Name: in situ mhc-tetramer staining and quantitative analysis to determine the location, abundance, and phenotype of antigen-specific cd8 t cells in tissues
Uploaded: 2017-09-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues at JoVE

Diese Arbeit wurde unterstützt von Public Health Service Zuschüsse aus dem National Institutes of Health (T32 DA007097, R01AI096966, andUM1AI26617).

1. 1. Tag: frisches Gewebe schneiden und primäre Inkubation <ol><li>Verwendung eines Skalpells frische Gewebe in kleine (ca. 0,5 cm breit von 0,5 cm groß) Stücke schneiden. Separat kleben Sie jedes Gewebe, einem Kolben und eingebettet in PBS mit 3-5 mL 4 % Low-Melt Agarose. Kennzeichnen Sie den Kolben mit der Gewebe-Informationen mit einem Aufkleber. Legen Sie es in ein gekühltes Halter in einem Eiskübel zu festigen.</li>
	<li>Schalten Sie das Mikrotom und setzen die Dicke der Querschnitte 200 µm. Installation e...

<ol>
	<li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes.">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274 (5284), 94-96 (1996).</li><li>Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+Class+II+tetramers+identify+peptide-specific+human+CD4(+)+T+cells+proliferating+in+response+to+influenza+A+antigen.">MHC Class II tetramers identify peptide-specific human CD4(+) T cells proliferating in response to influenza A antigen.</a> J Clin Invest. 104, R63-R67 (1999).</li><li>Steinert, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+memory+CD8+T+cells+reveals+regionalization+of+immunosurveillance.">Quantifying memory CD8 T cells reveals regionalization of immunosurveillance.</a> Cell. 161 (4), 737-749 (2015).</li><li>Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+In+situ+tetramer+staining+of+antigen-specific+T+cells+in+tissues.">Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues.</a> J Immunol. 165 (2), 613-617 (2000).</li><li>Haanen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+detection+of+virus-+and+tumor-specific+T-cell+immunity.">In situ detection of virus- and tumor-specific T-cell immunity.</a> Nat Med. 6 (9), 1056-1060 (2000).</li><li>Skinner, P. J., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+tetramer+staining+using+MHC+class+I+tetramers.">In situ tetramer staining using MHC class I tetramers.</a> J Immunol Methods. 268 (1), 29-34 (2002).</li><li>Skinner, P. J., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+staining+using+MHC+class+I+tetramers.">In situ staining using MHC class I tetramers.</a> Curr Protoc Immunol. 17, 4.1-4.9 (2004).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+HLA-DR*08032/E7+and+HLA-DR*0818/E7+tetramers+in+tracking+of+epitope-specific+CD4++T+cells+in+active+and+convalescent+tuberculosis+patients+compared+with+control+donors.">Use of HLA-DR*08032/E7 and HLA-DR*0818/E7 tetramers in tracking of epitope-specific CD4+ T cells in active and convalescent tuberculosis patients compared with control donors.</a> Immunobiology. 216, 947-960 (2011).</li><li>Bischof, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+autoreactive+CD4+T+cells+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+after+primary+and+secondary+challenge+using+MHC+class+II+tetramers.">Analysis of autoreactive CD4 T cells in experimental autoimmune encephalomyelitis after primary and secondary challenge using MHC class II tetramers.</a> J Immunol. 172, 2878-2884 (2004).</li><li>Massilamany, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+staining+with+major+histocompatibility+complex+class+II+dextramers+permits+detection+of+antigen-specific,+autoreactive+CD4+T+cells+in+situ.">Direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers permits detection of antigen-specific, autoreactive CD4 T cells in situ.</a> PLoS ONE. 9, e87519 (2014).</li><li>Massilamany, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+detection+of+autoreactive+CD4+T+cells+in+brain+and+heart+using+major+histocompatibility+complex+class+II+dextramers.">In situ detection of autoreactive CD4 T cells in brain and heart using major histocompatibility complex class II dextramers.</a> J Vis Exp. (90), e51679 (2014).</li><li>Dileepan, T., Kim, H. O., Cleary, P. P., Skinner, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Situ+Peptide-MHC-II+Tetramer+Staining+of+Antigen-Specific+CD4++T+Cells+in+Tissues.">In Situ Peptide-MHC-II Tetramer Staining of Antigen-Specific CD4+ T Cells in Tissues.</a> PLoS ONE. 10 (6), e0128862 (2015).</li><li>Tjernlund, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+detection+of+Gag-specific+CD8++cells+in+the+GI+tract+of+SIV+infected+Rhesus+macaques.">In situ detection of Gag-specific CD8+ cells in the GI tract of SIV infected Rhesus macaques.</a> Retrovirology. 7, 7-12 (2010).</li><li>Connick, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTL+fail+to+accumulate+at+sites+of+HIV-1+replication+in+lymphoid+tissue.">CTL fail to accumulate at sites of HIV-1 replication in lymphoid tissue.</a> J Immunol. 178, 6975-6983 (2007).</li><li>Hong, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+Populations+of+CD8low/&#8722;+MHC+Class+I+Tetramer++SIV-Specific+T+Cells+in+Lymphoid+Follicles+and+Genital+Epithelium.">Localized Populations of CD8low/&#8722; MHC Class I Tetramer+ SIV-Specific T Cells in Lymphoid Follicles and Genital Epithelium.</a> PLoS ONE. 4 (1), e4131 (2009).</li><li>Sasikala-Appukuttan, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+and+dynamics+of+the+immunodominant+CD8+T+cell+response+to+SIV&#916;nef+immunization+and+SIVmac251+vaginal+challenge.">Location and dynamics of the immunodominant CD8 T cell response to SIV&#916;nef immunization and SIVmac251 vaginal challenge.</a> PLoS ONE. 8 (12), e81623 (2013).</li><li>Connick, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+of+simian+immunodeficiency+virus+replication+within+secondary+lymphoid+tissues+of+rhesus+macaques+is+linked+to+disease+stage+and+inversely+related+to+localization+of+virus-specific+CTL.">Compartmentalization of simian immunodeficiency virus replication within secondary lymphoid tissues of rhesus macaques is linked to disease stage and inversely related to localization of virus-specific CTL.</a> J Immunol. 193, 5613-5625 (2014).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+antigen-specific+and+infected+cells+in+situ+predicts+outcomes+in+early+viral+infection.">Visualizing antigen-specific and infected cells in situ predicts outcomes in early viral infection.</a> Science. 323, 1726-1729 (2009).</li><li>Li, Q., Skinner, P. J., Duan, L., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+technique+to+simultaneously+visualize+virus-specific+CD8++T+cells+and+virus-infected+cells+in+situ.">A technique to simultaneously visualize virus-specific CD8+ T cells and virus-infected cells in situ.</a> J Vis Exp. (30), e1561 (2009).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simian+immunodeficiency+virus-producing+cells+in+follicles+are+partially+suppressed+by+CD8++cells+in+vivo.">Simian immunodeficiency virus-producing cells in follicles are partially suppressed by CD8+ cells in vivo.</a> J Virol. 90, 11168-11180 (2016).</li><li>Daniels, M. A., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+for+CD8+in+T+cell+receptor+binding+and+activation+by+peptide/major+histocompatibility+complex+multimers.">Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers.</a> J Exp Med. 191, 335-346 (2000).</li><li>Lee, Y. J., Wang, H., Starrett, G. J., Phuong, V., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+specific+distribution+of+iNKT+cells+impacts+their+cytokine+response.">Tissue specific distribution of iNKT cells impacts their cytokine response.</a> Immunity. 43 (3), 566-578 (2015).</li><li>Abdelaal, H. M., Kim, H. O., Wagstaff, R., Sawahata, R., Southern, P. J., Skinner, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Vibratome+and+Compresstome+sectioning+of+fresh+primate+lymphoid+and+genital+tissues+for+in+situ+MHC-tetramer+and+immunofluorescence+staining.">Comparison of Vibratome and Compresstome sectioning of fresh primate lymphoid and genital tissues for in situ MHC-tetramer and immunofluorescence staining.</a> Biol Proced Online. 17, (2015).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).</li></ol>

IST in Kombination mit IHC stellt ein wesentliches Instrument für die Erkennung, Charakterisierung und Quantifizierung der Antigen-spezifische CD8 T-Zellen in nativen Umgebungen mit dem Kontext von anderen Zellen und Gewebestrukturen. Hier beschrieben wir detaillierte Verfahren für IST kombiniert mit IHC, gefolgt von quantitativen Bildanalyse zu bestimmen, die Lage, die Fülle und den Phänotyp der Antigen-spezifische CD8 T-Zellen in den Lymphknoten von Rhesus-Makaken. Ähnliche Färbung kann für Mensch, Maus oder and...

T-Zellen sind entscheidend für viele immunologische Prozesse, einschließlich der Erkennung und Beseitigung von Virus-infizierten Zellen, verhindert Autoimmunität, Unterstützung bei der B-Zellen und Plasma-Zelle Produktion von Antikörpern und Aufspüren und eliminieren von Krebszellen. Die Entwicklung von Peptid/MHC Klasse I Tetramer Färbung des Antigen-spezifische CD8 T-Zellen1 und die neuere Entwicklung der MHC Klasse II Tetramer Färbung von CD4-T-Zellen-2 durch Durchflusszytometrie revolutioniert unsere Fähigkeit zu studieren und zu verstehen, die Immunbiologie der T-Zellen. Während äußerst nützlich für die Bestimmung der Menge und der Phänotyp der antigenspezifischen T-Zellen, lässt die Durchflusszytometrie nicht für den Nachweis von räumliche Lokalisation der antigenspezifischen T-Zellen auf andere Zellen und Strukturen in den Geweben, und aktuelle Disaggregation Techniken, die T-Zellen zu extrahieren benötigt für Durchflusszytometrie Wirksamkeit in nicht-lymphatischen Gewebe3begrenzt haben.
Wir und andere entwickelten Methoden mit Peptid beladenen MHC Klasse I und Klasse II Tetramer oder Multimer Reagenzien, Antigen-spezifische CD8 und CD4-T-Zellen im Gewebe4,5,6,7, beflecken 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. these IST Methoden ermöglichen die Bestimmung der Lage, die Fülle und den Phänotyp der Antigen-spezifische CD8 und CD4-T-Zellen in den Geweben und bieten eine Möglichkeit, diese Zellen im Vergleich zu anderen Zellen und Strukturen im Gewebe zu erkennen. Unsere Fraktion wird intensiv genutzt, MHC-ich Tetramer beflecken, zum studieren Human Immunodeficiency Virus (HIV)- und simian Immunodeficiencyvirus (SIV) - spezifischen CD8 T-Zellen im lymphatischen, genitalen und rektalen Gewebe um ein Verständnis von HIV und SIV Immunpathogenese und Korrelate des erfolgreichen Impfung Strategien14,15,16,17zu identifizieren. Darüber hinaus entwickelten wir auch eine Technik, die kombiniert IST mit in Situ Hybridisierung (ISH) zu lokalisieren und zu quantifizieren, Virus-spezifischen CD8 T-Zellen und Virus-infizierten Zellen in Geweben und zu bestimmen, die in Vivo -Effektor-zu-Zielwerte 18 , 19.
Hier beschreiben wir ein Protokoll mit Peptid beladenen MHC-ich Tetramers Antigen-spezifische CD8 T-Zellen in frischen Gewebeschnitten zu Gegenfärbung Gewebe mit IHC beflecken und Zellen mit bestimmten Phänotypen in bestimmte Gewebe Fächer zu quantifizieren. Diese Verfahren sind die gleichen wie in unseren kürzlich erschienenen Publikation von Li Et Al., verwendet wurden, in denen wir die Lage, der Fülle und der Phänotyp der SIV-spezifische T-Zellen im lymphatischen Gewebe während chronische SIV-Infektion bei Makaken20bestimmt.
Für dieses Verfahren sind frische Gewebe geschnitten und über Nacht inkubiert mit Peptid beladenen MHC-ich Tetramers konjugiert zu Fluorescein Thiocyanat Moleküle (FITC). Sie sind dann in Paraformaldehyd fixiert. Nach der Fixierung des Gewebes, ist das Signal von der MHC-Tetramers verstärkt mit Kaninchen Anti-FITC Antikörper und inkubiert mit Gewebekulturen tagged Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper, die das Signal von der gebundenen Tetramers weiter zu verstärken. IHC dient in Verbindung mit IST Antigen-spezifische T-Zellen und umgebenden Zellen zu charakterisieren. Antikörper, die Epitope auf der Oberfläche von Zellen oder in den Extrazellulärraum zu erkennen sind in der primären Inkubation mit dem Tetramers enthalten. Antikörper, die intrazellulären Epitope erkennen erfordern Durchdringung der Zellwand vor dem beflecken. Die gefärbten Gewebeschnitten sind abgebildet mit einem konfokalen Mikroskop und mittels konfokale Software analysiert. Markierte Zellen werden mit der konfokalen Mikroskopie Software oder ImageJ quantifiziert. Das beschriebene Protokoll kann verwendet werden, um im wesentlichen Antigen-spezifische CD8 T-Zellen in jedem Gewebe für die MHC färben-ich Tetramers stehen zur Verfügung.

<table align="center" border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:906px;" width="906">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MHC-I monomer</td>
			<td>NIH tetramer core facility</td>
			<td></td>
			<td>Materials for MHC-tetramer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExtrAvidin-FITC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E2716</td>
			<td>Materials for MHC-tetramer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melt agarose</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLBL6391V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-6878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>4204-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol/gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLBH2672V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-propyl gallate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rat-a-h-CD8 (1:500)</td>
			<td>Acris</td>
			<td>0714</td>
			<td>Antibody unstable, use single use frozen aliquot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>m-a-h-CD20 (1:500)</td>
			<td>NOVOCASTRA</td>
			<td>6026819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>m-a-h-Ki67 (1:500)</td>
			<td>Vector</td>
			<td>6022201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat-a-m-A488 (1:2000)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>124083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat-a-rb-Cy3 (1:5000)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>106232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat-a-rat-Cy5 (1:5000)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>118088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat-a-h-IgM-Dylight649 (1:5000)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>86579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compresstome: VF-300 Microtome</td>
			<td>Precisionary Instruments, LLC</td>
			<td>1079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Set Instant Adhesive</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>46551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well flat bottomed tissue culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Globe scienfitic Inc.</td>
			<td>#1321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor&#160; blade</td>
			<td>Ted Pella, Inc</td>
			<td>121-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather Disposable Scalpel</td>
			<td>FEATHER SAFETY RAZOR CO. LTD.</td>
			<td>No. 21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round paintbrush #2</td>
			<td>PRINCETON ART &#38; BRUSH CO.</td>
			<td>4350R</td>
			<td>Can trim as needed with razor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FV10-ASW_Viewer4.0</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ mhc-tetramer staining and quantitative analysis to determine the location, abundance, and phenotype of antigen-specific cd8 t cells in tissues

T-Zellen sind entscheidend für viele immunologische Prozesse, einschließlich der Erkennung und Beseitigung von Virus-infizierten Zellen, verhindert Autoimmunität, Unterstützung bei der B-Zellen und Plasma-Zelle Produktion von Antikörpern und Aufspüren und eliminieren von Krebszellen. Die Entwicklung der MHC-Tetramer Färbung von antigenspezifischen T-Zellen durch Durchflusszytometrie analysiert revolutioniert unsere Fähigkeit zu untersuchen und verstehen die Immunbiologie der T-Zellen. Während äußerst nützlich für die Bestimmung der Menge und der Phänotyp der antigenspezifischen T-Zellen, bestimmen nicht Durchflusszytometrie die räumliche Lokalisation der antigenspezifischen T-Zellen auf andere Zellen und Strukturen im Gewebe und aktuellen Disaggregation Techniken. zum Extrahieren der T benötigt Zellen für Durchflusszytometrie Wirksamkeit in nicht-lymphatischen Geweben eingeschränkt haben. In situ MHC-Tetramer Färbung (IST) ist eine Technik, T-Zellen zu visualisieren, die spezifisch für Antigene von Interesse im Gewebe sind. In Kombination mit Immunhistochemie (IHC) bestimmen IST die Fülle, Standort und Phänotyp der Antigen-spezifische CD8 und CD4-T-Zellen in den Geweben. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um Flecken und Antigen-spezifischen CD8 T-Zellen, mit bestimmten Phänotypen befindet sich in bestimmte Gewebe Fächer aufzählen. Diese Verfahren sind die gleichen, die wir in unserem kürzlich erschienenen Publikation von Li Et Al., unter dem Titel verwendet "Simian Immunodeficiency Virus-produzierenden Zellen im Follikel werden teilweise unterdrückt durch CD8 Zellen+ In Vivo." Die beschriebenen Methoden sind breit anwendbar, weil sie verwendet werden, können um zu lokalisieren, Phänotyp, und im wesentlichen Antigen-spezifischen CD8 T Zelle für die MHC-Tetramers in jedem Gewebe vorliegen, zu quantifizieren.

Abbildung 1 veranschaulicht die konfokale Bilder mit einem konfokalen Mikroskop zu sammeln. Abbildung 2 veranschaulicht quantitative Bildanalyse mit ImageJ. Abbildungen 3 und 4 zeigen Vertreter, dass Bilder von Lymphknoten Gewebe aus einem SIV Rhesus-Makaken gebeizt mit MHC Tetramers, CD8-Antikörper und CD20-Antikörper infiziert, und dienen dazu, die Spezifität der MHC-Tetramer Färbung zeigen...

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In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

Hier beschreiben wir eine Methode, die kombiniert in Situ MHC-Tetramer Färbung mit Immunohistochemistry, Lokalisierung, Phänotyp und Menge an Antigen-spezifische T-Zellen im Gewebe zu bestimmen. Dieses Protokoll wird verwendet, um die räumliche und phänotypischen Merkmale der Antigen-spezifische CD8 T-Zellen im Vergleich zu anderen Zelltyp und Strukturen im Gewebe zu bestimmen.

In Situ MHC-Tetramer Färbung und Quantitative Analyse zur Bestimmung der Lage, Fülle und Phänotyp der Antigen-spezifische CD8-T-Zellen in den Geweben

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...

The overall goal of this procedure is to determine the location, abundance and phenotype of antigen-specific CD8 positive T cells within tissues of interest. This method helps answer quick questions about CD8 T cells by providing a means to locate, quantify and phenotype virtually any antigen specific CD8 T cell and any tissue. The main advantage of this technique is that it allows determination of the spatial distribution of antigen specific CD8 positive T cells relative to other cells and structures within tissues of interest.Demonstrating the procedure with Shengbin Li will be Gwantwa Mwakalundwa. On the day one of the procedure, use a scalpel to cut the fresh tissue into approximately 0.5 x 0.5 centimeter pieces. Here, rhesus macaque spleen tissue is shown.Separately glue each tissue fragment into the middle of the top of a plunger and embed the samples in three to five milliliters of warm 4%low melting agarose in PBS. Label the plungers with the relevant tissue information. Then, place the samples in a chilled holder in an ice bucket.When the agar has solidified, turn on the microtome and set the thickness setting to 200 micrometers. After installing a new razor blade, insert the plungers into the microtome bath. Fill the microtome bath with 100 to 200 milliliters of freshly prepared PBS-H and add PBS-H ice cubes to maintain the temperature between zero to two degrees celsius.After obtaining 200 micrometer sections, use a paintbrush to remove the agar surrounding each section and transfer the samples into individual tissue chambers within individual wells of a 24 well tissue culture plate containing one milliliter of chilled PBS-H. When all of the samples have been acquired, incubate the tissue sections overnight in one milliliter of fit conjugated peptide loaded MHC class one tetramers, diluted in PBS-H supplemented with 2%normal goat serum at four degree celsius with rocking. The following morning, transfer each tissue chamber into individual wells of a new 24 well plate containing one milliliter of fresh chilled PBS-H for 20 minutes.After the second wash, fix the sections in one milliliter of fresh 4%paraformaldehyde for two hours at room temperature. Followed by two five minute washes in cold PBS-H. Transfer the sections into a new 24 well plate containing 0.01 molar urea and microwave the sections three times for about 10 seconds each time until the urea boils.To permeabilize and block the samples, incubate the sections in blocking solution containing PBS-H supplemented with a 0.3%triton x100 detergent and 2%normal goat serum on a rocker for one hour, at four degree celsius. At the end of the incubation, transfer the tissue chambers into individual wells of a new 24 well plate containing one milliliter of solution containing rabbit anti-fitc antibody, mouse antihuman CD antibody and rat antihuman CD3 antibody. Incubate the samples overnight at four degrees celsius with rocking.On day three, wash the sections three times in fresh PBS-H at four degree celsius for at least 20 minutes per wash and perform a final incubation with the appropriate fluorescence conjugated secondary antibodies for up to three days, protected from light. At the end of the tertiary antibody incubation, rinse the samples with three 20 minute washes in fresh PBS-H and use a paint brush to transfer the samples from each tissue chamber onto a glass microscope slide. Coat each section with mounting medium supplemented with a fluorophore preservative and cover the samples with a cover slip.Then, store the slides in a light protected slide container, at 20 degrees celsius. On the day of imaging, place the first slide onto the stage of a confocal microscope and select the appropriate lasers and filters for each fluorophore used to label the tissue sample. Using the 20x objective, sequentially obtain a z series at three micron intervals in each of the fluorophore channels, in multiple 800 x 800 pixel fields.Then, construct a montage of the collected fields and save each montage image with a name based on the corresponding tissue sample. In these representative images, a section stained with MHC class one tetramers loaded with an SIV peptide is compared to a section from the same tissue, stained with MHC class one tetramers loaded with an irrelevant peptide, demonstrating the specificity of the tetramer staining. In these images, the virus specific T cells stained with MHC class one tetramer loaded with SIV peptide, co-stains for CD8, a T cell subset marker but not CD20, a cell surface protein expressed on B cells.This montage was created for multiple confocal z series fields, that were used for the quantification of tetramer stained cells with specific phenotypes and different anatomical compartments on the lymph node. This magnified image highlights an area of the montage lymph node that contains a B cell follicle delineated by IGM staining. MHC class one tetramer stained cells, some of which co-expressed the T cell activation and proliferation marker, KI67 can be detected inside and outside of B cell follicle.This staining combination allows the determination of the activation and proliferation statuses of SIV specific CD8 positive T cells, as well as their localisation within secondary lymphoid tissues. Once mastered, this technique can be completed in approximately five days if it is performed properly. While attempting this procedure, it's important to remember that fresh tissue is critical for successful staining.Process the samples within 24 hours or less after harvesting, keeping them chilled until fixation. After watching this video, you should have a good understanding of how to perform a tetramer staining and immunohistochemistry to determine the location, abundance and phenotype of antigen specific CD8 positive T cells in tissues of interest. Don't forget that working with infectious agents can be extremely hazardous and that precautions to prevent exposure such as, wearing the appropriate personal protection equipment and limiting the use of sharps should always be taken while performing this procedure.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Retrovirale Transduktion von T-Zell-Rezeptoren in Maus-T-Zellen

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Künstliche Antigen-präsentierenden Zellen (KaAPC) für effiziente<em&gt; In-vitro-</em&gt; Depletion von humanen Antigen-spezifischen T-Zellen

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Whole-Tier Imaging und Fließzytometrieverfahren zur Analyse von Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellantworten nach der Nanopartikel-Impfung

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophilen-Isolierung und Analyse zur Bestimmung ihrer Rolle in der Lymphom-Zellempfindlichkeit therapeutische Mittel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Entwicklung von Stammzellen abgeleiteten Antigen-spezifische regulatorische T-Zellen gegen Autoimmunität

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-spezifischen CD8<sup&gt; +</sup&gt; T-Zellen in Rhesusaffen von Peptid-MHC-I Tetramerfärbung

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

Detektion und Anreicherung von Rare Antigen-spezifische B-Zellen für die Analyse von Phänotypen und Funktion

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Test zum Nachweis von Antigen-spezifischen T-Zell Zytolyse-Funktion mit einer Impfung-Modell

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Metabolic Mapping: Quantitative Enzyme Cytochemistry and Histochemistry to Determine the Activity of Dehydrogenases in Cells and Tissues

Metabolische Mapping: Quantitative Enzym Cytochemistry und Histochemie die Aktivität des Dehydrogenases in Zellen und Geweben zu bestimmen

Altered cellular metabolism is a hallmark of many diseases, including cancer, cardiovascular diseases and infection. The metabolic motor units of cells ...

High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

Hocheffiziente Generierung von Antigen-spezifischen primären Maus-Zytotoxischen T-Zellen für Funktionstests in einem Autoimmun-Diabetes-Modell

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...