Name: evaluation of vascular control mechanisms utilizing video microscopy of isolated resistance arteries of rats
Uploaded: 2017-12-05T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats at JoVE.com

Forfatterne uttrykker deres oppriktige takk til Katie Fink og Lynn Dondlinger for deres uvurderlig hjelp i utarbeidelsen av dette manuskriptet.
Gi støtte: NIH #R21-OD018309; #R56-HL065289; og #R01-HL128242.

Medical College i Wisconsin institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) godkjent alle protokoller beskrevet i dette dokumentet og alle prosedyrer er i samsvar med National Institutes of Health (NIH) Office for laboratoriet dyr velferd (OLAW) forskrifter.
1. forberedelse av løsninger og fartøy kammer
<ol><li>Før gjennomfører en rekke eksperimenter, forberede 2 L 20 x konsentrert salt lagerløsning består av 278 finans NaCl; 14 finans KCl; 11.52 finans MgSO4.</su...

Som nevnt i innledningen, dette dokumentet beskriver bruk av TV mikroskopi og isolert motstand arterien tilnærmingsmåter for å evaluere vaskulær funksjonen ikke bare i standard rotte modeller (som ansatt i videoen), men også i høyt spesialiserte genetisk foretatt rotte stammer, som viser romanen og kraftige innsikt som kan oppnås utnytte disse metodene. Bruk av disse kraftige teknikker å evaluere aktive tone og passiv mekaniske egenskaper av liten motstand arterier kan gi viktig informasjon om et bredt spekter av...

De tidligste studiene av vaskulær funksjon i arteriene utnyttet kanal arterier og i mange tilfeller aorta. Styrkegenerering i store arterier var generelt studert ved å feste en ring segment av arterien til en force svinger i en vev bath. ved aorta, striper ved å kutte spiralformede av fartøyet slik at glatt muskel fibrene var orientert i lengderetningen mellom punktet for feste og kraft svingeren, å gi anslag for kraft generert av sammentrekning av glatt muskel langs den langsgående aksen. Standard teknikken for å kutte spiralformede strimler av aortas var å plassere glass stang i lumen av fartøyet, gjøre et kutt i fartøyet veggen ønsket og holde på slutten av den synlige kanten av fartøyet veggen som kuttet ble utvidet til å produsere en hel spiralformede stripe av fartøyet. På dette punktet, endothelial siden av fartøyet var generelt uten for å fjerne rusk før fartøyet stripen vedlegges force svingeren og submerging forberedelse i et oksygenrikt og temperatur kontrollert vev bad. Til slutt, avledet at tilnærming førte til en av de mest berømte og viktige funnene i historien til fysiologi av Furchgott og Zawadski1, nemlig rollen endotelet avslappende faktor (EDRF), senere identifisert som nitrogenoksid, i regulere vaskulær funksjon. Det avgjørende fører til at funn var en situasjon der etterforskerne opprettholdt en intakt endotelet ved å unngå kontakt med endotelial siden av arteria med utenlandske flater, og la merke til at aorta stripen ikke ha forventet sammentrekning til acetylkolin (ACh), men i stedet avslappet svar ACh. Basert på den observasjonen, etterforskerne utviklet en "sandwich" forberedelse de knyttet en aorta segmentet med en intakt endotelet (men ikke generere contractile kraften) til en standard spiralformede stripe av aorta og konvertert ACh-indusert sammentrekning i en avslapning.
To store fremskritt i dette området som brukes mye i dag er utviklingen av forberedelser for å måle aktiv contractile kraften i liten motstand arterier2,3 (som de i intestinal mesentery3 ) og cannulated motstand arterien forberedelser4,5,6. En av de tidligste rapportene, Mulvany og Halpern3 beskrevet bruk av wire myograph utarbeidelse å studere aktive contractile kraften i isolerte motstand arterier fra intestinal mesentery spontant Hypertensiv rotter (SHR) og normotensive WKY kontroller. Etter utviklingen av wire myograph systemet, ble cannulated motstand arterien forberedelsene utviklet for å tillate studier av fartøy nærmere i vivo forhold4,5,6.  Begge metodene gir verdifulle resultater, har cannulated arterien utarbeidelse ekstra fordeler mer effektivt bevare iboende aktive tonen i arteriene; og slik at etterforskerne å studere aktive myogenic svar på endringer i transmuralt press og fartøy svar til endringer i flyt og endothelial skjæring stress (se Anmelde av Halpern og Kelley6).
Et hovedmål for denne utredningen er å beskrive hvordan du bruker hevdvunne teknikken av video mikroskopi bruke isolerte, cannulated motstand arterier for å få nøyaktig informasjon om mekanismer som regulerer aktive tonen i disse avgjørende fartøy, uavhengig av nevrale, humoral eller parenchymal celle påvirkninger. Denne grunnleggende informasjon, ansette en standard rotte modell og eksempler fra våre studier av nye genetisk konstruert rotte stammer, gir leseren et inntrykk av hvilke typer innsikt om vaskulær funksjon som kan oppnås med TV mikroskopi nærmer seg, og som kan brukes i studier som involverer noen kontroll og eksperimentelle gruppe(r) av etterforskerens valg, inkludert kraftige nye eksperimentelle rotte modeller produsert av selektiv inbreeding og nyutviklet genetisk engineering teknikker.
Takk til presisjon av TV mikroskopi tilnærminger gir måling av diameter endringer i cannulated arterien forberedelser svært verdifull informasjon om endotelet avhengige av og endotelet-uavhengig av vaskulære avslapning, samt viktige (og noen ganger uventet) endringer i vaskulær kontrollmekanismer oppstår med hypertensjon, høy salt diett og andre eksperimentelle tiltak. I tillegg måling av trykk-diameter relasjoner i isolert og cannulated motstand arteries som er maksimalt avslappet av behandling med Ca2 +-gratis løsning eller en farmakologisk vasodilator stoffet, kan investigator å vurdere strukturelle endringer i arteriene vaskulær remodeling og beregne passiv stress-belastning relasjoner7 som kan gi viktig innsikt i endringer i egenskapene for passiv mekanisk av arteriene som kan påvirke arteriell funksjon uavhengig av (eller i tillegg til) endringer i aktiv kontrollmekanismer. Det er også viktig å merke seg at informasjon fra studier av isolerte motstand arterier kan suppleres av anskaffet utnytte LDF, en praktisk metode for å vurdere vevsperfusjon i hele dyr nivå8,9 ,10, og av informasjon fra vurdere microvessel tetthet med fluorescently merket GS1 Lektiner, som spesifikt bindes til glykoprotein moieties i kjelleren membranen av små arterioler og kapillærer11 , 12. sistnevnte gir en svært nøyaktig anslag av microvessel som ikke er avhengig av klassiske vanskelighetene i estimering microvessel tetthet ved å telle fartøy i vivo, for eksempel manglende ikke-perfused fartøy der blodstrøm er stoppet på grunn av aktive nedleggelsen av arterioler. Når de brukes sammen, kan disse metodene gi viktig innsikt for å sammenligne funksjonelle endringer i isolerte motstand arteries til endringer i vevsperfusjon på microcirculatory nivå; og noen eksempler på bruk av de verdifulle nærmer seg sammen med cannulated arterien teknikker vil også bli gitt i stede manuskriptet.
Utredningen fokuserer på bruk av video mikroskopi teknikker å evaluere vaskulære endringene i arteriene outbred Sprague-Dawley rotter. Det er imidlertid viktig å merke seg at disse teknikkene har vist seg for å være svært verdifull i Klargjørende fenotypiske endringer i høyt spesialiserte genmodifiserte rotte stammer opprettet av selektiv formering eller genet redigering med teknikker. I dette manuskriptet gi vi eksempler på hvordan mikroskopi teknikker har gitt viktig informasjon vedrørende vaskulær funksjon i en rekke verdifulle rotte modeller, inkludert Dahl salt-følsomme (SS) rat-en innavlet rotte belastningen som er den mest utbredte brukt eksperimentell modell for å studere mekanismer for salt sensitive hypertenson18,19,20,21,22,23; og consomic rotter opprettet via selektiv formering SS rotter med salt-ufølsom Brown Norge (BN) rotte belastningen. Consomic rotten panelene vært hver kromosom fra Brown Norge rotta introgressed individuelt i Dahl SS24,25,26 genetisk bakgrunnen. Bruk av consomic rotten paneler har gitt verdifulle ledetråder om bestemte kromosomene som bidrar til salt følsomhet for blodtrykk og andre fenotyper, inkludert vaskulær reaktivitet24,25,26 ,27,28.
Selektiv formering forsvarsstrategier utnytte SS rotter og consomic rotter bærer individuelle BN kromosomene har aktivert generasjonen av avgrensede congenic stammer med små segmenter av personlige Brown Norge kromosomene introgressed i Dahl SS genetisk bakgrunn22,29. Dette kan gi svært verdifulle innspill til bestemte gener eller begrense regioner av kromosomer som kan påvirke avgjørende fysiologiske variabler, som blodtrykk, nyre skader og vaskulær reaktivitet22,29. Et kraftig tillegg til rotte genetisk verktøykassen er utviklingen av rotte genet knockout modeller bruker avansert genet redigering teknikker som ZFNs, transcriptional aktivator-lignende-effektor nucleases (TALENS), og nylig CRISPR-Cas913 ,14,15,16,17. Ankomsten av disse kraftige teknikker som gener å bli slått i rotte er en uhyre viktig utvikling fordi genet knockout studier hittil har brukt (og fortsette å bruke) mus nesten utelukkende. En annen eksperimentell komponent i dagens papir viser verdien av cannulated arterien teknikker og video mikroskopi evaluere fysiologiske kontrollmekanismer i knockout rotter mangler master antioksidant og celle beskyttende transkripsjon faktor, kjernefysiske faktor (erythroid-avledet 2) - som - 2 (NRF2)30,31, som ble utviklet ved hjelp av TALEN teknologi i Sprague-Dawley genetisk bakgrunn17. I disse eksperimentene, ble i vitro video mikroskopi teknikker brukt til å gi funksjonelle verifisering av tap av NRF2 genet og teste en potensielt verdifulle terapeutisk tilnærming basert på direkte oppregulering av NRF2-mediert antioksidant forsvar. NRF-2 er betydelig terapeutiske betydning i kampen mot vaskulær oksidativt stress hos mennesker, i lys av skuffende resultatene av kliniske forsøk med direkte administrasjon av antioksidanter som vitamin C og E32.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>SS Rat</td>
			<td>Medical College of Wisconsin</td>
			<td>SS/JHsd/Mcwi strain</td>
			<td>Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SS.5BN Consomic Rat</td>
			<td>Medical College of Wisconsin</td>
			<td>SS-Chr 5BN/Mcwi strain</td>
			<td>Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SS.13BN Consomic Rat</td>
			<td>Medical College of Wisconsin</td>
			<td>SS-Chr 13BN/Mcwi strain</td>
			<td>Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ren1-BN Congenic Rat</td>
			<td>Medical College of Wisconsin</td>
			<td>SS.BN-(D13hmgc41-D13)hmgc23/Mcwi strain</td>
			<td>Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ren1-SSA Congenic Rat</td>
			<td>Medical College of Wisconsin</td>
			<td>SS.BN-(D13rat77-D13rat105/Mcwi strain</td>
			<td>Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ren1-SSB Congenic Rat</td>
			<td>Medical College of Wisconsin</td>
			<td>SS.BN-(D13rat124-D13rat101/Mcwi strain</td>
			<td>Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nrf2(-/-) Knockout Rat and Wild Type Littermates</td>
			<td>Medical College of Wisconsin</td>
			<td>SD-Nfe212em1Mcwi strain</td>
			<td>Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Salt Rat Chow (0.4% NaCl)-AIN-76A</td>
			<td>Dyets, Inc.</td>
			<td>113755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Salt Rat Chow (4% NaCl)-AIN-76A</td>
			<td>Dyets, Inc.</td>
			<td>113756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colorado Video Caliper</td>
			<td>Colorado Video, Inc.</td>
			<td>Model 308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Video Camera</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>KPM1AN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus Life Science</td>
			<td>CKX41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Television Monitor</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>WVBM1410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Transducers</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>56360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Pressure Display Unit</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>50115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannulated Artery Chamber</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>CH-1</td>
			<td>Single vessel chamber for general use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Controller for Single Chamber</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>TC-09S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Dispersion Tube, Miniature,Straight</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>GD-MS</td>
			<td>Provides aeration in the vessel bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Exchange Oxygenator, Miniature</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>OX</td>
			<td>Allows gas exchange with perfusate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-Doppler Flowmeter</td>
			<td>Perimed</td>
			<td>PeriFlux 5000 LDPM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GS1 Lectin</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>RL-1102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillary Tubes for Micropipettes</td>
			<td>Fredrich Haer Co.</td>
			<td>27-33-1</td>
			<td>2 mm ODX1 mm ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verticle Pipette Puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Model 700C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon suture material (10/0)-3 PLY</td>
			<td>Ashaway Line and Twine Manufacturing Co.</td>
			<td>114-ANM-10</td>
			<td>Single strands of 3 ply nylon suture teased out for use on vessels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps-Inox</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15003-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protandim</td>
			<td>Protandim</td>
			<td></td>
			<td>NRF2 Inducer: Contact Dr. Joe McCord (JOE.MCCORD@UCDENVER.EDU)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S233-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose (d-glucose) anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>D16-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate (MgSO4-7H2O)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1880-500 G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2-2 H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5080-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate-Monobasic (NaH2PO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0751-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P217-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>ED255-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of vascular control mechanisms utilizing video microscopy of isolated resistance arteries of rats

Denne protokollen beskriver bruken av i vitro TV mikroskopi evaluere vaskulær funksjon i isolerte cerebral motstand arteriene (og andre fartøy), og beskriver teknikker for å vurdere vevsperfusjon bruker Laser Doppler Flowmetry (LDF ) og microvessel tetthet benytte fluorescently merket Griffonia simplicifolia (GS1) Lektiner. Gjeldende metoder for å studere isolert motstand arterier på transmuralt press oppdaget i vivo og i fravær av parenchymal celle påvirkninger gir en viktig kobling mellom i vivo studier og informasjon fått fra molekylær reduksjonistiske tilnærminger som gir begrenset innsikt i integrerende svar på hele dyr nivå. LDF og teknikker for å identifisere arterioler og kapillærer med fluorescently-merket GS1 Lektiner gir praktiske løsninger for å aktivere etterforskerne å utvide kunnskapen fra studier av isolerte motstand arterier. Dette dokumentet beskriver bruk av disse teknikkene for å få grunnleggende kunnskap om vaskulær fysiologi og patologi i rotte som generell eksperimentell modell, og i en rekke spesialiserte genmodifiserte "designer" rotte stammer som kan gi viktig innsikt påvirker bestemte gener viktig vaskulær fenotyper. Utnytte disse verdifulle eksperimentelle tilnærminger i rotte stammer utviklet av selektiv formering strategier og ny teknologi for å produsere genet knockout modeller i rotte, utvide rigor av vitenskapelige lokale utviklet i knockout musen modeller og Utvid kunnskapen til en mer relevant dyr modell, med en godt forstått fysiologiske bakgrunn og egnethet for fysiologiske studier på grunn av sin større.

In vitro mikroskopi av cannulated motstand arterier tillater for studier av faktorer som påvirker aktive tonen i liten motstand arteriene (og større arterioler) ved normal i vivo transmuralt trykk og i fravær av parenchymal celle påvirker. I tillegg til å vurdere reaktivitet av fartøyene til ulike vasodilator og vasoconstrictor stimuli og myogenic svar på transmuralt press høyde i normal PSS, Ca2 +-gratis PSS kan legges til perfusate og superfusate på...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats at JoVE.com

Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats

Dette manuskriptet beskriver i vitro video mikroskopi protokoller for evaluering av vaskulær funksjon i rotte cerebral motstand arterier. Manuskriptet beskriver også teknikker for å vurdere microvessel tetthet fluorescently merket Lektiner og vev perfusjon bruker Laser Doppler Flowmetry.

Evaluering av vaskulær kontrollmekanismer utnytte Video mikroskopi av isolerte motstand arterier rotter

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Accurate and Simple Evaluation of Vascular Anastomoses in Monochorionic Placenta using Colored Dye

The presence of placental vascular anastomoses is a conditio sine qua non for the development of twin-to-twin transfusion syndrome (TTTS) and twin anemia ...

Training a Sophisticated Microsurgical Technique: Interposition of External Jugular Vein Graft in the Common Carotid Artery in Rats

Trene en sofistikert mikrokirurgisk teknikk: interposition av ekstern halsvene Graft i Common carotisar i rotter

Neointimal hyperplasia is one the primary causes of stenosis in arterialized veins that are of great importance in arterial coronary bypass surgery, in ...

Assessing Myogenic Response and Vasoactivity In Resistance Mesenteric Arteries Using Pressure Myography

Vurdere myogenic Response og vasoactivity I Resistance tarmens arterier Bruke Trykk Myography

Small resistance arteries constrict and dilate respectively in response to increased or decreased intraluminal pressure; this phenomenon known as myogenic ...

Computerized Dynamic Posturography for Postural Control Assessment in Patients with Intermittent Claudication

Computerized dynamic posturography with the EquiTest is an objective technique for measuring postural strategies under challenging static and dynamic ...

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Implementering av<em&gt; In Vitro</em&gt; Legemiddelresistens Analyser: maksimere potensialet for Avdekke klinisk relevante resistensmekanismer

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical ...

Ultrasound Assessment of Flow-Mediated Dilation of the Brachial and Superficial Femoral Arteries in Rats

Ultralyd Vurdering av Flow-mediert Utvidelse av Brakial og Overfladiske Femorale Arteriene på rotter

Arterial vasodilation to increases in wall shear rate is indicative of vascular endothelial function. In humans, the non-invasive measurement of ...

Using the Sleeve Technique in a Mouse Model of Aortic Transplantation - An Instructional Video

Ved hjelp av ermet teknikk i en musemodell av aorta transplantasjon - en Instruksjonsvideo Video

Orthotopic aortic transplantation using the sleeve technique reduces injury to the aorta with failure rate of only 10-20%. The time to anastomose the ...

A Cell Culture Model of Resistance Arteries

En celle kultur modell av motstand arterier

The myoendothelial junction (MEJ), a unique signaling microdomain in small diameter resistance arteries, exhibits localization of specific proteins and ...

Mechanisms Underlying Gut Hormone Secretion Using the Isolated Perfused Rat Small Intestine

Mekanismene bak Gut hormon sekresjonen bruker den isolerte Perfused rotte tynntarmen

The gut is the largest endocrine organ of the body, producing more than 15 different peptide hormones that regulate appetite and food intake, digestion, ...

Evaluation of Coronary Flow Reserve After Myocardial Ischemia Reperfusion in Rats

Evaluering av koronar Flow Reserve etter hjerteinfarkt ischemia reperfusion i rotter

Coronary artery disease is the leading cause of death worldwide. After an acute myocardial infarction, early and successful myocardial intervention via ...