Name: in situ mhc-tetramer staining and quantitative analysis to determine the location, abundance, and phenotype of antigen-specific cd8 t cells in tissues
Uploaded: 2017-09-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues at JoVE

עבודה זו נתמכה על ידי שירותי הבריאות הציבוריים מעניקה מ מכוני הבריאות הלאומיים (T32 DA007097, R01AI096966, andUM1AI26617).

1. יום 1: חלוקתה רקמות טריים, הדגירה העיקרי <ol><li>שימוש באזמל כדי טריים רקמות לחתוך לחתיכות קטנות (כ 0.5 ס מ בגובה 0.5 ס מ). בנפרד דבק כל רקמה פומפה, להטביע אותם עם 3-5 מ של agarose נמוך-להמיס 4% ב- PBS. תווית על הבוכנה עם המידע רקמות באמצעות מדבקה. תכניס אותו בעל צונן בתוך דלי קרח שבמהלכו.</li>
	<li>להפעיל את מיק...

<ol>
	<li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes.">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274 (5284), 94-96 (1996).</li><li>Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+Class+II+tetramers+identify+peptide-specific+human+CD4(+)+T+cells+proliferating+in+response+to+influenza+A+antigen.">MHC Class II tetramers identify peptide-specific human CD4(+) T cells proliferating in response to influenza A antigen.</a> J Clin Invest. 104, R63-R67 (1999).</li><li>Steinert, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+memory+CD8+T+cells+reveals+regionalization+of+immunosurveillance.">Quantifying memory CD8 T cells reveals regionalization of immunosurveillance.</a> Cell. 161 (4), 737-749 (2015).</li><li>Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+In+situ+tetramer+staining+of+antigen-specific+T+cells+in+tissues.">Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues.</a> J Immunol. 165 (2), 613-617 (2000).</li><li>Haanen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+detection+of+virus-+and+tumor-specific+T-cell+immunity.">In situ detection of virus- and tumor-specific T-cell immunity.</a> Nat Med. 6 (9), 1056-1060 (2000).</li><li>Skinner, P. J., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+tetramer+staining+using+MHC+class+I+tetramers.">In situ tetramer staining using MHC class I tetramers.</a> J Immunol Methods. 268 (1), 29-34 (2002).</li><li>Skinner, P. J., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+staining+using+MHC+class+I+tetramers.">In situ staining using MHC class I tetramers.</a> Curr Protoc Immunol. 17, 4.1-4.9 (2004).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+HLA-DR*08032/E7+and+HLA-DR*0818/E7+tetramers+in+tracking+of+epitope-specific+CD4++T+cells+in+active+and+convalescent+tuberculosis+patients+compared+with+control+donors.">Use of HLA-DR*08032/E7 and HLA-DR*0818/E7 tetramers in tracking of epitope-specific CD4+ T cells in active and convalescent tuberculosis patients compared with control donors.</a> Immunobiology. 216, 947-960 (2011).</li><li>Bischof, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+autoreactive+CD4+T+cells+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+after+primary+and+secondary+challenge+using+MHC+class+II+tetramers.">Analysis of autoreactive CD4 T cells in experimental autoimmune encephalomyelitis after primary and secondary challenge using MHC class II tetramers.</a> J Immunol. 172, 2878-2884 (2004).</li><li>Massilamany, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+staining+with+major+histocompatibility+complex+class+II+dextramers+permits+detection+of+antigen-specific,+autoreactive+CD4+T+cells+in+situ.">Direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers permits detection of antigen-specific, autoreactive CD4 T cells in situ.</a> PLoS ONE. 9, e87519 (2014).</li><li>Massilamany, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+detection+of+autoreactive+CD4+T+cells+in+brain+and+heart+using+major+histocompatibility+complex+class+II+dextramers.">In situ detection of autoreactive CD4 T cells in brain and heart using major histocompatibility complex class II dextramers.</a> J Vis Exp. (90), e51679 (2014).</li><li>Dileepan, T., Kim, H. O., Cleary, P. P., Skinner, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Situ+Peptide-MHC-II+Tetramer+Staining+of+Antigen-Specific+CD4++T+Cells+in+Tissues.">In Situ Peptide-MHC-II Tetramer Staining of Antigen-Specific CD4+ T Cells in Tissues.</a> PLoS ONE. 10 (6), e0128862 (2015).</li><li>Tjernlund, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+detection+of+Gag-specific+CD8++cells+in+the+GI+tract+of+SIV+infected+Rhesus+macaques.">In situ detection of Gag-specific CD8+ cells in the GI tract of SIV infected Rhesus macaques.</a> Retrovirology. 7, 7-12 (2010).</li><li>Connick, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTL+fail+to+accumulate+at+sites+of+HIV-1+replication+in+lymphoid+tissue.">CTL fail to accumulate at sites of HIV-1 replication in lymphoid tissue.</a> J Immunol. 178, 6975-6983 (2007).</li><li>Hong, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+Populations+of+CD8low/&#8722;+MHC+Class+I+Tetramer++SIV-Specific+T+Cells+in+Lymphoid+Follicles+and+Genital+Epithelium.">Localized Populations of CD8low/&#8722; MHC Class I Tetramer+ SIV-Specific T Cells in Lymphoid Follicles and Genital Epithelium.</a> PLoS ONE. 4 (1), e4131 (2009).</li><li>Sasikala-Appukuttan, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+and+dynamics+of+the+immunodominant+CD8+T+cell+response+to+SIV&#916;nef+immunization+and+SIVmac251+vaginal+challenge.">Location and dynamics of the immunodominant CD8 T cell response to SIV&#916;nef immunization and SIVmac251 vaginal challenge.</a> PLoS ONE. 8 (12), e81623 (2013).</li><li>Connick, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+of+simian+immunodeficiency+virus+replication+within+secondary+lymphoid+tissues+of+rhesus+macaques+is+linked+to+disease+stage+and+inversely+related+to+localization+of+virus-specific+CTL.">Compartmentalization of simian immunodeficiency virus replication within secondary lymphoid tissues of rhesus macaques is linked to disease stage and inversely related to localization of virus-specific CTL.</a> J Immunol. 193, 5613-5625 (2014).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+antigen-specific+and+infected+cells+in+situ+predicts+outcomes+in+early+viral+infection.">Visualizing antigen-specific and infected cells in situ predicts outcomes in early viral infection.</a> Science. 323, 1726-1729 (2009).</li><li>Li, Q., Skinner, P. J., Duan, L., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+technique+to+simultaneously+visualize+virus-specific+CD8++T+cells+and+virus-infected+cells+in+situ.">A technique to simultaneously visualize virus-specific CD8+ T cells and virus-infected cells in situ.</a> J Vis Exp. (30), e1561 (2009).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simian+immunodeficiency+virus-producing+cells+in+follicles+are+partially+suppressed+by+CD8++cells+in+vivo.">Simian immunodeficiency virus-producing cells in follicles are partially suppressed by CD8+ cells in vivo.</a> J Virol. 90, 11168-11180 (2016).</li><li>Daniels, M. A., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+for+CD8+in+T+cell+receptor+binding+and+activation+by+peptide/major+histocompatibility+complex+multimers.">Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers.</a> J Exp Med. 191, 335-346 (2000).</li><li>Lee, Y. J., Wang, H., Starrett, G. J., Phuong, V., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+specific+distribution+of+iNKT+cells+impacts+their+cytokine+response.">Tissue specific distribution of iNKT cells impacts their cytokine response.</a> Immunity. 43 (3), 566-578 (2015).</li><li>Abdelaal, H. M., Kim, H. O., Wagstaff, R., Sawahata, R., Southern, P. J., Skinner, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Vibratome+and+Compresstome+sectioning+of+fresh+primate+lymphoid+and+genital+tissues+for+in+situ+MHC-tetramer+and+immunofluorescence+staining.">Comparison of Vibratome and Compresstome sectioning of fresh primate lymphoid and genital tissues for in situ MHC-tetramer and immunofluorescence staining.</a> Biol Proced Online. 17, (2015).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).</li></ol>

IST בשילוב עם IHC מספק כלי חיוני עבור זיהוי, אפיון לכימות אנטיגן ספציפי בתאי CD8 T בסביבות מקורית עם ההקשר של תאים ומבנים רקמות אחרות. כאן, אנו המתואר הליכים מפורטים עבור IST בשילוב עם IHC, ואחריו ניתוח תמונה כמותית, כדי לקבוע את מיקום שפע, ותפקיד של אנטיגן ספציפי בתאי CD8 T בבלוטות הלימפה של קופי מקוק ...

תאי T הם קריטיים לתהליכים אימונולוגי רבים, לרבות גילוי ו חיסול תאים הנגועים בנגיף, מניעת מחלת חיסון עצמי, סיוע בייצור תאי B ו פלזמה-cell של נוגדנים, איתור של חיסול תאים סרטניים. הפיתוח של פפטיד/MHC מחלקה אני tetramer מכתים של אנטיגן ספציפי CD8 T תאים1 , התפתחות עדכנית יותר של MHC class II tetramer מכתימה של תאי CD4 T2 מאת cytometry זרימה מהפכה היכולת שלנו ללמוד ולהבין immunobiology של תאי T. בזמן מאוד שימושי לקביעת כמות של פנוטיפ של תאי T אנטיגן ספציפי, cytometry זרימה אינו מאפשר איתור לוקליזציה המרחבי של אנטיגן ספציפי בתאי T כדי תאים ומבנים אחרים ברקמות, ועדכניים disaggregation טכניקות כדי לחלץ את תאי T הדרושים עבור cytometry זרימה מוגבלת רקמות הלימפה3.
אנחנו ואחרים פיתחו שיטות שימוש טעון-פפטיד MHC class אני ו class II tetramer או multimer ריאגנטים כתם תאי CD8 ו- CD4 T אנטיגן ספציפי רקמות4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. שיטות אלה IST לאפשר הקביעה של מיקום, שפע, ותפקיד של CD8 אנטיגן ספציפי ותאי CD4 T ברקמות ולספק אמצעי לגילוי של תאים אלה ביחס תאים ומבנים אחרים ברקמות. הקבוצה שלנו השתמשה בהרחבה MHC-אני tetramer מכתים ללמוד וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) - וגם הקופי הכשל החיסוני (SIV) - תאי CD8 T ספציפיים ברקמות הלימפה, איברי המין, פי הטבעת כדי להשיג הבנה של השיגה SIV ו- HIV כדי לזהות בקורלציה של חיסון מוצלחת אסטרטגיות14,15,16,17. בנוסף, אנו גם פיתחו טכניקה שמשלב IST בבאתרו הכלאה (איש) כדי להתאים לשפה ולכמת בתאי CD8 T וירוס ספציפיים, תאים הנגועים בנגיף ברקמות וכדי לקבוע את רמות אפקטור-כדי-יעד ויוו 18 , 19.
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול באמצעות טעון-פפטיד MHC-אני tetramers כתם אנטיגן ספציפי בתאי CD8 T בסעיפים רקמות טריים, עד counterstain רקמות באמצעות IHC ולאחר לכמת תאים עם פנוטיפים ספציפי בתאים רקמות ספציפיות. הליכים אלה הם בדיוק כמו Li. et al., שבו קבענו את מיקום שפע, ותפקיד של תאי T ספציפי SIV ברקמת הלימפה במהלך זיהום כרוני SIV קופי מקוק20שימש בפרסום האחרונה שלנו.
עבור הליך זה, רקמות טריים למחלקה, מודגרות בין לילה עם טעון-פפטיד MHC-אני tetramers מצומדת כדי מולקולות thiocyanate fluorescein (FITC). ואז הם קבועים ב- paraformaldehyde. לאחר תיקון הרקמה, האיתות tetramers MHC מוגבר באמצעות נוגדנים anti-FITC הארנב, מודגרות עם מתויגות fluorescently הארנב אנטי איג נוגדנים, נוסף להיקלט. מ tetramers מאוגד. IHC משמש בשילוב עם IST לאפיין אנטיגן ספציפי T תאים, התאים שמסביב. נוגדנים מזהה epitopes על פני השטח של תאים או בחלל חוץ-תאית כלולים הדגירה העיקרי עם tetramers. נוגדנים מזהה תאיים epitopes דורשים הסתננות של דופן התא לפני צביעת. הסעיפים רקמות מוכתמים הם צילמו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי וניתח באמצעות תוכנה קונפוקלי. תאים עם תוויות הם לכמת באמצעות תוכנה מיקרוסקופיה קונפוקלית או ImageJ. הפרוטוקול המתואר יכול לשמש כדי להכתים בעיקרו אנטיגן ספציפי CD8 T תא כלשהו ברקמה כלשהי עבור אילו MHC-אני tetramers הינם זמינים.

<table align="center" border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:906px;" width="906">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MHC-I monomer</td>
			<td>NIH tetramer core facility</td>
			<td></td>
			<td>Materials for MHC-tetramer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExtrAvidin-FITC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E2716</td>
			<td>Materials for MHC-tetramer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melt agarose</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLBL6391V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-6878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>4204-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol/gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLBH2672V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-propyl gallate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rat-a-h-CD8 (1:500)</td>
			<td>Acris</td>
			<td>0714</td>
			<td>Antibody unstable, use single use frozen aliquot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>m-a-h-CD20 (1:500)</td>
			<td>NOVOCASTRA</td>
			<td>6026819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>m-a-h-Ki67 (1:500)</td>
			<td>Vector</td>
			<td>6022201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat-a-m-A488 (1:2000)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>124083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat-a-rb-Cy3 (1:5000)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>106232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat-a-rat-Cy5 (1:5000)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>118088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat-a-h-IgM-Dylight649 (1:5000)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>86579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compresstome: VF-300 Microtome</td>
			<td>Precisionary Instruments, LLC</td>
			<td>1079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Set Instant Adhesive</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>46551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well flat bottomed tissue culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Globe scienfitic Inc.</td>
			<td>#1321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor&#160; blade</td>
			<td>Ted Pella, Inc</td>
			<td>121-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather Disposable Scalpel</td>
			<td>FEATHER SAFETY RAZOR CO. LTD.</td>
			<td>No. 21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round paintbrush #2</td>
			<td>PRINCETON ART &#38; BRUSH CO.</td>
			<td>4350R</td>
			<td>Can trim as needed with razor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FV10-ASW_Viewer4.0</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ mhc-tetramer staining and quantitative analysis to determine the location, abundance, and phenotype of antigen-specific cd8 t cells in tissues

תאי T הם קריטיים לתהליכים אימונולוגי רבים, לרבות גילוי ו חיסול תאים הנגועים בנגיף, מניעת מחלת חיסון עצמי, סיוע בייצור תאי B ו פלזמה-cell של נוגדנים, איתור של חיסול תאים סרטניים. הפיתוח של MHC-tetramer מכתים של תאי T אנטיגן ספציפי נותחו על ידי cytometry זרימה יש מהפכה היכולת שלנו ללמוד ולהבין את immunobiology של תאי T. בזמן מאוד שימושי לקביעת כמות של פנוטיפ של תאי T אנטיגן ספציפי, cytometry זרימה אין אפשרות לקבוע את ההתאמה המרחבית של אנטיגן ספציפי בתאי T תאים אחרים, מבנים רקמות וטכניקות disaggregation הנוכחי כדי לחלץ את ה-T תאים הדרושים עבור cytometry זרימה מוגבלת ברקמות שאינן הלימפה. בחיי עיר MHC-tetramer מכתים (IST) היא טכניקה להמחיש T תאים ספציפיים עבור אנטיגנים עניין ברקמות. בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה (IHC), IST ניתן לקבוע את השפע, מה מיקומם ואילו פנוטיפ של אנטיגן ספציפי תאי CD8 ו- CD4 T ברקמות. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול כדי להכתים ולספור תאי CD8 T אנטיגן ספציפי, עם פנוטיפים ספציפי ממוקם בתוך תאי רקמות ספציפיות. הליכים אלה זהים פעם בפרסום האחרונה שלנו מאת Li. et al., שכותרתו "תאים מייצרי בנגיף זקיקים מדוכאים באופן חלקי על ידי CD8+ תאים Vivo ב." בשיטות המתוארות חלים באופן כללי כי הם יכולים לשמש כדי להתאים לשפה, פנוטיפ, ולכמת למעשה כל אנטיגן ספציפי CD8 תא T שעבורו MHC tetramers זמינים, כל רקמה.

איור 1 מראה כיצד לאסוף תמונות קונאפוקלית באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. איור 2 מדגים ניתוח התמונה כמותית באמצעות ImageJ. דמויות 3 ו- 4 הצג נציג תמונות של רקמות הלימפה סיב נגוע מקוק רזוס צבעונית עם MHC tetramers, נוגדנים CD8 נוגדנים CD20, ו?...

Watch this Scientific Journal Video about In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues at JoVE

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

כאן, אנו מתארים שיטה המשלבת בחיי עיר MHC-tetramer מכתים עם אימונוהיסטוכימיה כדי לקבוע לוקליזציה, פנוטיפ וכמות תאי T אנטיגן ספציפי ברקמות. פרוטוקול זה משמש כדי לקבוע את המאפיינים המרחבי, פנוטיפי של אנטיגן ספציפי בתאי CD8 T ביחס אחרים סוג התא ומבני ברקמות.

בחיי עיר MHC-tetramer מכתים וניתוח כמותי כדי לקבוע את מיקום שפע, ותפקיד של אנטיגן ספציפי CD8 T תאים ברקמות

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...

The overall goal of this procedure is to determine the location, abundance and phenotype of antigen-specific CD8 positive T cells within tissues of interest. This method helps answer quick questions about CD8 T cells by providing a means to locate, quantify and phenotype virtually any antigen specific CD8 T cell and any tissue. The main advantage of this technique is that it allows determination of the spatial distribution of antigen specific CD8 positive T cells relative to other cells and structures within tissues of interest.Demonstrating the procedure with Shengbin Li will be Gwantwa Mwakalundwa. On the day one of the procedure, use a scalpel to cut the fresh tissue into approximately 0.5 x 0.5 centimeter pieces. Here, rhesus macaque spleen tissue is shown.Separately glue each tissue fragment into the middle of the top of a plunger and embed the samples in three to five milliliters of warm 4%low melting agarose in PBS. Label the plungers with the relevant tissue information. Then, place the samples in a chilled holder in an ice bucket.When the agar has solidified, turn on the microtome and set the thickness setting to 200 micrometers. After installing a new razor blade, insert the plungers into the microtome bath. Fill the microtome bath with 100 to 200 milliliters of freshly prepared PBS-H and add PBS-H ice cubes to maintain the temperature between zero to two degrees celsius.After obtaining 200 micrometer sections, use a paintbrush to remove the agar surrounding each section and transfer the samples into individual tissue chambers within individual wells of a 24 well tissue culture plate containing one milliliter of chilled PBS-H. When all of the samples have been acquired, incubate the tissue sections overnight in one milliliter of fit conjugated peptide loaded MHC class one tetramers, diluted in PBS-H supplemented with 2%normal goat serum at four degree celsius with rocking. The following morning, transfer each tissue chamber into individual wells of a new 24 well plate containing one milliliter of fresh chilled PBS-H for 20 minutes.After the second wash, fix the sections in one milliliter of fresh 4%paraformaldehyde for two hours at room temperature. Followed by two five minute washes in cold PBS-H. Transfer the sections into a new 24 well plate containing 0.01 molar urea and microwave the sections three times for about 10 seconds each time until the urea boils.To permeabilize and block the samples, incubate the sections in blocking solution containing PBS-H supplemented with a 0.3%triton x100 detergent and 2%normal goat serum on a rocker for one hour, at four degree celsius. At the end of the incubation, transfer the tissue chambers into individual wells of a new 24 well plate containing one milliliter of solution containing rabbit anti-fitc antibody, mouse antihuman CD antibody and rat antihuman CD3 antibody. Incubate the samples overnight at four degrees celsius with rocking.On day three, wash the sections three times in fresh PBS-H at four degree celsius for at least 20 minutes per wash and perform a final incubation with the appropriate fluorescence conjugated secondary antibodies for up to three days, protected from light. At the end of the tertiary antibody incubation, rinse the samples with three 20 minute washes in fresh PBS-H and use a paint brush to transfer the samples from each tissue chamber onto a glass microscope slide. Coat each section with mounting medium supplemented with a fluorophore preservative and cover the samples with a cover slip.Then, store the slides in a light protected slide container, at 20 degrees celsius. On the day of imaging, place the first slide onto the stage of a confocal microscope and select the appropriate lasers and filters for each fluorophore used to label the tissue sample. Using the 20x objective, sequentially obtain a z series at three micron intervals in each of the fluorophore channels, in multiple 800 x 800 pixel fields.Then, construct a montage of the collected fields and save each montage image with a name based on the corresponding tissue sample. In these representative images, a section stained with MHC class one tetramers loaded with an SIV peptide is compared to a section from the same tissue, stained with MHC class one tetramers loaded with an irrelevant peptide, demonstrating the specificity of the tetramer staining. In these images, the virus specific T cells stained with MHC class one tetramer loaded with SIV peptide, co-stains for CD8, a T cell subset marker but not CD20, a cell surface protein expressed on B cells.This montage was created for multiple confocal z series fields, that were used for the quantification of tetramer stained cells with specific phenotypes and different anatomical compartments on the lymph node. This magnified image highlights an area of the montage lymph node that contains a B cell follicle delineated by IGM staining. MHC class one tetramer stained cells, some of which co-expressed the T cell activation and proliferation marker, KI67 can be detected inside and outside of B cell follicle.This staining combination allows the determination of the activation and proliferation statuses of SIV specific CD8 positive T cells, as well as their localisation within secondary lymphoid tissues. Once mastered, this technique can be completed in approximately five days if it is performed properly. While attempting this procedure, it's important to remember that fresh tissue is critical for successful staining.Process the samples within 24 hours or less after harvesting, keeping them chilled until fixation. After watching this video, you should have a good understanding of how to perform a tetramer staining and immunohistochemistry to determine the location, abundance and phenotype of antigen specific CD8 positive T cells in tissues of interest. Don't forget that working with infectious agents can be extremely hazardous and that precautions to prevent exposure such as, wearing the appropriate personal protection equipment and limiting the use of sharps should always be taken while performing this procedure.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

התמרה retroviral של T-cell קולטנים עכבר מתאי T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

תאי מציגי הרוצח המלאכותי Antigen (KaAPC) ליעיל<em&gt; במבחנה</em&gt; דלדול של תאי T אנושי אנטיגן ספציפי

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

טכניקות הדמיה כל-החיה והזרימה Cytometric לתגובות ניתוח של אנטיגן ספציפי CD8 + T תא לאחר Nanoparticle חיסון

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

בידוד נויטרופילים וניתוח כדי לקבוע את תפקידם רגישות תאים לימפומה לסוכנים טיפוליים

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

פיתוח תאי גזע שמקורם אנטיגן ספציפי תקינים בתאי T נגד אוטואימוניות

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

ניתוח של CD8 וירוס ספציפי החיסוני Simian<sup&gt; +</sup&gt; T-התאים קופי רזוס ידי פפטיד-MHC-I tetramer מכתים

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

איתור והעשרה של נדיר- אנטיגן ספציפי בתאי B עבור ניתוח של הפנוטיפ ותפקוד

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

אין ויוו Assay גילוי של הפונקציה Cytolytic תא T אנטיגן ספציפי באמצעות מודל החיסון

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Metabolic Mapping: Quantitative Enzyme Cytochemistry and Histochemistry to Determine the Activity of Dehydrogenases in Cells and Tissues

מיפוי מטבולית: אנזים כמותית Cytochemistry ו להסטולוגיה כדי לקבוע את הפעילות של Dehydrogenases של תאים ורקמות

Altered cellular metabolism is a hallmark of many diseases, including cancer, cardiovascular diseases and infection. The metabolic motor units of cells ...

High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

יעילות גבוהה הדור של העכבר העיקרי של אנטיגן בתאי T ציטוטוקסיים לבדיקות פונקציונליות במודל סוכרת אוטואימוניות

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...