Name: flow cytometry-based drug screening system for the identification of small molecules that promote cellular differentiation of glioblastoma stem cells
Uploaded: 2018-01-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells at JoVE.

ودعمت هذا العمل تم جزئيا ب R01CA187780 المعاهد الوطنية للصحة.

ملاحظة: تم شراء أستروجليال ونظم مراسل lentivirus الخلايا العصبية الاستعدادات لينتيفيرال المعلبة، ومركزة. المعرفة الأساسية للتدفق الخلوي تقنية مطلوب. أيضا، الاستخدام كامل لهذا البروتوكول سوف يحتاج المستخدم الوصول إلى سيتوميتير تدفق مع قدرة إنتاجية عالية (يقبل لوحات 96-جيدا كمصدر العينة).
<p cl...

<ol>
	<li>Maher, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+glioma:+genetics+and+biology+of+a+grave+matter.">Malignant glioma: genetics and biology of a grave matter.</a> Genes Dev. 15 (11), 1311-1333 (2001).</li><li>Bonavia, R., Inda, M. M., Cavenee, W. K., Furnari, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+maintenance+in+glioblastoma:+a+social+network.">Heterogeneity maintenance in glioblastoma: a social network.</a> Cancer Res. 71 (12), 4055-4060 (2011).</li><li>Bao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+stem+cells+promote+radioresistance+by+preferential+activation+of+the+DNA+damage+response.">Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response.</a> Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).</li><li>Sul, J., Fine, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+gliomas:+new+translational+therapies.">Malignant gliomas: new translational therapies.</a> Mt Sinai J Med. 77 (6), 655-666 (2010).</li><li>Bar, E. E., Chaudhry, A., Farah, M. H., Eberhart, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+promotes+medulloblastoma+survival+via+Bc/II.">Hedgehog signaling promotes medulloblastoma survival via Bc/II.</a> Am J Pathol. 170 (1), 347-355 (2007).</li><li>Chu, Q., Orr, B. A., Semenkow, S., Bar, E. E., Eberhart, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+inhibition+of+glioblastoma+xenograft+initiation+and+clonogenic+growth+following+in+vivo+Notch+blockade.">Prolonged inhibition of glioblastoma xenograft initiation and clonogenic growth following in vivo Notch blockade.</a> Clin Cancer Res. 19 (12), 3224-3233 (2013).</li><li>Schreck, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Notch+target+Hes1+directly+modulates+Gli1+expression+and+Hedgehog+signaling:+a+potential+mechanism+of+therapeutic+resistance.">The Notch target Hes1 directly modulates Gli1 expression and Hedgehog signaling: a potential mechanism of therapeutic resistance.</a> Clin Cancer Res. 16 (24), 6060-6070 (2010).</li><li>Warrell, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+therapy+of+acute+promyelocytic+leukemia+with+tretinoin+(all-trans-retinoic+acid).">Differentiation therapy of acute promyelocytic leukemia with tretinoin (all-trans-retinoic acid).</a> N Engl J Med. 324 (20), 1385-1393 (1991).</li><li>Piccirillo, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+proteins+inhibit+the+tumorigenic+potential+of+human+brain+tumour-initiating+cells.">Bone morphogenetic proteins inhibit the tumorigenic potential of human brain tumour-initiating cells.</a> Nature. 444 (7120), 761-765 (2006).</li><li>Bar, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclopamine-mediated+hedgehog+pathway+inhibition+depletes+stem-like+cancer+cells+in+glioblastoma.">Cyclopamine-mediated hedgehog pathway inhibition depletes stem-like cancer cells in glioblastoma.</a> Stem Cells. 25 (10), 2524-2533 (2007).</li><li>Bar, E. E., Lin, A., Mahairaki, V., Matsui, W., Eberhart, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+increases+the+expression+of+stem-cell+markers+and+promotes+clonogenicity+in+glioblastoma+neurospheres.">Hypoxia increases the expression of stem-cell markers and promotes clonogenicity in glioblastoma neurospheres.</a> Am J Pathol. 177 (3), 1491-1502 (2010).</li><li>Kahlert, U. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133/CD15+defines+distinct+cell+subpopulations+with+differential+in+vitro+clonogenic+activity+and+stem+cell-related+gene+expression+profile+in+in+vitro+propagated+glioblastoma+multiforme-derived+cell+line+with+a+PNET-like+component.">CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component.</a> Folia Neuropathol. 50 (4), 357-368 (2012).</li><li>Lim, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+monocarboxylate+transporter-4+depletes+stem-like+glioblastoma+cells+and+inhibits+HIF+transcriptional+response+in+a+lactate-independent+manner.">Inhibition of monocarboxylate transporter-4 depletes stem-like glioblastoma cells and inhibits HIF transcriptional response in a lactate-independent manner.</a> Oncogene. 33 (35), 4433-4441 (2014).</li><li>Kahlert, U. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZEB1+Promotes+Invasion+in+Human+Fetal+Neural+Stem+Cells+and+Hypoxic+Glioma+Neurospheres.">ZEB1 Promotes Invasion in Human Fetal Neural Stem Cells and Hypoxic Glioma Neurospheres.</a> Brain Pathol. 25 (6), 724-732 (2014).</li><li>Hu, Y., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELDA:+extreme+limiting+dilution+analysis+for+comparing+depleted+and+enriched+populations+in+stem+cell+and+other+assays.">ELDA: extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays.</a> J Immunol Methods. 347 (1-2), 70-78 (2009).</li><li>Meyer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell-derived+clonal+analysis+of+human+glioblastoma+links+functional+and+genomic+heterogeneity.">Single cell-derived clonal analysis of human glioblastoma links functional and genomic heterogeneity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), 851-856 (2015).</li><li>Galli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+tumorigenic,+stem-like+neural+precursors+from+human+glioblastoma.">Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma.</a> Cancer Res. 64 (19), 7011-7021 (2004).</li><li>Spina, R., Voss, D. M., Asnaghi, L., Sloan, A., Bar, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atracurium+Besylate+and+other+neuromuscular+blocking+agents+promote+astroglial+differentiation+and+deplete+glioblastoma+stem+cells.">Atracurium Besylate and other neuromuscular blocking agents promote astroglial differentiation and deplete glioblastoma stem cells.</a> Oncotarget. 7 (1), 459-472 (2016).</li></ol>

في حين أن معظم الدراسات السابقة من جسكس وركزت أساسا على العلامات التي تحدد لهم، في هذه الدراسة قررنا اتخاذ نهج عكسي. نحن تركز أساسا على نسلها متمايزة المتولدة عن جسكس (مثلاً، يعبر عن أستروجليال وعلامات العصبية الخلايا). هنا نظهر استخدام المخدرات إنتاجية عالية يستند إلى الخلية فحص النظام، ?...

وقد أظهرت الدراسات الأخيرة أن أورام تحتوي على عدد صغير من سكان من الخلايا، وتسمى الخلايا الجذعية السرطانية (CSCs) أو الشروع في ورم الخلايا، التي هي المسؤولة عن تطور الورم وورم خبيث، ومقاومة للعلاج الكيماوي وراديو 1، 2-وجود الخلايا الجذعية السرطانية وعلى نسلها أكثر تمايزاً داخل الأورام يعتبر عاملاً مهما في تعزيز عدم تجانس intratumoral وهكذا يمثل عقبة رئيسية في علاج السرطانات3. والهم التسلسل الهرمي لخلية الورم، قدمتها سرطان الخلية الجذعية من الناحية النظرية، وضع استراتيجيات جديدة لعلاج السرطان 4. نهج واحد لاستهداف الخلايا الجذعية السرطانية هو تحديد وتمنع المسارات مما يشير إلى أن من المعروف أن تكون مطلوبة خلال التطور الجنيني للجهاز المتأثر. في الواقع، نحن وآخرون قد نشرت سابقا أوراق متعددة تصف الاحتياجات الجارية ذات الصلة بالخلايا الجذعية إشارات المسارات العصبية القنفذ سونيك والشق في جليوبلاستوما5،،من67. وقد ساعد هذا العمل في توطيد الأساس المنطقي لعدة تجارب سريرية في الخليج للحاسبات الآلية. ثمة نهج ثان لاستهداف الخلايا الجذعية السرطانية تعزيز هذه التفرقة. هذا النهج قد تلقت الكثير من الدعم بسبب نتائج إيجابية من الدراسات السريرية والاكلينيكية في علاج اللوكيميا الحادة بروميلوسيتيك مع الأحماض الريتينويك (ATRA، بث فيتامين (أ)). هنا وجد ATRA إزالة كتلة النضوج وتعزيز سرطان الخلية التمايز8. في الآونة الأخيرة، بيكسيريلو والزملاء أناقة أظهرت أن BMP-4 يعزز التمايز غسك إلى astrocytes مع GBM مكافحة كبير الأثر في المختبر و في فيفو9.
الأساس المنطقي للدراسة الحالية تستند إلى نهج "عكس هندسة" لاستهداف جسكس. ونظرا لعدم تجانس الواسعة الحالية في الخليج للحاسبات الآلية ومع التمايز الفقيرة كونها واحدة من السمات المميزة للسرطان، سألنا إذا نحن يمكن أن تعزز النمط الظاهري أكثر إيجابية-التفريق في دولة مثل أستروسيتي. هنا، لم يكن لدينا علم مسبق بالممرات مما يشير إلى أن الحفاظ على جسكس في عينة ورم معين ولكن بدلاً من ذلك يهدف إلى تحقيق النمط الظاهري المطلوب (مثلاً توصيني الإيجابية).
ويصف هذا التقرير الإجراءات المستخدمة لإنشاء غسك التمايز مراسل خطوط من توصيل الثقافات إثراء غسك غسك اختيار الاستنساخ. تم إنشاء خطوط نيوروسفيري جليوبلاستوما المستخدمة في مختبر البروفيسور أنجيلو فيسكوفي من المرضى مع تشخيص جليوبلاستوما الأولية في "مستشفى سان رافائيل"-ميلانو، إيطاليا. وقد درست هذه الخطوط على نطاق واسع في عدة منشورات 6،10،،من1112،،من1314. يوصي بشدة أن الأفراد الذين يرغبون في تنفيذ هذه التقنيات في المختبر تحديد أهمية المراسل بالنسبة لسرطان الخلايا الجذعية الذاتي تجديد القدرات في الخلايا أنهم يخططون للدراسة (وهذا صحيح بالنسبة لأي مراسل). بروتوكول مفصل لواحدة من في المختبر كلونوجينيك فحوصات المقبولة في المجال يتم توفيرها لإنجاز هذا15،16. وأخيراً، يرد بروتوكول مفصلة تصف الاستفادة من التمايز المراسل الخطوط في شاشة المخدرات تدفق-الخلوي على أساس في النهاية. من المذكرة، وبالمثل إلى نظام التمايز أستروجليال الموصوفة هنا، لدينا بنجاح المنشأة والتحقق من صحة غسك مراسل خطوط دمج مراسل (تمايز الخلايا العصبية) MAP2:GFP. ولذلك، تصف المنهجيات في هذه الورقة يمكن تطبيقها على دراسة التمايز الخلوي إلى مختلف الخلايا الأنساب.
يمكن العثور على بعض الأرقام الواردة في هذا التقرير في منشور صدر مؤخرا: "اتراكوريوم بزيلات وغيرها من العوامل حظر الأعصاب تشجيع التمايز أستروجليال وتستنزف جليوبلاستوما الخلايا الجذعية البالغة18.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>ESGRO Complete Accutase</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SF006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (Hank&#39;s Balanced Salt Solution)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H6648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human GFAP Differentiation Reporter (pGreenZeo, Virus)</td>
			<td>SBI (System Biosciences)</td>
			<td>SR10015VA-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml sterile disposable reagent reservoirs</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>130184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolite T25 cm&#178; Flask Vented</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>130189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolite T75 cm&#178; Flask Vented</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>130190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Centrifuge tubes</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5ml Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 0.5 - 20uL</td>
			<td>VistaLab Technologies</td>
			<td>1060-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 5-250uL</td>
			<td>VistaLab Technologies</td>
			<td>1060-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi 12-channel pipette tips 25 &#956;l</td>
			<td>VistaLab Technologies</td>
			<td>4060-1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi 12-channel pipette tips 250 &#956;l</td>
			<td>VistaLab Technologies</td>
			<td>4060-9025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guava easyCyte 5HT Benchtop Flow Cytometer</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>0500-4005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH Clinical Collections 1 and 2 small molecule libraries</td>
			<td>Evotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For the preparation of neural stem cell media (500 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>GoldBio.com</td>
			<td>A-421-250</td>
			<td>0.20%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 10X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>90-091-PB</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3149</td>
			<td>0.0002%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1M</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4036</td>
			<td>5.4 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin- Selenium (ITS -G) (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>41400-045</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S-5761</td>
			<td>14.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8783</td>
			<td>16 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5780</td>
			<td>4.8 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic FGF (FGF2), Human</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>1140-02-50</td>
			<td>10 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF, Human</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>1150-04-100</td>
			<td>20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle-Top Filter, 150ml, 33mm, 0.22um, Pes, S, Ind</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431160</td>
			<td>Use to filter sterlize media</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometry-based drug screening system for the identification of small molecules that promote cellular differentiation of glioblastoma stem cells

جليوبلاستوما (GBM) هو ورم الدماغ الأولية الأكثر شيوعاً والأكثر فتكاً في البالغين، مما تسبب في وفاة 14,000 تقريبا كل سنة في الولايات المتحدة وحدها. متوسط البقاء على قيد الحياة بعد التشخيص أقل من 15 شهرا مع العلاج الكيميائي الاستئصال، والإشعاع، وتيموزولوميدي الجراحية القصوى. وقد أصبح واضحا بصورة متزايدة التحديات الكامنة في تطوير علاجات أكثر فعالية في الخليج للحاسبات الآلية، وتشمل اختزاع لا ينضب، ومقاومته للعلاجات القياسية، وتعقيد الوراثية والتكيف الجزيئي والفئات السكانية الفرعية من الخليج للحاسبات الآلية الخلايا مع التشابه المظهرية للخلايا الجذعية الطبيعية، يشار هنا إلى جليوبلاستوما الخلايا الجذعية (جسكس). لأن جسكس مطلوبة لنمو الورم والتقدم، يمثل العلاج القائم على التمييز بين طريقة معالجة ناجعة لهذه الأورام المستعصية.
البروتوكول التالية تصف مجموعة من الإجراءات إنشاء إنتاجية عالية فحص منصة تهدف إلى تحديد الجزيئات الصغيرة التي تعزز التمايز أستروجليال GSC. في جوهر هذا النظام الدبقية فيبريلاري حمضية بروتين (توصيني) تمايز مراسل-بناء. ويتضمن البروتوكول الإجراءات العامة التالية: (1) إنشاء خطوط مراسل التمايز غسك؛ (2) اختبار/التحقق من أهمية المراسل بالنسبة للقدرات الذاتية-تجديد/كلونوجينيك غسك؛ وتدفق عالية القدرة (3)-الخلوي على أساس فحص المخدرات.
منصة الفحص يوفر نهج بسيطة وغير مكلفة لتحديد الجزيئات الصغيرة التي تعزز التمايز جسكس. وعلاوة على ذلك، استخدام المكتبات للأدوية التي وافقت عليها إدارة الأغذية والعقاقير وينطوي على إمكانية للتعرف على العوامل التي يمكن أن تكون أغراض أخرى أكثر سرعة. أيضا، يتوقع العلاجات التي تعزز سرطان الخلية الجذعية التمايز تآزر مع العلاجات "معيار الرعاية" الحالية التي أثبتت لاستهداف والقضاء على الدرجة الأولى أكثر من الخلايا السرطانية المتباينة.

كانت ترانسدوسيد مع المراسل أستروجليال lentivirus ترميز للبروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل) تنصهر في إطار مع كاسيت مقاومة زيوسين ثلاثة خطوط مستقلة نيوروسفيريس المستمدة من المريض ومدفوعة بواسطة توصيني المروج العنصر البشري ( الشكل 1). استنساخ الفردية ا...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells at JoVE.

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

تدفق المخدرات على أساس الخلوي فحص النظام لتحديد الجزيئات الصغيرة التي تعزز التمايز الخلوي للخلايا الجذعية جليوبلاستوما

ويرد على بروتوكول فحص كفاءة لتحديد الجزيئات الصغيرة التي تعزز التمايز أستروجليال في الخلايا الجذعية جليوبلاستوما (جسكس). ويستند المقايسة مراسل تمايز خلايا الجذعية حيث التعبير عن تعزيز التجارة والنقل (اجفب) بدافع المروج توصيني البشرية.

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

The overall goal of this procedure is to screen small molecule libraries for agents that promote astroglial differentiation in glioblastoma stem cells. This method can help answer key questions in the cancer stem cell field, such as what are the signaling pathways that are required for maintaining glioblastoma stem cells in the undifferentiated state. Proper execution of this technique allows for the straightforward identification of small molecules that promote glioblastoma stem cell differentiation.The implication of this technique extend toward therapy for Ehlers-Danlos glioblastoma because reducing the percentage of glioblastoma stem cells may decrease the likelihood of recurrence. This method can also be applied to setting differentiation into other cell lineages using other reporter constructs. Our report is the first to establish a high throughput approach to screen for agents that force glioma stem cells to differentiate.Working with lentivirus particles in cancer cells derived from patients can be extremely hazardous. Therefore standard procedure for working with bloodborne pathogens should always be followed. To begin, seed one million glioblastoma stem cells or GSCs in two milliliters of complete neural stem cell growth medium in a six-well plate.Next, transduce the cells with the lentivirus reporter at a multiplicity of infection equal to five. To the cell and virus mixture, add two microliters of polybrene such that the final concentration is eight micrograms per milliliter, and incubate the cells at 37 degrees Celsius and 5%CO2 overnight. After incubation, replace the growth medium to remove unbound virus.And centrifuge cells at 360 times G for five minutes. Then carefully aspirate medium and plate cells back in a six-well plate. And continue to incubate the cells for 24 hours.Harvest 0.5 milliliters of the total culture volume. Pellet cells by centrifugation at 360 times G for five minutes at room temperature. Resuspend cells in 0.5 milliliters fresh neural stem cell growth medium.Place the plate back in the incubator to allow for expansion for at least 72 hours. Add 200 microliters of dissociation reagent and incubate for five minutes in a water bath set to 37 degrees Celsius. Dissociate cells by pippetting up and down gently.To the dissociated cells add 800 microliters of HBSS to ensure minimal cell attachment or aggregation. Next, transfer 200 microliters of each cell suspension into wells of a 96-multiwell plate. Determine the percentage of cells expressing the green fluorescent protein by flow cytometry.Record at least 10, 000 viable cells in each acquisition. In all flow cytometric analysis use parental non-transduced cells or vector-transduced nonfluorescent cells to establish baseline fluorescence. To select and expand individual subclones seed cells at a density of 0.7 cells per well in 100 microliters of neural stem cell medium in a 96-well plate.Maintain these clones in culture for 11 days. Look out for neurospheres with a diameter greater than 100 microns. We have previously established this cutoff size to retrospectively determine if the neuorsphere was originated by a self-renewing glioblastoma stem cell.This cutoff size may need optimization when working with different glioblastoma cell models. Observe the cells under a fluorescence microscope equipped with a FITC filter and mark wells that contain a single neurosphere in which approximately one 1%to 5%of the cells are GFP-positive. After marking, expand individual clones until a sufficient number of cells is available for flow cytometry analysis.Assuming the reporter clones contain 1%to 5%of GFP-positive cells, harvest 0.5 milliliters from each clone along with an equal quantity of non-transduced control cells to determine the exact percentage of GFP-positive cells. After pelleting cells at 360 times G for five minutes at room temperature, aspirate the supernatant. Add 200 microliters of dissociation reagent to each pellet and incubate the tubes in a water bath set to 37 degrees Celsius.After incubation, triturate the cells about 20 to 30 times to achieve a single cell suspension. Then add 800 microliters of HBSS to ensure minimal cell attachment or aggregation. Now transfer 200 microliters of each cell suspension into wells of a 96-multiwell plate.Finally, perform flow cytometry, recording at least 10, 000 viable cells in each acquisition. To assess the clonogenic capacity prepare single cell suspensions of differentiation reporter subclones by triturating the cells about 20 to 30 times. Then plate these cells in 100 microliters of complete neural stem cell growth medium at a density of about five to 500 cells per well in 96-multiwell plates.Maintain these cells in culture for nine to 11 days. Look for neurospheres under a light microscope. A well containing at least one single large neurosphere is considered positive.Considering parental non-transduced cells and GFP-positive lentivirus-transduced cells as controls input the total wells analyzed and the number of positive cells on the ELDA online interface. To begin screening, plate 5000 cells in 99 microliters of complete neural stem cell growth medium in a 96-well plate. Then with a 12-channel pipettor treat cells with two micromolar final concentration of diluted library compounds or with the DMSO control.Incubate the cells for 72 hours. Now add 150 microliters of cell dissociation reagent using a 12-channel pipettor in each well and incubate at 37 degrees Celsius for 20 minutes. Then gently triturate the cells in each well about 20 to 30 times using a 12-channel pipettor until a single cell suspension is achieved.Now perform flow cytometry and determine the percentage of cells expressing the GFAP:GFP reporter. First determine the cell size and viability from the forward and side scatters and gate the viable cell population. Then determine the GFP-positive cells within the viable cell population.An increase of percentage of GFP-positive cells by three standard deviations over controls is considered to be a positive hit which may be adjusted to accommodate user preference of stringency. Representative images of HSR-GBM1 GSC subclones expressing low and high levels of GFAP:GFP are shown. The subclones positive for GFAP:GFP expression were selected by flow cytometry for the patient-derived neurosphere line.Here, low GFAP:GFP indicates that less than 5%of the cells in the clone are GFP-positive, while high GFAP:GFP indicates that greater than 75%of the cells in the clone are GFP-positive. These results show that in vitro self-renewal capacity of GFAP-low subclones is higher than their GFAP-high counterparts as determined by ELDA. Therefore GH subclones are more differentiated than GL subclones.Finally, drug libraries were screened to identify agents capable to induce astroglial differentiation in GSCs. 12 drugs were found to significantly increase the percentage of cells expressing the GFAP:GFP reporter. Once mastered, this technique can be done in a few weeks if it is performed properly.Following this procedure other methods like alamarBlue assay, clonogenic assay in semisolid media, flank or intracranial xenograph injection can be performed in order to answer additional questions like the effect of selective drugs on cellular proliferation and clonogenicity in vitro and tumorigenicity in vivo. After watching this video, you should have a good understanding of how to identify compounds capable of inducing astroglial differentiation in glioblastoma stem cells.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

جيل الماغنيسيوم الفائق الورم ثلاثية الأبعاد لفحص المخدرات

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

فحوصات التصوير خلية يعيش بدراسة الدماغ جليوبلاستوما ورم الخلايا الجذعية الهجرة والغزو

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

تدفق سيتوميتريك الكشف عن خلايا شبيهة بالخلايا الجذعية سرطان الثدي التي شكلت حديثا بعد عكس المبرمج

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

الفيزيولوجيالمريض المستمدة 3D Spheroids لفحص المخدرات المضادة للأورام لاستهداف الخلايا الجذعية السرطان

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells

التمايز من الثدي الماوس HC11 وخلايا EpH4

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

إنشاء وتوصيف الأمعاء العصبية الصغيرة ورم الغدد الصماء خزان

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter

تحديد منظمي عوامل النسخ باستخدام فحص متوسط الإنتاجية للمكتبات المصصفوفة ومراسل ثنائي لوسيفراز القائم

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

فحص المخدرات للمريض الأولي المشتقة الورم Xenografts في حمار وحشي

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

الثقافة المشتركة للخلايا الشبيهة بالورم الأرومي الدبقي على الخلايا العصبية المنقوشة لدراسة الهجرة والتفاعلات الخلوية

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

في فيفو فحص المناعة للحويصلات خارج الخلية المشتقة من الورم عن طريق قياس التدفق الخلوي للخلايا التائية الطحالية

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...