Name: evaluation of vascular control mechanisms utilizing video microscopy of isolated resistance arteries of rats
Uploaded: 2017-12-05T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats at JoVE.com

Os autores expressam seus sinceros agradecimentos Katie Fink e Lynn Dondlinger por sua inestimável ajuda na preparação deste manuscrito.
Suporte de Grant: NIH #R21-OD018309; #R56-HL065289; e #R01-HL128242.

O Medical College de Wisconsin institucional Animal Care e Comissão de utilização (IACUC) aprovaram todos os protocolos descritos neste documento e todos os procedimentos estão em conformidade com o National Institutes of Health (NIH) escritório de laboratório Animal Welfare (OLAW) regulamentos.
1. preparação de soluções e câmara de navio
<ol><li>Antes de realizar uma série de experiências, preparar 2L de 20 x solução concentrada de estoque de sal, consistindo de 278 g/L de Na...

Como observado na introdução, este artigo descreve o uso da microscopia de televisão e artéria resistência isolada se aproxima para avaliar a função vascular não só em modelos do rato padrão (como empregada no vídeo), mas também em altamente especializada geneticamente cepas de rato engenharia, que mostram o romance e insights poderosos que podem ser adquiridos utilizando essas abordagens. O uso destas técnicas poderosas para avaliar o tom de ativo e passivas propriedades mecânicas das artérias de resistê...

Os primeiros estudos da função vascular nas artérias utilizadas eletroduto artérias e em muitos casos, a aorta. Geração de força nas grandes artérias geralmente foi estudada por anexar um segmento de anel da artéria de um transdutor de força em um banho de tecido; no caso da aorta, por corte helicoidal tiras do navio para que as fibras musculares lisas foram orientadas na direcção longitudinal entre o ponto de fixação e o transdutor de força, para fornecer a melhor estimativa da força gerada pela contração do o músculo liso ao longo do eixo longitudinal. A técnica padrão para o corte de tiras helicoidais da aorta foi colocar uma vareta de vidro no lúmen do vaso, fazer um corte na parede do vaso no ângulo desejado, e espere até o fim da borda exposta da parede do vaso, como o corte foi estendido para produzir todo um faixa de helicoidal do navio. Nesse ponto, o lado endotelial do vaso era geralmente apagado para remover detritos antes de acoplar a tira de navio para o transdutor de força e submergindo a preparação em um oxigenado e temperatura controlada banho de tecido. Eventualmente, que a abordagem levou a uma das mais famosas e importantes descobertas na história da fisiologia por Furchgott e Zawadski1, ou seja, o papel do endotélio derivado fator relaxante (EDRF), posteriormente identificado como óxido nítrico, em regulação da função vascular. O evento crucial, levando a essa descoberta foi uma situação em que os investigadores mantiveram um endotélio intacto, evitando o contato do lado endotelial da artéria com superfícies estrangeiras, em notei que a tira da aorta não exibem o esperado contração de acetilcolina (ACh), mas em vez disso relaxado em resposta a ACh. Baseia essa observação, os investigadores desenvolveram uma preparação de "sanduíche" em que eles ligados a um segmento da aorta com um endotélio intacto (mas incapaz de gerar força contrátil) para uma faixa padrão helicoidal da aorta e convertido o ACh-induzido contração em um relaxamento.
Dois grandes avanços nesta área que são extensivamente usados hoje são o desenvolvimento de preparações para medir a força contrátil ativa na resistência de pequenas artérias2,3 (tais como aqueles no mesentério intestinal3 ) e canulados resistência artéria preparações4,5,6. Em um dos primeiros relatórios, Mulvany e Halpern3 descreveu a utilização da preparação de myograph de fio para estudar a força contrátil activa nas artérias de resistência isolada do mesentério intestinal de ratos de espontaneamente hipertensos (SHR) e normotensos controles WKY. Na sequência do desenvolvimento do sistema de myograph do fio, resistência canulado artéria preparações foram desenvolvidas para permitir estudos dos vasos mais perto na vivo condições4,5,6.  Enquanto ambas as abordagens fornecem resultados valiosos, a preparação de artéria canulada tem as vantagens de mais eficazmente preservando intrínseca Tom ativo nas artérias; e permitindo que os investigadores a estudar ativas miogênico respostas a alterações nas respostas de pressão e navio transmural a mudanças na taxa de fluxo e tensão de cisalhamento endotelial (ver revisão por Halpern e Kelley6).
Dos principais objetivos do presente trabalho é descrever como a empregar a técnica time-honored de vídeo microscopia usando artérias de resistência isolada, canulados para obter informações precisas sobre os mecanismos que regulam o tônus ativo nestes crucial vasos, independentes das influências de células neurais, humoral ou parenquimatosa. Esta informação básica, empregando um modelo do rato padrão e exemplos de nossos estudos de novo geneticamente modificadas cepas de rato, irá fornecer o leitor com uma ideia dos tipos de insights sobre a função vascular que pode ser adquirida com televisão abordagens de microscopia, e que podem ser empregadas em estudos envolvendo qualquer controle e grupo experimental (s) de escolha do investigador, incluindo poderosos novos modelos de rato experimental produzido por endogamia seletiva e recentemente desenvolvido da genética técnicas de engenharia.
Graças à precisão das abordagens de microscopia de televisão, medição de mudanças de diâmetro em preparações de artéria canulada pode fornecer altamente valiosas informações sobre mecanismos endotélio-dependente e independente de endotélio de vascular relaxamento, bem como alterações importantes (e às vezes inesperadas) em mecanismos de controlo vascular, ocorrendo com hipertensão, dieta alta em sal e outras intervenções experimentais. Além disso, a medição de relações de pressão-diâmetro em isolado e canulado artérias de resistência que estão relaxadas màxima por tratamento com Ca2 +-livre solução ou uma droga farmacológica vasodilatador, permite que o investigador avaliar mudanças estruturais nas artérias devido à remodelação vascular e para calcular o passivo de tensão-deformação relacionamentos7 que pode fornecer importantes insights sobre as mudanças nas propriedades mecânicas passivas das artérias que podem afetar a função arterial independente de (ou além de) alterações nos mecanismos de controle ativo. Também é importante observar que as informações obtidas a partir de estudos das artérias de resistência isolada podem ser complementadas por informações obtidas utilizando LDF, um método prático para avaliar a perfusão do tecido a todo animal nível8,9 ,10, e por informações obtidas de avaliar a densidade de microvessel usando fluorescente etiquetado GS1 lectina, que vincula especificamente para partes de glicoproteína na membrana do porão de pequenas arteríolas e capilares11 , 12. o último método fornece uma estimativa altamente precisa da densidade de microvessel que não está sujeita as clássicas dificuldades em estimar a densidade de microvessel pela contagem de vasos na vivo, por exemplo, faltando não perfundidos vasos onde o fluxo sanguíneo é interrompido devido ao fechamento ativo das arteríolas. Quando usados em conjunto, estas abordagens podem fornecer uma visão importante para correlacionar alterações funcionais nas artérias de resistência isolada para alterações na perfusão do tecido a nível microcirculatory; e alguns exemplos do uso dessas abordagens valiosos em conjunto com técnicas de artéria canulada também serão fornecidos no presente manuscrito.
O presente trabalho centra-se na utilização de técnicas de vídeo microscopia para avaliar alterações vasculares nas artérias de outbreds ratos Sprague-Dawley. No entanto, é importante salientar que estas técnicas têm provado para ser altamente valioso na elucidação de alterações fenotípicas em cepas de ratos geneticamente modificados altamente especializado criadas por reprodução seletiva ou gene utilizando técnicas de edição. Neste manuscrito, proporcionamos exemplos de técnicas de microscopia como vídeo forneceram informações importantes sobre a função vascular em um número de rato valioso modelos, incluindo a variedade de rato, um rato puras de (SS) sal-sensíveis de Dahl que é o mais amplamente utilizado o modelo experimental para estudar os mecanismos de sal sensível hypertenson18,19,20,21,22,23; e ratos consomic criados por meio de reprodução seletiva de ratos SS com a cepa de rato marrom Noruega (BN) diferenciação de sal. Os painéis de rato consomic, cada cromossoma de rato a Noruega de Brown tem sido meio individualmente para o fundo genético26 de25,Dahl SS24,. Uso de painéis de rato consomic forneceu pistas valiosas sobre cromossomos específicos que contribuem para a sensibilidade de sal da pressão arterial e outros fenótipos, incluindo a reatividade vascular24,25,26 de27, ,28.
Estratégias de reprodução seletiva utilizando SS ratos e ratos consomic carregando cromossomos individuais de BN também permitiram a geração de cepas congenic estreitada com pequenos segmentos do meio de cromossomos individual Brown Noruega em SS Dahl genética fundo de22,29. Estes podem fornecer extremamente valiosos entrada em genes específicos ou estreitas regiões dos cromossomos que podem afetar a cruciais variáveis fisiológicas, tais como pressão arterial, dano renal e reatividade vascular22,29. Outra adição poderosa para a caixa de ferramentas genéticas do rato é o desenvolvimento de modelos de nocaute do gene do rato utilizando gene avançada técnicas, incluindo ZFNs, transcriptional activator-como-effector nucleases (TALENS) e mais recentemente CRISPR-Cas913 ,14,15,16,17. O advento dessas técnicas poderosas que permitem que os genes ao ser nocauteado no rato é um desenvolvimento extremamente importante porque gene nocaute estudos até à data utilizaram (e continuam a usar) ratos quase exclusivamente. Outro componente experimental no presente trabalho demonstra o valor da artéria canulada técnicas e vídeo microscopia para avaliar os mecanismos de controle fisiológico em ratos nocaute falta a transcrição de proteção antioxidante e célula mestre fator, fator nuclear (eritroide-derivado 2) - como - 2 (NRF2)30,31, que foram desenvolvidos usando tecnologia TALEN no fundo genético de Sprague-Dawley17. Esses experimentos, foram utilizadas em vitro vídeo microscopia técnicas para fornecer uma verificação funcional de perda do gene NRF2 e testar uma abordagem terapêutica potencialmente valiosa baseada em directo upregulation de antioxidante NRF2-mediada defesas. NRF-2 é de substancial importância terapêutica no combate à estresse oxidativo vascular em seres humanos, à luz dos resultados decepcionantes de ensaios clínicos envolvendo a administração direta de antioxidantes como as vitaminas C e E32.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>SS Rat</td>
			<td>Medical College of Wisconsin</td>
			<td>SS/JHsd/Mcwi strain</td>
			<td>Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SS.5BN Consomic Rat</td>
			<td>Medical College of Wisconsin</td>
			<td>SS-Chr 5BN/Mcwi strain</td>
			<td>Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SS.13BN Consomic Rat</td>
			<td>Medical College of Wisconsin</td>
			<td>SS-Chr 13BN/Mcwi strain</td>
			<td>Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ren1-BN Congenic Rat</td>
			<td>Medical College of Wisconsin</td>
			<td>SS.BN-(D13hmgc41-D13)hmgc23/Mcwi strain</td>
			<td>Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ren1-SSA Congenic Rat</td>
			<td>Medical College of Wisconsin</td>
			<td>SS.BN-(D13rat77-D13rat105/Mcwi strain</td>
			<td>Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ren1-SSB Congenic Rat</td>
			<td>Medical College of Wisconsin</td>
			<td>SS.BN-(D13rat124-D13rat101/Mcwi strain</td>
			<td>Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nrf2(-/-) Knockout Rat and Wild Type Littermates</td>
			<td>Medical College of Wisconsin</td>
			<td>SD-Nfe212em1Mcwi strain</td>
			<td>Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Salt Rat Chow (0.4% NaCl)-AIN-76A</td>
			<td>Dyets, Inc.</td>
			<td>113755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Salt Rat Chow (4% NaCl)-AIN-76A</td>
			<td>Dyets, Inc.</td>
			<td>113756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colorado Video Caliper</td>
			<td>Colorado Video, Inc.</td>
			<td>Model 308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Video Camera</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>KPM1AN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus Life Science</td>
			<td>CKX41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Television Monitor</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>WVBM1410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Transducers</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>56360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Pressure Display Unit</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>50115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannulated Artery Chamber</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>CH-1</td>
			<td>Single vessel chamber for general use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Controller for Single Chamber</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>TC-09S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Dispersion Tube, Miniature,Straight</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>GD-MS</td>
			<td>Provides aeration in the vessel bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Exchange Oxygenator, Miniature</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>OX</td>
			<td>Allows gas exchange with perfusate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-Doppler Flowmeter</td>
			<td>Perimed</td>
			<td>PeriFlux 5000 LDPM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GS1 Lectin</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>RL-1102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillary Tubes for Micropipettes</td>
			<td>Fredrich Haer Co.</td>
			<td>27-33-1</td>
			<td>2 mm ODX1 mm ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verticle Pipette Puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Model 700C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon suture material (10/0)-3 PLY</td>
			<td>Ashaway Line and Twine Manufacturing Co.</td>
			<td>114-ANM-10</td>
			<td>Single strands of 3 ply nylon suture teased out for use on vessels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps-Inox</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15003-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protandim</td>
			<td>Protandim</td>
			<td></td>
			<td>NRF2 Inducer: Contact Dr. Joe McCord (JOE.MCCORD@UCDENVER.EDU)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S233-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose (d-glucose) anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>D16-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate (MgSO4-7H2O)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1880-500 G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2-2 H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5080-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate-Monobasic (NaH2PO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0751-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P217-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>ED255-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of vascular control mechanisms utilizing video microscopy of isolated resistance arteries of rats

Este protocolo descreve o uso da microscopia em vitro de televisão para avaliar a função vascular nas artérias de resistência cerebral isolada (e outros vasos) e descreve técnicas para avaliar a perfusão do tecido usando Laser Doppler Flowmetry (LDF ) e microvessel densidade utilizando fluorescente etiquetado lectina de Griffonia simplicifolia (GS1). Métodos atuais para o estudo isolaram artérias de resistência no transmural pressões encontradas na vivo e na ausência de células parenquimais influências fornecem uma ligação crítica entre estudos em vivo e informações obtidas a partir de molecular abordagens reducionistas que fornecem a limitada visão Integrativa respostas a nível de todo animal. LDF e técnicas para identificar seletivamente arteríolas e capilares com fluorescente-etiquetadas GS1 lectina fornecem soluções práticas para permitir que os investigadores estender os conhecimentos adquiridos em estudos de artérias de resistência isolada. Este documento descreve a aplicação destas técnicas para obter conhecimentos fundamentais da fisiologia vascular e patologia no rato como modelo experimental geral e em uma variedade de especializados geneticamente cepas de rato "designer" que podem fornecer importantes insights sobre a influência de genes específicos na importantes fenótipos vasculares. Utilizando essas abordagens experimentais valiosas em cepas de ratos desenvolvidas pela reprodução seletiva estratégias e novas tecnologias para a produção de modelos de gene nocaute no rato, vai expandir o rigor das instalações científicas desenvolvidas em modelos do rato nocaute e Estenda esse conhecimento para um modelo animal mais relevante, com um fundo fisiológico bem compreendido e aptidão para estudos fisiológicos devido ao seu tamanho maior.

In vitro microscopia das artérias canuladas resistência permite o estudo dos fatores que influenciam o Tom ativo na resistência de pequenas artérias (e maiores arteríolas) a normal na vivo pressões transmurais e na ausência de células parenquimais influências. Além de avaliar a reatividade dos navios aos vários estímulos de vasodilatador e vasoconstritor e miogênico respostas para elevação de pressão transmural no PSS normal, o Ca2 +-PSS gratui...

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Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats

Este manuscrito descreve em vitro protocolos de vídeo microscopia para avaliar a função vascular nas artérias de resistência cerebral de rato. O manuscrito também descreve técnicas para avaliar a densidade de microvessel com perfusão de lectina e tecido fluorescente etiquetada usando Laser Doppler Flowmetry.

Avaliação dos mecanismos de controlo Vascular utilizando a microscopia das artérias de resistência isolada de ratos

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other ...

Research

JoVE Journal

Medicine

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