmek için makulasyon için tamamlayıcı bir yöntem olarak alfa-tübülinin tirozin karboksil terminaline karşı bir monoklonal antikor ile immünohistokimya kullanılmıştır 13,16. Önceki çalışmalar, pedanküldeki nöronların da bu antikor 13 kullanılarak görselleştirilebileceğini göstermiştir, ancak bu nöronların yanı sıra vücut kolonundaki nöronların da bulunması daha zordur. İmmünohistokimya hipostomdaki sinir hücrelerinin yokluğunu teyit etmek için yeterlidir ve hücre tipi morfolojide uzmanlık gerektirmezken, interstisyel kök hücrelerin ve bu hücrelerin diğer türevlerinin yokluğunu kontrol etmek için kullanılamaz. Ayrışma ve hücre morfolojisi çalışmaları daha titizdir ve tedavinin her aşamasından sonra kalan her hücre türünün sayısal bir hesabını verebilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="663">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:303px;">Colchicine</td>
			<td style="width:75px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:119px;">227120010</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 ml Syringe</td>
			<td style="width:75px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">301025</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Brine Shrimp Eggs</td>
			<td style="width:75px;">Brine Shrimp Direct</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:167px;">Can be purchased locally</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Brine Shrimp Hatchery Dish</td>
			<td style="width:75px;">Brine Shrimp Direct</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">60 mm x 15 mm Petri Dish</td>
			<td style="width:75px;">Celltreat</td>
			<td style="width:119px;">229663</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">30 G x 3/4&#34; Hypodermic Needle</td>
			<td style="width:75px;">Covidien</td>
			<td style="width:119px;">1188830340</td>
			<td style="width:167px;">A 27G needle may also be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2 x Fine-tip Tweezers</td>
			<td style="width:75px;">Dumont</td>
			<td style="width:119px;">0109-5-PO</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Rifampicin</td>
			<td style="width:75px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">557303</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Goat anti-mouse lgG, Pab (HRP Conjugate)</td>
			<td style="width:75px;">Enzo</td>
			<td style="width:119px;">ADI-SAB-100-J</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:75px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP9703-100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scalpel</td>
			<td style="width:75px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-920A</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:75px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10437028</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td style="width:75px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS Tablets</td>
			<td style="width:75px;">MP Bio</td>
			<td style="width:119px;">2810305</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Monoclonal Anti-Tubulin, Tyrosine</td>
			<td style="width:75px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T9028</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:75px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D2650</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Hydrogen Peroxide</td>
			<td style="width:75px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">216763</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:75px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X - 100</td>
			<td style="width:75px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T9284</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tween 20</td>
			<td style="width:75px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P1379</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Urethane</td>
			<td style="width:75px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">U2500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Air Pump</td>
			<td style="width:75px;">Tetra</td>
			<td style="width:119px;">77846-00</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glass Pasteur Pipette</td>
			<td style="width:75px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">53283-916</td>
			<td style="width:167px;">Length of the pipet does not matter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">15 ml Tube</td>
			<td style="width:75px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">89039-670</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">P320 Sandpaper</td>
			<td style="width:75px;">3M</td>
			<td style="width:119px;">IBGABBV00397</td>
			<td style="width:167px;">Can be purchased at local home improvement store</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and long-term maintenance of nerve-free hydra

Hydra&#39;nın interstisyel hücre dizisi multipotent kök hücreler ve bunların türevlerini içerir: bez hücreleri, nematositleri, germ hücreleri ve sinir hücreleri. İnterstisyel hücreler bölme hücrelerini öldüren bitki kökenli bir toksin olan kolşisinle iki ardışık muamele ile ortadan kaldırılabilir, böylece interstisyel kök hücrelerden türetilen farklılaşmış hücrelerin yenilenme potansiyelini ortadan kaldırır. Bu, sinir hücrelerinden yoksun Hydra üretimini sağlar. Bir sinirsiz polip, ozmotik basıncı beslemek, beslemek veya düzenlemek için ağzını açamaz. Ancak bu tür hayvanlar düzenli olarak zorla beslenir ve buruşurlarsa hayatta kalabilir ve süresiz laboratuvarda kültürlenebilir. Sinir hücrelerinin olmaması sinir sisteminin hayvan davranışını ve yenilenmesini düzenleyen rolünü araştırmaya olanak tanır. Sinirsiz Hidra bakımı için önceden yayınlanmış protokoller, elle çekilen mikropipet ile ağız-pipetleme gibi eski tekniklereHydra&#39;yı beslemek ve temizlemek için ips. Burada, sinirsiz Hydra&#39;nın bakımı için geliştirilmiş bir protokol getirildi. İnce uçlu forseps ağzını açmaya zorlamak ve yeni öldürülen Artemia eklemek için kullanılır. Zorla beslemeyi takiben, hayvanın vücut boşluğu burada &quot;burping&quot; olarak anılacak olan, sindirilmemiş malzemenin çıkarılması için bir şırınga ve hipodermik iğne kullanılarak taze ortam ile yıkanır. Forseps ve şırınga yardımıyla sinirsiz Hydra&#39;yı kuvvetle besleyen ve buruşturan bu yeni yöntem, elle çekilen mikropipet uçları kullanarak ağız-pipetleme ihtiyacını ortadan kaldırır. Böylece işlem daha güvenli ve önemli ölçüde zaman kazandırır. Hipostomdaki sinir hücrelerinin ortadan kaldırılmasını sağlamak için, anti-tirosin-tubulin kullanılarak immünohistokimyasal işlem yapılır.

İlk 8 saatlik kolşisin tedavisinin hemen ardından, tüm Hydra hayatta kalır. Bu Hydra&#39;lardan bazıları sadece benekli tutacaklara sahip olacak ( Şekil 3 A ), diğerleri dokunaçlarını tamamen tükettiler ( Şekil 3 B ). Sonraki 1 veya 2 gün içinde, tüm Hydra&#39;nın elindeki dokunma duyularını kaybedene kadar dokunaçlar küçülmeye devam edecek. Ted...

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra at JoVE.com

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Bölücü hücreleri öldüren bitki kaynaklı bir toksin olan kolşisinle çift tedaviyle sinirsiz Hydra vulgaris üretilebilir. Bu Hydra tek başlarına beslenemez veya yemez. Bu yazıda, sinirsiz Hydra vulgaris&#39;in laboratuarda uzun süreli bakım için geliştirilmiş bir yöntem anlatılmaktadır.

Sinirsiz Kuşak ve Uzun Süreli Bakım<em&gt; Hydra</em

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The ...

The overall goal of this procedure is to generate and efficiently maintain nerve-free hydra by manual force feeding and burping. This method can help answer key questions in the hydra field about the role of the nerve and various behaviors and biological processes. The main advantage of this technique is that it is simpler, safer and more time efficient than previously published protocols for feeding and burping.Using forceps to manipulate the hydra on the microscope can be difficult and frustrating at first, but it quickly gets easier with practice. Begin by adding Artemia cysts to a tall, narrow glass container that tapers at the bottom. Fill the container with Artemia water, taking care not to exceed one gram of cysts per one liter of water for a higher hatch yield.Cover the top of the container with parafilm and insert a 10 milliliter serological pipette through the parafilm, into the container. Taking care that the pipette tip reaches the bottom of the container. Attach a piece of tubing to an aquarium air pump, then fit the tubing around the pipette to provide air ration to the container.When the Artemia have hatched use an Artemia net to strain the shrimp from the culture and wash the animals for about 20 seconds in deionized water. At the end of the wash, transfer the Artemia into a dish with hydra medium. Under a stereo microscope, use a pair of fine forceps to euthanize the shrimp with light squeezing.Placing the freshly sacrificed Artemia close to the hydra to facilitate a fast feeding. Now grasp the first hydra by the foot with one pair of forceps and pinch the body of the hydra with a second pair of forceps to make the hydra contract. Tap the center of the hypostome to make the hydra open its mouth.If the mouth does not open, puncture the center of the hypostome with the forceps and slightly release the pressure on the tips to stretch out the mouth opening made by the puncture. Quickly insert as many Artemia as possible into the hydra's gastric cavity, until the cavity is full and no more Artemia can be inserted without damaging the hydra, accidentally pulling out any Artemia from inside the cavity or preventing the mouth from closing. If the mouth begins to close, stretch the mouth open with the forceps as just demonstrated, taking care that no Artemia already inside the animal, come out.If the hydra is too small for a whole Artemia, cut the shrimp with the scalpel and fit the hydra smaller pieces. If the Artemia does not stay inside the hydra, it maybe necessary to press the forceps against the Artemia, to hold the Artemia inside until the mouth closes. When all of the hydra have been fed, use a glass pasteur pipette to transfer the hydra into a dish with fresh hydra medium, supplemented with rifampicin, taking care to avoid accidental burping.Between eight and 20 hours after the feeding, use P320 or similar grid sandpaper, to smooth down the point of a 30 gauge hypothermic needle until the tip is flat. Attach the needle to a disposable one milliliter plastic syringe and fill the syringe with fresh rifampicin supplemented hydra medium. Place the hydra culture dish under the microscope and use fine forceps to hold the foot of the hydra.Tap at the center of the hypostome with the syringe needle. If the mouth doesn't open, insert forceps into the hypostome to open the mouth as just demonstrated. Next, use the syringe to very gently flush the medium into the gastric cavity, taking care not to blow away the hydra until all of the debris has been expelled.Then, use a glass pasteur pipette to transfer the burped hydra into a dish with fresh rifampicin supplemented hydra medium. Immediately following an initial eight hour culture treatment, all hydra survived. Some animals will have only tentacle stubs remaining, while others will have completely lost their tentacles.About one week following treatment, the hydra will demonstrate signs of small, stub-like tentacle regrowth before their eventual full regeneration, over the next seven days. After a second treatment, about 10%of the original number of animals that have undergone both treatments recover and grow to a size suitable for experimentation. Dual-treated hydra exhibit tentacles that appear thinner than those of untreated animals, have tissue that is more transparent and appear bloated due to the inability to open their mouths to relieve osmotic pressure.The nerve nets in the heads of untreated hydra display distinct fibers that radiate outward from the mouth, as well as obvious cell bodies. While the same fibers are absent in nerve-free hydra after double treatment with culturezine. Further co staining with DAPI reveals a reduced number of nuclei in nerve-free hydra compared to untreated controls, due to the loss of interstitial cell lineage cells induced by dual culture zine treatment.Once mastered, a single hydra feeding can be completed in under one minute if it is performed properly. After watching this video, you should have a good understanding of how to force feed and burp nerve-free hydra.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

C. elegans Pozitif bütanon Öğrenme, Kısa vadeli ve uzun vadeli ilişkilendirilebilir Bellek Tahliller

The memory of experiences and learned information is critical for organisms to make choices that aid their survival. C. elegans navigates its environment ...

Nörobilim

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

Fare Beyin Uzun vadeli Görüntüleme için Parlak ve Takviyeli inceltilmiş-kafatası Pencere

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Uzun vadeli Olfaktör İntibak A Moleküler Saati<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation

Uzun vadeli potansiyelize bir çok Kararlı ve tekrarlanabilir Kayıt için geliştirilmiş Hazırlık ve Hipokampal Fare Dilimleri korunması

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory ...

Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish

Serbestçe Yüzme Zayıf Elektrik Balık Uzun vadeli Davranış Takip

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and ...

Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees

Davranan Bal arısı iki nöronal İşleme Dönemlerinde Eşzamanlı Uzun vadeli Kayıtlar

In both mammals and insects neuronal information is processed in different higher and lower order brain centers. These centers are coupled via convergent ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Fare Koklear Eksplantlarından uzun vadeli Time Lapse Görüntüleme

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Embriyonik Kemirgen Brain itibaren İlköğretim Mesensefalik dopaminerjik Nöronlar İzolasyonu, Kültür ve Uzun Vadeli Bakım

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Uzun süreli Kalsiyum Görüntüleme için Agaroz microchambers<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture

Ultra Düşük Yoğunluk için Basitleştirilmiş Bir Yöntem, Uzun Vadeli İlköğretim Hipokampal Nöron Kültürü

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic ...