Name: evaluation of vascular control mechanisms utilizing video microscopy of isolated resistance arteries of rats
Uploaded: 2017-12-05T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats at JoVE.com

Forfatterne udtrykke deres oprigtige tak Katie Fink og Lynn Dondlinger for deres uvurderlige hjælp i forberedelsen af dette manuskript.
Tilskud: NIH #R21-OD018309; #R56-HL065289; og #R01-HL128242.

College i Wisconsin institutionelle dyr lægebehandling og brug udvalg (IACUC) godkendt alle protokoller er beskrevet i dette dokument og alle procedurerne er i overensstemmelse med National Institutes of Health (NIH) Office af laboratorium animalsk velfærd (OLAW) forordninger.
1. forberedelse af løsninger og fartøj kammer
<ol><li>Før gennemførelse af en serie af eksperimenter, forberede 2 L 20 x koncentreret salt stamopløsning bestående af 278 g/L NaCl; 14 g/L KCl; 11.52 g/L MgSO<sub...

Som nævnt i indledningen, dette papir beskriver brugen af tv-mikroskopi og isolerede modstand arterie tilgange til at vurdere vaskulære funktion ikke kun i standard rotte modeller (som ansat i videoen), men også i højt specialiserede genetisk manipuleret rotte stammer, som viser nye og kraftfulde indsigter, der kan opnås udnytte disse tilgange. Brugen af disse kraftfulde teknikker til at vurdere aktive tone og passive mekaniske egenskaber af lille modstand arterier kan give vigtige oplysninger om et bredt spektrum a...

De tidligste undersøgelser af vaskulær funktion i arterierne udnyttet conduit arterier, og i mange tilfælde aorta. Kraft generation i store arterier var generelt studerede ved at knytte en ring segment af arterien til en krafttransducer i et væv bad; i tilfælde af aorta, strimler ved at skære spiralformet af fartøjet så at den glatte muskelfibre blev orienteret i en langsgående retning mellem stopgarnets og krafttransducer, at give det bedste skøn over styrken genereret af sammentrækning af den glatte muskulatur langs sin længdeakse. Den standard teknik til at skære spiralformet strimler af aortas var at placere en glasstav i lumen af fartøjet, gøre et snit i karvæggen i den ønskede vinkel og holde til slutningen af den udsatte kant af karvæggen som cut blev udvidet til at producere en hel spiralformet bånd af fartøjet. På det tidspunkt i endothelial side af fartøjet var generelt renset for at fjerne snavs før vedhæftes krafttransducer fartøj strip og nedsænkning præparatet i en iltet og temperatur kontrolleret væv bad. Til sidst, afledt at tilgang har ført til en af de mest berømte og vigtige opdagelser i historien om fysiologi af Furchgott og Zawadski1, nemlig rollen af endotel afslappende faktor (EFRU), efterfølgende identificeret som nitrogenoxid, i regulering af vaskulær funktion. Den afgørende begivenhed, der fører til denne opdagelse var en situation, hvor efterforskerne opretholdt en intakt endotelet ved at undgå kontakt mellem i endothelial side af arterie med udenlandske overflader, og bemærket, at i aorta striben ikke udviser den forventede sammentrækning at acetylkolin (ACh), men i stedet afslappet svar på ACh. Baseret på observation, efterforskerne udviklet en "sandwich" forberedelse, hvor de knyttet en aorta segment med en intakt endotelet (men ikke i stand til at generere kontraktile force) til en standard spiralformet strimmel af aorta og konverteret ACh-induceret sammentrækning i en afslapning.
To store fremskridt på dette område, som er flittigt brugt i dag er udviklingen af forberedelserne til at måle aktiv kontraktile styrke i lille modstand arterier2,3 (som dem i den intestinale mesenterium3 ) og kanylerede modstand arterie præparater4,5,6. I en af de tidligste rapporter, Mulvany og Halpern3 beskrives brugen af wire myograph forberedelse at studere aktiv kontraktile styrke i isolerede modstand arterier fra tarm mesenterium fra spontant hypertensive rotter (SHR) og Normotensive WKY kontrol. Efter udviklingen af wire myograph system, blev kanylerede modstand arterie præparater udviklet for at tillade undersøgelser af fartøjer tættere i vivo betingelser4,5,6.  Mens begge metoder giver værdifulde resultater, har kanylerede arterie forberedelse tilføjet fordelene ved mere effektivt bevare iboende aktive tone i arterierne; og at tillade efterforskere at studere aktive myogenic svar på ændringer i transmural pres og fartøj svar på ændringer i strømningshastigheden og endotel shear stress (Se anmeldelse af Halpern og Kelley6).
Et vigtigt mål for den nuværende papir er at beskrive, hvordan du anvender de hævdvundne teknik video mikroskopi ved hjælp af isolerede, kanylerede modstand arterier for at få præcise oplysninger om de mekanismer, der regulerer aktive tone i disse afgørende fartøjer, uafhængig af neurale, humorale eller parenkymalt celle påvirkninger. Denne grundlæggende oplysninger, ansætte en standard rotte model og eksempler fra vores undersøgelser af nye genetisk manipuleret rotte stammer, vil give læseren en idé om typerne af indsigter om vaskulære funktion, der kan opnås med tv mikroskopi metoder, og som kan være ansat i undersøgelser, hvor enhver kontrol og eksperimentelle målsektorers investigators valg, herunder kraftfulde nye eksperimentel rotte modeller produceret af selektiv indavl og nyudviklet genetiske Engineering teknikker.
Takket være præcision af tv-mikroskopi metoder, kan måling af diameterændringer i kanylerede arterie præparater give værdifulde oplysninger om endotel-afhængig og endotel-uafhængig mekanismer af vaskulære afslapning, såvel som vigtige (og nogle gange uventede) ændringer i vaskulære kontrolmekanismer forekommende med hypertension, højt salt kost og andre eksperimenterende indgreb. Derudover måling af tryk-diameter relationer i isoleret og kanylerede modstand arterier, der maksimalt lempes ved behandling med Ca2 +-gratis løsning eller et farmakologisk karudvidende lægemiddel, tillader investigator at vurdere strukturændringer i arterierne på grund af vaskulær remodellering og til at beregne passiv stress-strain relationer7 , som kan give vigtig indsigt i ændringer i de passive mekaniske egenskaber af arterierne, der kan påvirke arteriel funktion uafhængig af (eller foruden) ændringer i aktive kontrolmekanismer. Det er også vigtigt at bemærke, at oplysninger fra undersøgelser af isolerede modstand arterier kan suppleres med oplysninger indhentet udnytte LDF, en praktisk metode til at vurdere væv perfusion på hele dyr niveau8,9 ,10, og af oplysninger fra vurderingen af microvessel tæthed ved hjælp af fluorescently mærket GS1 lektin, der specifikt binder til glycoprotein fraspaltning i basalmembranen af små arterioler og kapillærer11 , 12. den sidstnævnte metode giver en meget præcis vurdering af microvessel tæthed, der ikke er omfattet af de klassiske vanskeligheder i estimeringen af microvessel tæthed ved at tælle fartøjer i vivo, for eksempel mangler ikke perfunderet fartøjer, hvor blodgennemstrømningen er stoppet på grund af aktive lukning af arterioler. Når de bruges sammen, kan disse tilgange give vigtig indsigt for at korrelere funktionelle ændringer i isolerede modstand arterier til ændringer i væv perfusion på microcirculatory niveau; og nogle eksempler på brugen af disse værdifulde tilgange i forbindelse med kanylerede arterie teknikker vil også blive leveret i det foreliggende manuskript.
Den nuværende papir fokuserer på brug af video mikroskopi-teknikker til at vurdere vaskulære ændringer i arterierne af outbred Sprague-Dawley rotter. Det er dog vigtigt at bemærke, at disse teknikker har vist sig for at være meget værdifulde i belyse fænotypiske forandringer i højt specialiserede gensplejsede rotte stammer lavet af selektiv avl eller gen redigering bruger teknikker. I dette manuskript giver vi eksempler på hvordan video mikroskopi-teknikker har givet vigtige oplysninger om vaskulære funktion i en række værdifulde rotte-modeller, herunder Dahl salt-følsomme (SS) rotte-en indavlet rat stamme, der er den mest udbredte brugt eksperimentel model til at studere mekanismerne af salt følsomme hypertenson18,19,20,21,22,23; og consomic rotter skabt via selektiv avl af SS rotter med salt-ufølsom Brown Norge (BN) rat stamme. I panelerne consomic rotte har hvert kromosom fra Brown Norge rotte været introgressed individuelt i Dahl SS24,25,26 genetiske baggrund. Brug af consomic rotte paneler har leveret værdifulde fingerpeg om specifikke kromosomer, der bidrager til salt følsomhed af blodtryk og andre fænotyper, herunder vaskulære reaktivitet24,25,26 ,27,28.
Selektiv avl strategier udnytter SS rotter og consomic rotter transporterer individuelle BN kromosomer har også aktiveret generation af indsnævret congenic stammer med små segmenter af individuelle Brown Norge kromosomer introgressed i Dahl SS genetiske baggrund22,29. Disse kan give yderst værdifuldt input på specifikke gener eller smalle områder af kromosomer, der kan påvirke afgørende fysiologiske variable, som blodtryk, nyre skader og vaskulære reaktivitet22,29. En anden kraftfuld tilføjelse til rotte genetiske værktøjskassen er udviklingen af rotte gen knockout modeller udnytte avancerede gen redigering teknikker, herunder ZFNs, transcriptional activator-lignende-effektor nukleaser (TALENS), og senest CRISPR-Cas913 ,14,15,16,17. Fremkomsten af disse kraftfulde teknikker, der aktiverer gener til at blive slået i rotten er en uhyre vigtig udvikling fordi gen knockout undersøgelser til dato har brugt (og fortsætte med at bruge) mus næsten udelukkende. En anden eksperimentel komponent i den nuværende papir viser værdien af kanylerede arterie teknikker og video mikroskopi til at evaluere fysiologiske mekanismer i knockout rotter mangler den master antioxidant og celle beskyttende transskription faktor, nukleare faktor (erythroid-afledte 2) - som - 2 (NRF2)30,31, der blev udviklet ved hjælp af TALEN teknologi i Sprague-Dawley genetiske baggrund17. I disse eksperimenter, blev in vitro- video mikroskopi teknikker brugt til at give funktionel kontrol af tabet af NRF2-gen og afprøve en potentielt værdifulde terapeutisk tilgang baseret på direkte opregulering af NRF2-medieret antioxidant forsvar. NRF-2 er af betydelig terapeutisk betydning i bekæmpelse af vaskulære oxidativt stress hos mennesker, i lyset af de skuffende resultater af kliniske forsøg med direkte administration af antioxidanter såsom vitamin C og E32.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>SS Rat</td>
			<td>Medical College of Wisconsin</td>
			<td>SS/JHsd/Mcwi strain</td>
			<td>Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SS.5BN Consomic Rat</td>
			<td>Medical College of Wisconsin</td>
			<td>SS-Chr 5BN/Mcwi strain</td>
			<td>Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SS.13BN Consomic Rat</td>
			<td>Medical College of Wisconsin</td>
			<td>SS-Chr 13BN/Mcwi strain</td>
			<td>Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ren1-BN Congenic Rat</td>
			<td>Medical College of Wisconsin</td>
			<td>SS.BN-(D13hmgc41-D13)hmgc23/Mcwi strain</td>
			<td>Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ren1-SSA Congenic Rat</td>
			<td>Medical College of Wisconsin</td>
			<td>SS.BN-(D13rat77-D13rat105/Mcwi strain</td>
			<td>Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ren1-SSB Congenic Rat</td>
			<td>Medical College of Wisconsin</td>
			<td>SS.BN-(D13rat124-D13rat101/Mcwi strain</td>
			<td>Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nrf2(-/-) Knockout Rat and Wild Type Littermates</td>
			<td>Medical College of Wisconsin</td>
			<td>SD-Nfe212em1Mcwi strain</td>
			<td>Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Salt Rat Chow (0.4% NaCl)-AIN-76A</td>
			<td>Dyets, Inc.</td>
			<td>113755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Salt Rat Chow (4% NaCl)-AIN-76A</td>
			<td>Dyets, Inc.</td>
			<td>113756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colorado Video Caliper</td>
			<td>Colorado Video, Inc.</td>
			<td>Model 308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Video Camera</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>KPM1AN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus Life Science</td>
			<td>CKX41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Television Monitor</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>WVBM1410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Transducers</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>56360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Pressure Display Unit</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>50115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannulated Artery Chamber</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>CH-1</td>
			<td>Single vessel chamber for general use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Controller for Single Chamber</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>TC-09S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Dispersion Tube, Miniature,Straight</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>GD-MS</td>
			<td>Provides aeration in the vessel bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Exchange Oxygenator, Miniature</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>OX</td>
			<td>Allows gas exchange with perfusate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-Doppler Flowmeter</td>
			<td>Perimed</td>
			<td>PeriFlux 5000 LDPM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GS1 Lectin</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>RL-1102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillary Tubes for Micropipettes</td>
			<td>Fredrich Haer Co.</td>
			<td>27-33-1</td>
			<td>2 mm ODX1 mm ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verticle Pipette Puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Model 700C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon suture material (10/0)-3 PLY</td>
			<td>Ashaway Line and Twine Manufacturing Co.</td>
			<td>114-ANM-10</td>
			<td>Single strands of 3 ply nylon suture teased out for use on vessels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps-Inox</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15003-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protandim</td>
			<td>Protandim</td>
			<td></td>
			<td>NRF2 Inducer: Contact Dr. Joe McCord (JOE.MCCORD@UCDENVER.EDU)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S233-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose (d-glucose) anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>D16-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate (MgSO4-7H2O)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1880-500 G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2-2 H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5080-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate-Monobasic (NaH2PO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0751-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P217-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>ED255-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of vascular control mechanisms utilizing video microscopy of isolated resistance arteries of rats

Denne protokol beskriver brugen af in vitro- tv-mikroskopi til at evaluere vaskulære funktion i isolerede cerebral modstand arterier (og andre fartøjer), og beskriver teknikker til evaluering af væv perfusion ved hjælp af Laser Doppler Flowmetry (LDF ) og microvessel tæthed udnytter fluorescently mærket Griffonia simplicifola (GS1) lektin. Nuværende metoder til at studere isoleret modstand arterier på transmural pres stødt i vivo og i mangel af parenkymalt celle påvirkninger give en kritisk link mellem i vivo undersøgelser og oplysninger fra Molekylær reduktionistiske tilgange, som giver begrænset indsigt i Integrativ svar på den heldyrsniveau. LDF og teknikker til selektivt identificere arterioler og kapillærer med fluorescently mærket GS1 lektin giver praktiske løsninger for at aktivere efterforskerne at udvide den viden opnået fra undersøgelser af isolerede modstand arterier. Dette papir beskriver anvendelsen af disse teknikker til at opnå grundlæggende viden om vaskulære fysiologi og patologi i rotte som en generel eksperimentel model, og i en bred vifte af specialiserede manipuleret genetisk "designer" rotte stammer, der kan give vigtig indsigt i specifikke gener indflydelse på vigtige vaskulære fænotyper. Udnytte disse værdifulde eksperimenterende tilgange i rotte stammer udviklet af selektiv avl strategier og nye teknologier til fremstilling af genet knockout modeller i rat, vil udvide rigor af videnskabelige lokaler udviklet i knockout musemodeller og udvide denne viden til en mere relevant dyremodel, med et godt forstået fysiologiske baggrund og egnethed for fysiologiske undersøgelser på grund af dets større størrelse.

In vitro mikroskopi af kanylerede modstand arterier giver mulighed for undersøgelse af faktorer, der påvirker aktive tone i lille modstand arterier (og større arterioler) på normale i vivo transmural pres og i mangel af parenkymalt celle påvirkninger. Ud over vurderingen af reaktiviteten af fartøjerne til forskellige karudvidende og vasokonstriktor stimuli og myogenic svar til transmural pres elevation i normal PSS, Ca2 +-gratis PSS kan føjes til perfus...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats at JoVE.com

Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats

Dette manuskript beskriver in vitro- video mikroskopi protokoller til evaluering af vaskulære funktion i rotte cerebral modstand arterier. Håndskriftet beskriver også teknikker til evaluering af microvessel tæthed med fluorescently mærket lektin og væv perfusion ved hjælp af Laser Doppler Flowmetry.

Evaluering af vaskulære kontrolmekanismer udnytte Video mikroskopi af isolerede modstand arterierne af rotter

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Accurate and Simple Evaluation of Vascular Anastomoses in Monochorionic Placenta using Colored Dye

The presence of placental vascular anastomoses is a conditio sine qua non for the development of twin-to-twin transfusion syndrome (TTTS) and twin anemia ...

Training a Sophisticated Microsurgical Technique: Interposition of External Jugular Vein Graft in the Common Carotid Artery in Rats

Træning en Sofistikeret Microsurgical Teknik: indskydning af ydre halsvene Graft i den fælles halspulsåre i rotter

Neointimal hyperplasia is one the primary causes of stenosis in arterialized veins that are of great importance in arterial coronary bypass surgery, in ...

Assessing Myogenic Response and Vasoactivity In Resistance Mesenteric Arteries Using Pressure Myography

Vurdere Myogenic respons og karaktivitet I Resistance Mesenteriske Arterier Brug Pressure Myography

Small resistance arteries constrict and dilate respectively in response to increased or decreased intraluminal pressure; this phenomenon known as myogenic ...

Computerized Dynamic Posturography for Postural Control Assessment in Patients with Intermittent Claudication

Computerized dynamic posturography with the EquiTest is an objective technique for measuring postural strategies under challenging static and dynamic ...

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Implementering af<em&gt; In vitro</em&gt; Drug Resistance Analyser: maksimere potentialet til at afdække klinisk relevant resistensmekanismer

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical ...

Ultrasound Assessment of Flow-Mediated Dilation of the Brachial and Superficial Femoral Arteries in Rats

Ultralyd Vurdering af Flow-medieret dilatation af brachialis og Overfladiske lårarterier i rotter

Arterial vasodilation to increases in wall shear rate is indicative of vascular endothelial function. In humans, the non-invasive measurement of ...

Using the Sleeve Technique in a Mouse Model of Aortic Transplantation - An Instructional Video

Ved hjælp af ærmet teknik i en musemodel af aorta Transplantation - en instruktions Video

Orthotopic aortic transplantation using the sleeve technique reduces injury to the aorta with failure rate of only 10-20%. The time to anastomose the ...

A Cell Culture Model of Resistance Arteries

En celle kultur Model af modstand arterier

The myoendothelial junction (MEJ), a unique signaling microdomain in small diameter resistance arteries, exhibits localization of specific proteins and ...

Mechanisms Underlying Gut Hormone Secretion Using the Isolated Perfused Rat Small Intestine

Underliggende Gut hormon sekretion ved hjælp af den isolerede mekanismer perfunderet rotte tyndtarmen

The gut is the largest endocrine organ of the body, producing more than 15 different peptide hormones that regulate appetite and food intake, digestion, ...

Evaluation of Coronary Flow Reserve After Myocardial Ischemia Reperfusion in Rats

Evaluering af koronar flow reserve efter myokardieiskæmi reperfusion hos rotter

Coronary artery disease is the leading cause of death worldwide. After an acute myocardial infarction, early and successful myocardial intervention via ...