Name: evaluation of vascular control mechanisms utilizing video microscopy of isolated resistance arteries of rats
Uploaded: 2017-12-05T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats at JoVE.com

Författarna uttrycker sin uppriktiga tack Katie Fink och Lynn Dondlinger för deras ovärderliga hjälp i utarbetandet av detta manuskript.
Bidragsstöd: NIH #R21-OD018309; #R56-HL065289; och #R01-HL128242.

De Medical College i Wisconsin institutionella Animal Care och användning kommittén (IACUC) godkänd alla protokoll som beskrivs i detta dokument och alla förfaranden är i överensstämmelse med den National Institutes of Health (NIH) Office av laboratorium djur välfärd (OLAW) förordningar.
1. beredning av lösningar och fartyget kammare
<ol><li>Innan du utför en serie experiment, förbereda 2 L 20 x koncentrerad salt stamlösning bestående av 278 g/L NaCl. 14 g/L KCl; 11.52 HB MgSO...

Som nämnts i inledningen, denna uppsats beskriver användningen av TV-mikroskopi och isolerade motstånd artär närmar sig för att utvärdera vaskulär funktion inte bara i standard råtta modeller (som anställda i videon), men också i högt specialiserade genetiskt bakåtkompilerade råtta stammar, som visar roman och kraftfulla insikter som kan vinnas genom att använda dessa metoder. Användningen av dessa kraftfulla tekniker att utvärdera active tonen och passiv mekaniska egenskaper av litet motstånd artärer ...

De tidigaste studierna av vaskulär funktion i artärerna utnyttjas conduit artärer, och i många fall aorta. Styrkebidrag i stora artärer studerades generellt genom att fästa en ring segmentet av artären till en kraftgivare i badkar vävnad; När det gäller aorta, remsor genom att skära spiralformade av fartyget så att de glatta muskelfibrerna var orienterade i längdriktningen mellan fästpunkten och kraft givaren, att tillhandahålla den bästa uppskattningen av den kraft som genereras genom sammandragning av den glatta muskulaturen längs sin längsgående axel. Den standard tekniken för att skära spiralformade remsor av artärer var att placera en glasstav i lumen av fartyget, göra ett snitt i kärlväggen i önskad vinkel och håller till slutet av den synliga kanten av kärlväggen som snittet förlängdes för att producera en hel spiralformade remsa av fartyget. På den punkten, den endothelial sidan av fartyget var allmänt utplånas för att ta bort skräp innan bifoga fartyget remsan till kraftgivare och dränka preparatet i en syresatt och tempererad vävnad bad. Så småningom, härrör att synsätt ledde till en av de mest berömda och viktiga upptäckterna i historien om fysiologi av Furchgott och Zawadski1, nämligen rollen av endotel avslappnande faktor (EDRF), därefter identifieras som kväveoxid, i reglerar vaskulär funktion. Den avgörande händelse som leder till denna upptäckt var en situation där utredarna underhålls en intakt endotel genom att undvika kontakt av endothelial sidan av artären med utländska ytor, och märkte att aorta remsan inte uppvisade den förväntade kontraktion till acetylkolin (ACh), men istället avslappnad svar på ACh. Baserat på denna iakttagelse, utredarna utvecklat en ”sandwich” beredning där de fästa en aorta segment med en intakt endotel (men inte för att generera kontraktila kraft) till en standard spiralformade remsa av aorta och konverterade den ACh-inducerad sammandragning i en avkoppling.
Två stora framsteg på detta område som i stor utsträckning används idag är utvecklingen av förberedelserna för att mäta aktiva kontraktila kraft i litet motstånd artärer2,3 (till exempel de i intestinal krös3 ) och kanylerade motstånd artär preparat4,5,6. I en av de tidigaste rapporterna, Mulvany och Halpern3 beskrivs användningen av tråd myograph preparatet att studera aktiva kontraktila kraft i isolerade motstånd artärer från intestinal tarmkäxet från spontant hypertensiva råttor (SHR) och normotensiva WKY kontroller. Efter utvecklingen av tråd myograph systemet utvecklades kanylerade motstånd artär preparat för att möjliggöra studier av fartyg närmare till i vivo villkor4,5,6.  Medan båda metoderna ger värdefulla resultat, har kanylerade artär preparatet extra fördelarna med mer effektivt bevara inneboende aktiva tonen i artärerna; och gör att utredarna att studera aktiva myogenic svar på förändringar i transmural tryck och fartyget svar på förändringar i flödet och endotel skjuvspänning (se recension av Halpern och Kelley6).
Ett större mål av detta dokument är att beskriva hur man anställa den häfdvunna tekniken för video mikroskopi använda isolerade, kanylerade motstånd artärerna för att få exakt information om de mekanismer som reglerar aktiv tonen i dessa avgörande fartyg, oberoende av neurala, humorala eller parenkymal cell influenser. Denna grundläggande information, anställa en standard råtta modell och exempel från våra studier av nytt genetiskt konstruerade råtta stammar, kommer att ge läsaren en uppfattning om vilka typer av insikter om vaskulär funktion som kan vinnas med TV mikroskopi metoder, och som kan användas i studier där alla kontroll och experimentella grupp(er) av prövarens val, inklusive kraftfulla nya experimentella råtta modeller produceras av selektiv inavel och nyutvecklade genetiska ingenjörsteknik.
Tack vare precision av TV-mikroskopi strategier, kan mätning av diameter förändringar i kanylerade artär preparat ge värdefull information om endotel-beroende och endotel-oberoende mekanismer av vaskulär avkoppling, samt viktiga (och ibland oväntade) förändringar i vaskulär kontrollmekanismer som inträffar med hypertoni, hög salt kost och andra experimentella ingrepp. Dessutom, mätning av tryck-diameter relationer i isolerade och kanylerade motstånd artärer som maximally är avslappnad genom behandling med Ca2 +-gratis lösning eller ett farmakologiska vasodilaterande läkemedel, tillåter utredaren att bedöma strukturella förändringar i artärer på grund av vaskulär remodeling och för att beräkna passiva stress-stam relationer7 som kan ge viktiga insikter om förändringar i artärerna som kan påverka arteriell funktion passiva mekaniska egenskaper oberoende av (eller i tillägg till) förändringar i aktiva kontrollmekanismer. Det är också viktigt att notera att information som erhålls från studier av isolerade motstånd artärer kan kompletteras med information som erhållits genom att använda LDF, en praktisk metod för att utvärdera vävnadsperfusion på hela djurens nivå8,9 ,10, och av information de fått från att bedöma microvessel densitet med fluorescently märkta GS1 lektin, som specifikt binder till glykoprotein beståndsdelarna i basalmembranet små arterioler och kapillärer11 , 12. den senare metoden ger en mycket noggrann uppskattning av microvessel densitet som inte omfattas av de klassiska svårigheter i att uppskatta microvessel densitet genom att räkna fartyg i vivo, till exempel saknade icke-perfusion fartyg där blodflödet stoppas på grund av aktiva stängningen av arterioler. När de används tillsammans, kan dessa metoder ge viktig insikt för att korrelera funktionella förändringar i isolerade motstånd artärerna till förändringar i vävnadsperfusion på blodcirkulationens nivå. och några exempel på användning av dessa värdefulla metoder i samband med kanylerade artär tekniker kommer också att ges i det nuvarande manuskriptet.
Detta dokument fokuserar på användning av video mikroskopi tekniker att utvärdera vaskulära förändringar i artärerna i utkonkurrerat dö ut Sprague-Dawley-råttor. Det är dock viktigt att notera att dessa tekniker har visat sig vara mycket värdefullt att belysa fenotypiska förändringar i högspecialiserade genmanipulerade råtta stammar skapad av selektiv avel eller gen redigering med tekniker. I detta manuskript tillhandahåller vi exempel på hur video mikroskopi tekniker har gett viktig information angående vaskulär funktion i ett antal värdefulla råtta modeller, inklusive den Dahl salt-känsliga (SS) råtta-an inavlade råtta stam som är den mest används experimentell modell för att studera mekanismerna bakom salt känsliga hypertenson18,19,20,21,22,23. och consomic råttor skapas via selektiv avel av SS råttor med salt-okänsliga Brown Norge (BN) råtta stam. I panelerna consomic råtta varit varje kromosom från Brown Norge råttan introgressed individuellt in i Dahl SS24,25,26 genetiska bakgrunden. Användning av consomic råtta paneler har lämnat värdefulla ledtrådar om specifika kromosomer som bidrar till salt känslighet av blodtryck och andra fenotyper, däribland vaskulär reaktivitet24,25,26 ,27,28.
Selektiv avel strategier använder SS råttor och consomic råttor bär enskilda BN kromosomer har också aktiverat generationen av förträngda congenic stammar med små segment av enskilda Brown Norge kromosomer introgressed Dahl SS genetiska bakgrund22,29. Dessa kan ge mycket värdefull input på specifika gener eller smala regioner i kromosomer som kan påverka avgörande fysiologiska variabler, såsom blodtryck, njurskador och vaskulär reaktivitet22,29. Ett annat kraftfullt tillägg till råtta genetiska verktygslådan är utvecklingen av råtta gen knockout modeller utnyttja avancerade gen redigering tekniker inklusive motvilligt, transkriptionell aktivator-liknande-effektor nukleaser (TALENS), och mest nyligen CRISPR-Cas913 ,14,15,16,17. Tillkomsten av dessa kraftfulla tekniker som aktivera gener att vara utslagen hos råtta är en oerhört viktig utveckling eftersom genen knockout studier hittills har använt (och fortsätta att använda) möss nästan uteslutande. En annan experimentell komponent i detta dokument visar värdet av kanylerade artär tekniker och video mikroskopi att utvärdera fysiologiska kontrollmekanismer i knockout råttor saknar master antioxidant och cell skyddande transkription faktor, nuclear factor (erytroid-derived 2) - som - 2 (NRF2)30,31, som utvecklades med hjälp av TALEN teknik i Sprague-Dawley genetisk bakgrund17. I dessa experiment användes in vitro- video mikroskopi tekniker att tillhandahålla funktionell kontroll av förlust av NRF2 genen och testa ett potentiellt värdefulla terapeutiska tillvägagångssätt baserat på direkt uppreglering av NRF2-medierad antioxidant försvar. NRF-2 är av betydande terapeutisk betydelse i kampen mot vaskulär oxidativ stress hos människor, mot bakgrund av de nedslående resultaten av kliniska prövningar som inbegriper direkt administrering av antioxidanter som vitamin C och E32.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>SS Rat</td>
			<td>Medical College of Wisconsin</td>
			<td>SS/JHsd/Mcwi strain</td>
			<td>Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SS.5BN Consomic Rat</td>
			<td>Medical College of Wisconsin</td>
			<td>SS-Chr 5BN/Mcwi strain</td>
			<td>Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SS.13BN Consomic Rat</td>
			<td>Medical College of Wisconsin</td>
			<td>SS-Chr 13BN/Mcwi strain</td>
			<td>Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ren1-BN Congenic Rat</td>
			<td>Medical College of Wisconsin</td>
			<td>SS.BN-(D13hmgc41-D13)hmgc23/Mcwi strain</td>
			<td>Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ren1-SSA Congenic Rat</td>
			<td>Medical College of Wisconsin</td>
			<td>SS.BN-(D13rat77-D13rat105/Mcwi strain</td>
			<td>Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ren1-SSB Congenic Rat</td>
			<td>Medical College of Wisconsin</td>
			<td>SS.BN-(D13rat124-D13rat101/Mcwi strain</td>
			<td>Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nrf2(-/-) Knockout Rat and Wild Type Littermates</td>
			<td>Medical College of Wisconsin</td>
			<td>SD-Nfe212em1Mcwi strain</td>
			<td>Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Salt Rat Chow (0.4% NaCl)-AIN-76A</td>
			<td>Dyets, Inc.</td>
			<td>113755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Salt Rat Chow (4% NaCl)-AIN-76A</td>
			<td>Dyets, Inc.</td>
			<td>113756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colorado Video Caliper</td>
			<td>Colorado Video, Inc.</td>
			<td>Model 308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Video Camera</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>KPM1AN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus Life Science</td>
			<td>CKX41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Television Monitor</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>WVBM1410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Transducers</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>56360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Pressure Display Unit</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>50115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannulated Artery Chamber</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>CH-1</td>
			<td>Single vessel chamber for general use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Controller for Single Chamber</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>TC-09S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Dispersion Tube, Miniature,Straight</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>GD-MS</td>
			<td>Provides aeration in the vessel bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Exchange Oxygenator, Miniature</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>OX</td>
			<td>Allows gas exchange with perfusate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-Doppler Flowmeter</td>
			<td>Perimed</td>
			<td>PeriFlux 5000 LDPM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GS1 Lectin</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>RL-1102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillary Tubes for Micropipettes</td>
			<td>Fredrich Haer Co.</td>
			<td>27-33-1</td>
			<td>2 mm ODX1 mm ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verticle Pipette Puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Model 700C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon suture material (10/0)-3 PLY</td>
			<td>Ashaway Line and Twine Manufacturing Co.</td>
			<td>114-ANM-10</td>
			<td>Single strands of 3 ply nylon suture teased out for use on vessels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps-Inox</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15003-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protandim</td>
			<td>Protandim</td>
			<td></td>
			<td>NRF2 Inducer: Contact Dr. Joe McCord (JOE.MCCORD@UCDENVER.EDU)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S233-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose (d-glucose) anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>D16-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate (MgSO4-7H2O)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1880-500 G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2-2 H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5080-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate-Monobasic (NaH2PO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0751-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P217-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>ED255-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of vascular control mechanisms utilizing video microscopy of isolated resistance arteries of rats

Detta protokoll beskriver användning av in vitro- TV-mikroskopi att utvärdera vaskulär funktion i isolerade cerebral motstånd artärer (och andra fartyg) samt tekniker för att utvärdera vävnadsperfusion som använder Laser Doppler Flowmetry (LDF ) och microvessel densitet utnyttja fluorescently märkt Griffonia simplicifolia (GS1) lektin. Nuvarande metoder för att studera isolerade motstånd artärer på transmural tryck stött i vivo och i avsaknad av parenkymal cell influenser ge en kritisk länk mellan in-vivo studier och information som erhålls från molekylär reduktionistiska synsätt som ger begränsad inblick i integrativ svaren på hela djurens nivå. LDF och tekniker för att selektivt identifiera arterioler och kapillärer med fluorescently-märkt GS1 lektin tillhandahålla praktiska lösningar för att aktivera utredarna att förlänga den kunskap som erhållits från studier av isolerade motstånd artärer. Detta dokument beskriver tillämpningen av dessa tekniker att få grundläggande kunskap om vaskulär fysiologi och patologi hos råtta som allmänna experimentell modell och i en mängd specialiserade manipulerade genetiskt ”designer” råtta stammar som kan ge viktig insikt av specifika gener påverkar viktiga vaskulär fenotyper. Utnyttja dessa värdefulla experimentella metoder i råtta stammar som utvecklats av selektiv avel strategier och ny teknik för att producera gen knockout modeller hos råtta, kommer att expandera stringens av vetenskapliga lokaler utvecklats i knockout musmodeller och utvidga kunskap till en mer relevant djurmodell, med förstådda fysiologisk bakgrund och lämplighet för fysiologiska studier på grund av sin större storlek.

In vitro mikroskopi av kanylerade motstånd artärer möjliggör studier av faktorer som påverkar active tonen i litet motstånd artärer (och större arterioler) vid normal i vivo transmural tryck och i avsaknad av parenkymal cell påverkan. Förutom att bedöma Reaktiviteten hos fartygen till olika vasodilaterande och kärlsammandragande stimuli och myogenic Svaren till transmural tryck höjd i normala PSS, den Ca2 +-gratis PSS kan läggas till perfusatet o...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats at JoVE.com

Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats

Detta manuskript beskriver in vitro- video mikroskopi protokoll för att utvärdera vaskulär funktion i råtta cerebral motstånd artärer. Manuskriptet beskriver också tekniker för att utvärdera microvessel densitet med fluorescently märkta lektin och vävnad perfusion med Laser Doppler Flowmetry.

Utvärdering av vaskulär kontrollmekanismer utnyttja Video mikroskopi av isolerade motstånd artärer hos råttor

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Accurate and Simple Evaluation of Vascular Anastomoses in Monochorionic Placenta using Colored Dye

Noggrann och enkel utvärdering av Vascular anastomoser i monochorionic Placenta med hjälp av färgade Dye

The presence of placental vascular anastomoses is a conditio sine qua non for the development of twin-to-twin transfusion syndrome (TTTS) and twin anemia ...

Training a Sophisticated Microsurgical Technique: Interposition of External Jugular Vein Graft in the Common Carotid Artery in Rats

Utbildning en sofistikerad mikrokirurgisk teknik: mellanliggande yttre halsvenen Graft i den gemensamma halspulsådern i råttor

Neointimal hyperplasia is one the primary causes of stenosis in arterialized veins that are of great importance in arterial coronary bypass surgery, in ...

Assessing Myogenic Response and Vasoactivity In Resistance Mesenteric Arteries Using Pressure Myography

Bedöma Myogenic Response och vasoaktivitet I Resistance mesenteriska artärer Använda tryck Myography

Small resistance arteries constrict and dilate respectively in response to increased or decreased intraluminal pressure; this phenomenon known as myogenic ...

Computerized Dynamic Posturography for Postural Control Assessment in Patients with Intermittent Claudication

Datoriserad Dynamic Posturography för postural kontroll Bedömning i patienter med fönstertittarsjuka

Computerized dynamic posturography with the EquiTest is an objective technique for measuring postural strategies under challenging static and dynamic ...

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Genomförande av<em&gt; In Vitro</em&gt; Läkemedelsresistens Analyser: maximera potentialen för att avslöja kliniskt relevant resistensmekanismer

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical ...

Ultrasound Assessment of Flow-Mediated Dilation of the Brachial and Superficial Femoral Arteries in Rats

Ultraljud Bedömning av Flow-medierad Dilation av Brachial och ytliga lårbensartärerna hos råttor

Arterial vasodilation to increases in wall shear rate is indicative of vascular endothelial function. In humans, the non-invasive measurement of ...

Using the Sleeve Technique in a Mouse Model of Aortic Transplantation - An Instructional Video

Med ärm-tekniken i en musmodell av aorta Transplantation - en instruktionsvideo

Orthotopic aortic transplantation using the sleeve technique reduces injury to the aorta with failure rate of only 10-20%. The time to anastomose the ...

A Cell Culture Model of Resistance Arteries

En Cell kultur modell av motstånd artärer

The myoendothelial junction (MEJ), a unique signaling microdomain in small diameter resistance arteries, exhibits localization of specific proteins and ...

Mechanisms Underlying Gut Hormone Secretion Using the Isolated Perfused Rat Small Intestine

Mekanismerna bakom Gut hormon sekretion använder den isolerade perfusion råtta tunntarmen

The gut is the largest endocrine organ of the body, producing more than 15 different peptide hormones that regulate appetite and food intake, digestion, ...

Evaluation of Coronary Flow Reserve After Myocardial Ischemia Reperfusion in Rats

Utvärdering av Koronarflödesreserv efter myokardischemi Refusion hos råttor

Coronary artery disease is the leading cause of death worldwide. After an acute myocardial infarction, early and successful myocardial intervention via ...