Name: evaluation of vascular control mechanisms utilizing video microscopy of isolated resistance arteries of rats
Uploaded: 2017-12-05T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats at JoVE.com

Gli autori esprimono loro sincero grazie a Katie Fink e Lynn Dondlinger per la loro preziosa assistenza nella preparazione di questo manoscritto.
Supporto di Grant: NIH #R21-OD018309; #R56-HL065289; e n #R01-HL128242.

Il Medical College del Wisconsin istituzionali cura degli animali e uso Committee (IACUC) ha approvato tutti i protocolli descritti in questa carta e tutte le procedure sono conforme ai National Institutes of Health (NIH) ufficio di laboratorio Animal Welfare (OLAW) regolamenti.
1. preparazione di soluzioni e vaso camera
<ol><li>Prima di svolgere una serie di esperimenti, preparare 2 L di 20x concentrata soluzione madre sale composto da 278 g/L NaCl; 14 g/L KCl; 11,52 Co.GE MgSO4<...

Come indicato nell'introduzione, questo articolo descrive l'uso di microscopia di televisione e dell'arteria resistenza isolata si avvicina per valutare la funzione vascolare non solo nei modelli standard del ratto (come impiegato nel video), ma anche in altamente specializzata geneticamente ceppi di ratti ingegnerizzati, che mostrano il romanzo e le intuizioni potente che possono essere acquisite utilizzando questi approcci. L'utilizzo di queste potenti tecniche per valutare il tono attivo e passivo proprietà meccanich...

I primi studi di funzione vascolare nelle arterie utilizzate condotto arterie e in molti casi l'aorta. Generazione di forza nelle grandi arterie è stato studiato in genere allegando un segmento anello dell'arteria a un trasduttore di forza in un bagno di tessuto; nel caso dell'aorta, di taglio elicoidale strisce della nave affinché le fibre di muscolo liscio sono state orientate in senso longitudinale tra il punto di attacco e il trasduttore di forza, di fornire la migliore stima della forza generata dalla contrazione del il muscolo liscio lungo il suo asse longitudinale. La tecnica standard per il taglio elicoidale strisce delle aorte era quello di inserire un bastoncino di vetro nel lume del vaso, fare un taglio nella parete del vaso all'angolazione desiderata e resisti fino alla fine del bordo esposto della parete del vaso, come il taglio è stato esteso per produrre un'intera striscia elicoidale della nave. A quel punto, lato endoteliale della nave generalmente è stato cancellato per rimuovere detriti prima di agganciare la striscia di nave per il trasduttore di forza e sommergendo la preparazione in un ossigenato e bagno tessuto a temperatura controllata. Alla fine, che approccio ha portato a una delle scoperte più famose e importanti nella storia della fisiologia di Furchgott e osservando1, vale a dire il ruolo dell'endotelio ha derivato il fattore rilassante (EDRF), successivamente identificato come l'ossido di azoto, in che regolano la funzione vascolare. L'evento cruciale che conduce a quella scoperta era una situazione in cui i ricercatori hanno mantenuto un endotelio intatto da evitando il contatto del lato endoteliale dell'arteria con superfici straniere e notato che la striscia aortica non ha esibito il previsto contrazione di acetilcolina (ACh), ma invece rilassato in risposta a ACh. Sulla base di tale osservazione, i ricercatori hanno sviluppato una preparazione di "sandwich" in cui hanno attaccato un segmento aortico con un endotelio intatto (ma in grado di generare forza contrattile) ad una striscia elicoidale standard dell'aorta e convertito ACh-indotta contrazione in un rilassamento.
Due importanti novità in questo settore che sono ampiamente utilizzati oggi sono lo sviluppo di preparazioni per misurare forza contrattile attiva resistenza piccole arterie2,3 (come quelli nel mesentere intestinale3 ) e cannulati resistenza arteria preparazioni4,5,6. In uno dei rapporti più iniziali, Mulvany e Halpern3 descritto l'impiego del filo myograph preparato per studiare la forza contrattile attiva nelle arterie di resistenza isolata dal mesentery intestinale di ratti spontaneamente ipertesi (SHR) e comandi WKY normotesi. Successivamente lo sviluppo del sistema myograph filo, cannulate resistenza arteria preparati sono stati sviluppati per consentire studi dei vasi più vicino a in vivo condizioni4,5,6.  Mentre entrambi gli approcci forniscono risultati importanti, la preparazione dell'arteria cannulate ha il vantaggio aggiunto di più efficacemente preservare tono attivo intrinseco nelle arterie; e consentendo ai ricercatori di studiare le risposte myogenic attive ai cambiamenti nelle risposte di vaso e pressione transmurale alle variazioni di portata ed endoteliali shear stress (Vedi recensione di Halpern e Kelley6).
Degli obiettivi principali del presente lavoro è descrivere come impiegare la tecnica "classica" di video microscopia utilizzando isolato, cannulate resistenza arterie al fine di ottenere informazioni precise per quanto riguarda i meccanismi che regolano il tono attivo in queste cruciali vasi, indipendente da influenze delle cellule neurali, umorale o parenchimatica. Queste informazioni di base, impiegando un modello standard del ratto ed esempi dai nostri studi di nuovo geneticamente ingegnerizzati ceppi di ratti, fornirà al lettore un'idea dei tipi di approfondimenti per quanto riguarda la funzione vascolare che può essere acquisita con la televisione approcci di microscopia, e che possono essere impiegati in studi condotti su qualsiasi controllo e gruppo sperimentale di scelta dello sperimentatore, tra cui potenti nuovi modelli di ratto sperimentale prodotto da incroci selettivi e genetiche di nuova concezione tecniche di ingegneria.
Grazie alla precisione di televisione microscopia approcci, misurazione delle variazioni di diametro nelle preparazioni cannulate arteria può fornire informazioni altamente importanti meccanismi endotelio-dipendente e indipendente dall'endotelio vascolare relax, nonché importante (e a volte inaspettate) alterazioni nei meccanismi di controllo vascolare che si verificano con ipertensione, alta dieta del sale e altri interventi sperimentali. Inoltre, misurazione dei rapporti di pressione-diametro in isolato e cannulati arterie di resistenza che sono rilassate al massimo dal trattamento con Ca2 +-libera soluzione o un farmaco vasodilatatore farmacologici, consente al ricercatore di valutare cambiamenti strutturali nelle arterie a causa di rimodellamento vascolare e per calcolare la sollecitazione-deformazione passiva relazioni7 che può fornire la comprensione importante nei cambiamenti nelle proprietà meccaniche passive delle arterie che possono influenzare la funzione arteriosa indipendente di (o in aggiunta a) cambiamenti nei meccanismi di controllo attivo. È anche importante notare che le informazioni ottenute da studi di arterie di resistenza isolata possono essere integrati da informazioni ottenute utilizzando LDF, un metodo pratico per valutare la perfusione tissutale al livello animale intero8,9 ,10, e da informazioni ottenute dalla valutazione di densità del microvessel utilizzando fluorescente etichettati GS1 lectina, che si lega specificamente a moiety glicoproteina nella membrana dello scantinato di piccole arteriole e capillari11 , 12. il metodo di quest'ultimo fornisce una stima molto accurata di densità del microvessel che non è soggetto alle classiche difficoltà incontrate nello stimare la densità del microvessel contando le navi in vivo, ad esempio mancanti non perfusi navi dove il flusso sanguigno è interrotto a causa di chiusura attivo delle arteriole. Quando utilizzati insieme, questi approcci possono fornire la comprensione importante per correlare le alterazioni funzionali nelle arterie di resistenza isolata ai cambiamenti nella perfusione tissutale a livello microcircolatorio; e alcuni esempi dell'uso di tali approcci preziosi in combinazione con tecniche di arteria cannulate saranno fornite anche nel presente manoscritto.
Il presente documento si concentra sull'uso di tecniche di video microscopia per valutare i cambiamenti vascolari nelle arterie dei topi Sprague Dawley nazionali. Tuttavia, è importante notare che queste tecniche hanno dimostrato di essere molto prezioso nel delucidamento alterazioni fenotipiche in ceppi di ratti geneticamente altamente specializzato creati da allevamento selettivo o gene editing utilizzando tecniche. In questo manoscritto, forniamo esempi di come il video tecniche di microscopia hanno fornito informazioni importanti per quanto riguarda la funzione vascolare in una serie di prezioso ratto modelli, compreso il ceppo di ratto-un topo inbred Dahl sale sensibili (SS) è il più ampiamente usato modello sperimentale per studiare i meccanismi di sale sensibili hypertenson18,19,20,21,22,23; e consomic ratti creato tramite allevamento selettivo dei ratti di SS con il ceppo di ratto marrone Norvegia (BN) sale-insensibile. Nei pannelli del ratto consomic, ogni cromosoma dal ratto di chiavica di Brown è stato introgressi singolarmente nel background genetico Dahl SS24,25,26 . Utilizzo di pannelli di ratto consomic ha fornito indizi preziosi per quanto riguarda specifici cromosomi che contribuiscono alla sensibilità del sale di pressione sanguigna e altri fenotipi, compreso la reattività vascolare24,25,26 ,27,28.
Strategie di allevamento selettivo utilizzando ratti consomic portando singoli cromosomi BN e SS hanno anche permesso la generazione di ceppi Congenici ristretto con piccoli segmenti di singoli Brown Norvegia cromosomi introgressi negli SS Dahl genetica sfondo22,29. Questi possono fornire estremamente preziosi input su geni specifici o restringere le regioni dei cromosomi che possono influire sulle variabili fisiologiche cruciali, come la pressione sanguigna, danno renale e reattività vascolare22,29. Un'altra potente aggiunta alla casella degli strumenti genetici di ratto è lo sviluppo di modelli di knockout del gene del ratto utilizzando gene avanzate tra cui ZFNs, transcriptional activator-come-effector nucleasi (TALENS), tecniche di editing e più recentemente CRISPR-Cas913 ,14,15,16,17. L'avvento di queste potenti tecniche che permettono di geni essere buttato nel ratto è uno sviluppo immensamente importante perché gli studi di knockout del gene fino ad oggi hanno usato (e continuano a utilizzare) topi quasi esclusivamente. Un altro componente sperimentale nella carta attuale dimostra il valore di arteria cannulate tecniche e video microscopia di valutare i meccanismi di controllo fisiologici in topi knockout difettare la trascrizione di protezione antiossidante e cella master fattore, fattore nucleare (derivato degli eritrociti 2) - come - 2 (NRF2)30,31, che sono stati sviluppati utilizzando la tecnologia TALEN a Sprague-Dawley background genetico17. In questi esperimenti in vitro video microscopia tecniche sono state usate per fornire la verifica funzionale di perdita del gene NRF2 e testare un approccio terapeutico potenzialmente importante basato sul diretto upregulation di NRF2-mediata antiossidante difese. NRF-2 è di notevole importanza terapeutica nella lotta contro lo sforzo ossidativo vascolare in esseri umani, alla luce dei deludenti risultati di studi clinici che coinvolgono l'amministrazione diretta di antiossidanti quali le vitamine C ed E32.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>SS Rat</td>
			<td>Medical College of Wisconsin</td>
			<td>SS/JHsd/Mcwi strain</td>
			<td>Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SS.5BN Consomic Rat</td>
			<td>Medical College of Wisconsin</td>
			<td>SS-Chr 5BN/Mcwi strain</td>
			<td>Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SS.13BN Consomic Rat</td>
			<td>Medical College of Wisconsin</td>
			<td>SS-Chr 13BN/Mcwi strain</td>
			<td>Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ren1-BN Congenic Rat</td>
			<td>Medical College of Wisconsin</td>
			<td>SS.BN-(D13hmgc41-D13)hmgc23/Mcwi strain</td>
			<td>Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ren1-SSA Congenic Rat</td>
			<td>Medical College of Wisconsin</td>
			<td>SS.BN-(D13rat77-D13rat105/Mcwi strain</td>
			<td>Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ren1-SSB Congenic Rat</td>
			<td>Medical College of Wisconsin</td>
			<td>SS.BN-(D13rat124-D13rat101/Mcwi strain</td>
			<td>Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nrf2(-/-) Knockout Rat and Wild Type Littermates</td>
			<td>Medical College of Wisconsin</td>
			<td>SD-Nfe212em1Mcwi strain</td>
			<td>Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Salt Rat Chow (0.4% NaCl)-AIN-76A</td>
			<td>Dyets, Inc.</td>
			<td>113755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Salt Rat Chow (4% NaCl)-AIN-76A</td>
			<td>Dyets, Inc.</td>
			<td>113756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colorado Video Caliper</td>
			<td>Colorado Video, Inc.</td>
			<td>Model 308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Video Camera</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>KPM1AN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus Life Science</td>
			<td>CKX41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Television Monitor</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>WVBM1410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Transducers</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>56360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Pressure Display Unit</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>50115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannulated Artery Chamber</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>CH-1</td>
			<td>Single vessel chamber for general use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Controller for Single Chamber</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>TC-09S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Dispersion Tube, Miniature,Straight</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>GD-MS</td>
			<td>Provides aeration in the vessel bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Exchange Oxygenator, Miniature</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>OX</td>
			<td>Allows gas exchange with perfusate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-Doppler Flowmeter</td>
			<td>Perimed</td>
			<td>PeriFlux 5000 LDPM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GS1 Lectin</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>RL-1102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillary Tubes for Micropipettes</td>
			<td>Fredrich Haer Co.</td>
			<td>27-33-1</td>
			<td>2 mm ODX1 mm ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verticle Pipette Puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Model 700C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon suture material (10/0)-3 PLY</td>
			<td>Ashaway Line and Twine Manufacturing Co.</td>
			<td>114-ANM-10</td>
			<td>Single strands of 3 ply nylon suture teased out for use on vessels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps-Inox</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15003-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protandim</td>
			<td>Protandim</td>
			<td></td>
			<td>NRF2 Inducer: Contact Dr. Joe McCord (JOE.MCCORD@UCDENVER.EDU)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S233-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose (d-glucose) anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>D16-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate (MgSO4-7H2O)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1880-500 G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2-2 H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5080-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate-Monobasic (NaH2PO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0751-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P217-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>ED255-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of vascular control mechanisms utilizing video microscopy of isolated resistance arteries of rats

Questo protocollo descrive l'uso di in vitro televisione microscopia per valutare la funzione vascolare nelle arterie di resistenza cerebrale isolata (e altre navi) e vengono descritte le tecniche per valutare la perfusione tissutale mediante Laser Doppler flussometria (LDF ) e la densità del microvessel utilizzando fluorescente denominata lectina di Griffonia simplicifolia (GS1). Attuali metodi per lo studio isolato di arterie di resistenza alle pressioni incontrate transmurale in vivo e in assenza di influenze delle cellule parenchimatiche forniscono un collegamento critico tra gli studi in vivo e le informazioni acquisite da molecolare approcci riduzionisti che forniscono approfondimenti limitato di risposte integrative a livello animale intero. LDF e tecniche per identificare in modo selettivo le arteriole e capillari con fluorescente-etichetta GS1 lectina forniscono soluzioni pratiche per consentire ai ricercatori di estendere le conoscenze acquisite dagli studi delle arterie di resistenza isolata. Questo articolo descrive l'applicazione di queste tecniche per acquisire conoscenze fondamentali della fisiologia vascolare e della patologia nel ratto come modello sperimentale generale e in una varietà di specializzato geneticamente ceppi di ratti "designer" che possono fornire importante approfondire l'influenza dei geni specifici sui fenotipi vascolari importanti. Utilizzando questi approcci sperimentali preziosi in ceppi di ratti sviluppati da strategie di allevamento selettivo e nuove tecnologie per la produzione di modelli di knockout del gene nel ratto, si espanderà il rigore delle premesse scientifiche sviluppate in modelli murini knockout e estendere tale conoscenza per un modello animale più rilevante, con una priorità bassa fisiologica ben compreso e idoneità per studi fisiologici a causa delle sue dimensioni più grandi.

In vitro la microscopia del arterie della resistenza cannulate permette per lo studio dei fattori che influenzano il tono attivo nelle arterie di piccola resistenza (e più grande arteriole) alle pressioni di transmurale normale in vivo e in assenza di cellule parenchimatiche influenze. Oltre a valutare la reattività dei vasi ai vari stimoli vasodilatatori e vasocostrittori e risposte myogenic all'elevazione di pressione transmurale in normale PSS, il Ca2 +-P...

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Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats

Questo manoscritto descrive protocolli di video microscopia in vitro per valutare la funzione vascolare nelle arterie di resistenza cerebrale del ratto. Il manoscritto descrive anche tecniche per la valutazione di densità del microvessel con aspersione di lectine e tessuto fluorescente contrassegnato utilizzando flussometria del Laser Doppler.

Valutazione dei meccanismi di controllo vascolare utilizzando Video microscopia del arterie di resistenza isolata dei ratti

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other ...

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