Name: flow cytometry-based drug screening system for the identification of small molecules that promote cellular differentiation of glioblastoma stem cells
Uploaded: 2018-01-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells at JoVE.

Ce travail a été partiellement prises en charge par le NIH R01CA187780.

Remarque : Astroglials et systèmes de journaliste lentivirus neuronale ont été achetés sous forme de préparations des gènes pré-emballés, concentré. Connaissance de base de la technique de cytométrie en flux est nécessaire. Aussi, pour une pleine utilisation du présent protocole l’utilisateur doit accéder à un cytomètre de flux avec une capacité de haut débit (accepte les plaques à 96 puits comme source de l’échantillon).
1. des gènes système transcriptionnelle
<p c...

<ol>
	<li>Maher, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+glioma:+genetics+and+biology+of+a+grave+matter.">Malignant glioma: genetics and biology of a grave matter.</a> Genes Dev. 15 (11), 1311-1333 (2001).</li><li>Bonavia, R., Inda, M. M., Cavenee, W. K., Furnari, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+maintenance+in+glioblastoma:+a+social+network.">Heterogeneity maintenance in glioblastoma: a social network.</a> Cancer Res. 71 (12), 4055-4060 (2011).</li><li>Bao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+stem+cells+promote+radioresistance+by+preferential+activation+of+the+DNA+damage+response.">Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response.</a> Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).</li><li>Sul, J., Fine, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+gliomas:+new+translational+therapies.">Malignant gliomas: new translational therapies.</a> Mt Sinai J Med. 77 (6), 655-666 (2010).</li><li>Bar, E. E., Chaudhry, A., Farah, M. H., Eberhart, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+promotes+medulloblastoma+survival+via+Bc/II.">Hedgehog signaling promotes medulloblastoma survival via Bc/II.</a> Am J Pathol. 170 (1), 347-355 (2007).</li><li>Chu, Q., Orr, B. A., Semenkow, S., Bar, E. E., Eberhart, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+inhibition+of+glioblastoma+xenograft+initiation+and+clonogenic+growth+following+in+vivo+Notch+blockade.">Prolonged inhibition of glioblastoma xenograft initiation and clonogenic growth following in vivo Notch blockade.</a> Clin Cancer Res. 19 (12), 3224-3233 (2013).</li><li>Schreck, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Notch+target+Hes1+directly+modulates+Gli1+expression+and+Hedgehog+signaling:+a+potential+mechanism+of+therapeutic+resistance.">The Notch target Hes1 directly modulates Gli1 expression and Hedgehog signaling: a potential mechanism of therapeutic resistance.</a> Clin Cancer Res. 16 (24), 6060-6070 (2010).</li><li>Warrell, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+therapy+of+acute+promyelocytic+leukemia+with+tretinoin+(all-trans-retinoic+acid).">Differentiation therapy of acute promyelocytic leukemia with tretinoin (all-trans-retinoic acid).</a> N Engl J Med. 324 (20), 1385-1393 (1991).</li><li>Piccirillo, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+proteins+inhibit+the+tumorigenic+potential+of+human+brain+tumour-initiating+cells.">Bone morphogenetic proteins inhibit the tumorigenic potential of human brain tumour-initiating cells.</a> Nature. 444 (7120), 761-765 (2006).</li><li>Bar, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclopamine-mediated+hedgehog+pathway+inhibition+depletes+stem-like+cancer+cells+in+glioblastoma.">Cyclopamine-mediated hedgehog pathway inhibition depletes stem-like cancer cells in glioblastoma.</a> Stem Cells. 25 (10), 2524-2533 (2007).</li><li>Bar, E. E., Lin, A., Mahairaki, V., Matsui, W., Eberhart, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+increases+the+expression+of+stem-cell+markers+and+promotes+clonogenicity+in+glioblastoma+neurospheres.">Hypoxia increases the expression of stem-cell markers and promotes clonogenicity in glioblastoma neurospheres.</a> Am J Pathol. 177 (3), 1491-1502 (2010).</li><li>Kahlert, U. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133/CD15+defines+distinct+cell+subpopulations+with+differential+in+vitro+clonogenic+activity+and+stem+cell-related+gene+expression+profile+in+in+vitro+propagated+glioblastoma+multiforme-derived+cell+line+with+a+PNET-like+component.">CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component.</a> Folia Neuropathol. 50 (4), 357-368 (2012).</li><li>Lim, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+monocarboxylate+transporter-4+depletes+stem-like+glioblastoma+cells+and+inhibits+HIF+transcriptional+response+in+a+lactate-independent+manner.">Inhibition of monocarboxylate transporter-4 depletes stem-like glioblastoma cells and inhibits HIF transcriptional response in a lactate-independent manner.</a> Oncogene. 33 (35), 4433-4441 (2014).</li><li>Kahlert, U. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZEB1+Promotes+Invasion+in+Human+Fetal+Neural+Stem+Cells+and+Hypoxic+Glioma+Neurospheres.">ZEB1 Promotes Invasion in Human Fetal Neural Stem Cells and Hypoxic Glioma Neurospheres.</a> Brain Pathol. 25 (6), 724-732 (2014).</li><li>Hu, Y., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELDA:+extreme+limiting+dilution+analysis+for+comparing+depleted+and+enriched+populations+in+stem+cell+and+other+assays.">ELDA: extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays.</a> J Immunol Methods. 347 (1-2), 70-78 (2009).</li><li>Meyer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell-derived+clonal+analysis+of+human+glioblastoma+links+functional+and+genomic+heterogeneity.">Single cell-derived clonal analysis of human glioblastoma links functional and genomic heterogeneity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), 851-856 (2015).</li><li>Galli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+tumorigenic,+stem-like+neural+precursors+from+human+glioblastoma.">Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma.</a> Cancer Res. 64 (19), 7011-7021 (2004).</li><li>Spina, R., Voss, D. M., Asnaghi, L., Sloan, A., Bar, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atracurium+Besylate+and+other+neuromuscular+blocking+agents+promote+astroglial+differentiation+and+deplete+glioblastoma+stem+cells.">Atracurium Besylate and other neuromuscular blocking agents promote astroglial differentiation and deplete glioblastoma stem cells.</a> Oncotarget. 7 (1), 459-472 (2016).</li></ol>

Alors que la plupart des études précédentes de CSS portés principalement sur les marqueurs qui définissent leur, dans cette étude, nous avons décidé d’adopter l’approche inverse. Nous nous concentrons principalement sur les descendances différenciées générés par CSS (par exemple, les cellules exprimant astroglials et marqueurs neurones). Nous démontrons l’utilisation d’un médicament à haut débit basés sur les cellules contrôle système, qui repose sur l’expression humaine GFAP promoteur dépe...

Des études récentes ont montré que les tumeurs contiennent une petite population de cellules, appelées les cellules souches du cancer (CSC) ou les cellules tumorales qui lance, qui sont responsables de la progression tumorale, métastase et résistance aux traitements chimio - et radio 1, 2. la présence de cellules souches cancéreuses et leurs progénitures plus différenciées au sein de tumeurs est considéré comme un facteur important favorisant l’hétérogénéité intratumorale et représente donc un obstacle majeur dans le traitement de cancers3. Hiérarchie de cellule de tumeur, fournie par la théorie des cellules souches du cancer, a inspiré l’élaboration de nouvelles stratégies pour traiter les cancers 4. Une approche pour cibler les cellules souches cancéreuses consiste à identifier et à inhiber les voies de signalisation qui sont connus pour être requis pendant le développement embryonnaire de l’organe atteint. En effet, nous et autres avons déjà publié plusieurs documents décrivant le besoin continu de cellules souches-pertinentes signalisation voies neurales Sonic Hedgehog et l’encoche dans le glioblastome5,6,7. Ce travail a contribué à solidifier la raison d’être de plusieurs essais cliniques de GBM. Une deuxième approche pour cibler les cellules souches cancéreuses est de promouvoir leur différenciation. Cette approche a reçu beaucoup d’aide en raison des résultats favorables des études précliniques et cliniques dans le traitement de la leucémie aiguë promyélocytaire avec acides rétinoïque (ATRA, un analogue de la vitamine A). Ici ATRA a été trouvé pour retirer le bloc de maturation et favoriser le cancer de la différenciation cellulaire8. Plus récemment, Piccirillo et ses collègues ont démontré avec élégance que BMP-4 favorise la différenciation GSC dans les astrocytes avec anti-MBG importants effets in vitro et in vivo9.
La justification de cette étude est basée sur une approche de « l’ingénierie inversée » afin de cibler les CGV. Compte tenu de la grande hétérogénéité présente dans GBM et avec mauvaise différenciation étant l’une des principales caractéristiques du cancer, nous avons demandé si nous pourrions promouvoir un phénotype plus favorable - différenciation dans un état semblable au astrocyte. Ici, nous n’avons pas de connaissance préalable des voies de signalisation qui maintiennent des CSS dans un échantillon donné de tumeur mais plutôt pour objectif d’obtenir un phénotype souhaité (par exemple les positivité GFAP).
Ce rapport décrit les procédures utilisées pour établir la GSC différenciation journaliste-lignes de la transduction des cultures GSC-enrichi à la sélection clonale de GSC. Les glioblastome Neurosphère lignes utilisées ont été créés au laboratoire du professeur Angelo Vescovi provenant de patients avec un diagnostic de glioblastome primaire à l’hôpital San Raffaele - Milano, Italie. Ces lignes ont été largement étudiées dans plusieurs publications 6,10,11,12,13,14. Il est fortement recommandé que les personnes qui s’intéressent à la mise en œuvre de ces techniques dans leur laboratoire juger de la pertinence du reporter à capacité d’auto-renouvellement de cellules souches du cancer dans les cellules qu’ils envisagent d’étudier (Ceci est vrai pour n’importe quel journaliste). Un protocole détaillé pour l’un des essais clonogéniques in vitro acceptés dans le domaine est fourni pour accomplir ce15,16. Enfin, un protocole détaillé décrivant l’utilisation des lignes journaliste différenciation dans un dépistage de drogues de cytométrie en flux-basée est fourni à la fin. De note, de même pour le système de différenciation astroglials décrit ici, nous avons avec succès établi et validé des lignes de journaliste de GSC intégrant un journaliste (différenciation neuronale) de MAP2:GFP. Par conséquent, les méthodologies de décrivent dans ce papier peut être appliquée à l’étude de la différenciation cellulaire dans diverses lignées cellulaires.
Certains chiffres dans ce rapport se trouve dans une publication récente : « bésylate d’Atracurium et autres agents bloquants neuromusculaires promouvoir la différenciation astroglials et appauvrissent glioblastoma cellules souches18.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>ESGRO Complete Accutase</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SF006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (Hank&#39;s Balanced Salt Solution)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H6648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human GFAP Differentiation Reporter (pGreenZeo, Virus)</td>
			<td>SBI (System Biosciences)</td>
			<td>SR10015VA-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml sterile disposable reagent reservoirs</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>130184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolite T25 cm&#178; Flask Vented</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>130189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolite T75 cm&#178; Flask Vented</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>130190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Centrifuge tubes</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5ml Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 0.5 - 20uL</td>
			<td>VistaLab Technologies</td>
			<td>1060-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 5-250uL</td>
			<td>VistaLab Technologies</td>
			<td>1060-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi 12-channel pipette tips 25 &#956;l</td>
			<td>VistaLab Technologies</td>
			<td>4060-1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi 12-channel pipette tips 250 &#956;l</td>
			<td>VistaLab Technologies</td>
			<td>4060-9025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guava easyCyte 5HT Benchtop Flow Cytometer</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>0500-4005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH Clinical Collections 1 and 2 small molecule libraries</td>
			<td>Evotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For the preparation of neural stem cell media (500 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>GoldBio.com</td>
			<td>A-421-250</td>
			<td>0.20%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 10X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>90-091-PB</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3149</td>
			<td>0.0002%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1M</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4036</td>
			<td>5.4 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin- Selenium (ITS -G) (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>41400-045</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S-5761</td>
			<td>14.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8783</td>
			<td>16 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5780</td>
			<td>4.8 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic FGF (FGF2), Human</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>1140-02-50</td>
			<td>10 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF, Human</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>1150-04-100</td>
			<td>20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle-Top Filter, 150ml, 33mm, 0.22um, Pes, S, Ind</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431160</td>
			<td>Use to filter sterlize media</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometry-based drug screening system for the identification of small molecules that promote cellular differentiation of glioblastoma stem cells

Glioblastome (GBM) est la tumeur cérébrale primaire plus meurtrières et les plus courants chez les adultes, causant environ 14 000 décès chaque année aux États-Unis seulement. Durée médiane de survie après le diagnostic est inférieure à 15 mois avec une chimiothérapie témozolomide, rayonnement et résection chirurgicale maximale. Les défis inhérents à développer des traitements plus efficaces de GBM sont devenus de plus en plus clairs et incluent son effraction inflexible, sa résistance aux traitements standard, sa complexité génétique et moléculaire adaptabilité et sous-populations de GBM cellules avec similitudes phénotypiques des cellules souches normales, ci-après désigné comme des cellules souches glioblastome (CSS). Parce que les CSS sont requises pour la progression et la croissance tumorale, la thérapie axée sur la différenciation représente une modalité de traitement viable pour ces tumeurs incurables.
Le protocole suivant décrit une collection de procédures visant à établir un criblage à haute plateforme visant à l’identification de petites molécules qui favorisent la différenciation astroglials GSC. Au cœur du système est une protéine fibrillaire acide gliale (GFAP) différenciation journaliste-construction. Le protocole contient les procédures générales suivantes : (1) établir des lignes de GSC différenciation journaliste ; (2) essais/validation de la pertinence du reporter à la capacité d’auto-renouvellement/clonogéniques GSC ; et (3) haute capacité-cytométrie de dépistage des drogues.
La plateforme de criblage fournit une approche simple et peu coûteuse pour identifier des petites molécules qui favorisent la différenciation des CGV. De plus, l’utilisation des bibliothèques de médicaments approuvés par la FDA détient le potentiel pour l’identification d’agents qui peuvent être réutilisés plus rapidement. Aussi, les thérapies qui favorisent la différenciation des cellules souches du cancer sont censés agissent en synergie avec les traitements actuels de « norme de diligence » qui auraient dû être divulgués afin de cibler et éliminer principalement plus de cellules différenciées du cancer.

Trois lignes indépendantes neurospheres dérivé de patient étaient transduites avec le journaliste astroglials de lentivirus codant pour un protéine fluorescente verte (GFP) fondue dans le cadre avec une cassette de résistance Zeocin et entraînés par l’élément humain du promoteur GFAP ( Figure 1). Prochaines clones individuels ont été isolés par l’ensemencement de 0,7 cellules / puits dans une plaque 96 puits (Figure 2</st...

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Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

Médicament à base de cytométrie en flux système de contrôle pour l’Identification de petites molécules qui favorisent la différenciation cellulaire des cellules souches de glioblastome

Un protocole de dépistage efficace est présenté pour l’identification de petites molécules qui favorisent la différenciation astroglials dans les cellules souches glioblastome (CSS). L’analyse est basée sur un journaliste de différenciation de cellules souches selon laquelle l’expression de la GFP améliorée (eGFP) est entraînée par le promoteur GFAP humain.

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

The overall goal of this procedure is to screen small molecule libraries for agents that promote astroglial differentiation in glioblastoma stem cells. This method can help answer key questions in the cancer stem cell field, such as what are the signaling pathways that are required for maintaining glioblastoma stem cells in the undifferentiated state. Proper execution of this technique allows for the straightforward identification of small molecules that promote glioblastoma stem cell differentiation.The implication of this technique extend toward therapy for Ehlers-Danlos glioblastoma because reducing the percentage of glioblastoma stem cells may decrease the likelihood of recurrence. This method can also be applied to setting differentiation into other cell lineages using other reporter constructs. Our report is the first to establish a high throughput approach to screen for agents that force glioma stem cells to differentiate.Working with lentivirus particles in cancer cells derived from patients can be extremely hazardous. Therefore standard procedure for working with bloodborne pathogens should always be followed. To begin, seed one million glioblastoma stem cells or GSCs in two milliliters of complete neural stem cell growth medium in a six-well plate.Next, transduce the cells with the lentivirus reporter at a multiplicity of infection equal to five. To the cell and virus mixture, add two microliters of polybrene such that the final concentration is eight micrograms per milliliter, and incubate the cells at 37 degrees Celsius and 5%CO2 overnight. After incubation, replace the growth medium to remove unbound virus.And centrifuge cells at 360 times G for five minutes. Then carefully aspirate medium and plate cells back in a six-well plate. And continue to incubate the cells for 24 hours.Harvest 0.5 milliliters of the total culture volume. Pellet cells by centrifugation at 360 times G for five minutes at room temperature. Resuspend cells in 0.5 milliliters fresh neural stem cell growth medium.Place the plate back in the incubator to allow for expansion for at least 72 hours. Add 200 microliters of dissociation reagent and incubate for five minutes in a water bath set to 37 degrees Celsius. Dissociate cells by pippetting up and down gently.To the dissociated cells add 800 microliters of HBSS to ensure minimal cell attachment or aggregation. Next, transfer 200 microliters of each cell suspension into wells of a 96-multiwell plate. Determine the percentage of cells expressing the green fluorescent protein by flow cytometry.Record at least 10, 000 viable cells in each acquisition. In all flow cytometric analysis use parental non-transduced cells or vector-transduced nonfluorescent cells to establish baseline fluorescence. To select and expand individual subclones seed cells at a density of 0.7 cells per well in 100 microliters of neural stem cell medium in a 96-well plate.Maintain these clones in culture for 11 days. Look out for neurospheres with a diameter greater than 100 microns. We have previously established this cutoff size to retrospectively determine if the neuorsphere was originated by a self-renewing glioblastoma stem cell.This cutoff size may need optimization when working with different glioblastoma cell models. Observe the cells under a fluorescence microscope equipped with a FITC filter and mark wells that contain a single neurosphere in which approximately one 1%to 5%of the cells are GFP-positive. After marking, expand individual clones until a sufficient number of cells is available for flow cytometry analysis.Assuming the reporter clones contain 1%to 5%of GFP-positive cells, harvest 0.5 milliliters from each clone along with an equal quantity of non-transduced control cells to determine the exact percentage of GFP-positive cells. After pelleting cells at 360 times G for five minutes at room temperature, aspirate the supernatant. Add 200 microliters of dissociation reagent to each pellet and incubate the tubes in a water bath set to 37 degrees Celsius.After incubation, triturate the cells about 20 to 30 times to achieve a single cell suspension. Then add 800 microliters of HBSS to ensure minimal cell attachment or aggregation. Now transfer 200 microliters of each cell suspension into wells of a 96-multiwell plate.Finally, perform flow cytometry, recording at least 10, 000 viable cells in each acquisition. To assess the clonogenic capacity prepare single cell suspensions of differentiation reporter subclones by triturating the cells about 20 to 30 times. Then plate these cells in 100 microliters of complete neural stem cell growth medium at a density of about five to 500 cells per well in 96-multiwell plates.Maintain these cells in culture for nine to 11 days. Look for neurospheres under a light microscope. A well containing at least one single large neurosphere is considered positive.Considering parental non-transduced cells and GFP-positive lentivirus-transduced cells as controls input the total wells analyzed and the number of positive cells on the ELDA online interface. To begin screening, plate 5000 cells in 99 microliters of complete neural stem cell growth medium in a 96-well plate. Then with a 12-channel pipettor treat cells with two micromolar final concentration of diluted library compounds or with the DMSO control.Incubate the cells for 72 hours. Now add 150 microliters of cell dissociation reagent using a 12-channel pipettor in each well and incubate at 37 degrees Celsius for 20 minutes. Then gently triturate the cells in each well about 20 to 30 times using a 12-channel pipettor until a single cell suspension is achieved.Now perform flow cytometry and determine the percentage of cells expressing the GFAP:GFP reporter. First determine the cell size and viability from the forward and side scatters and gate the viable cell population. Then determine the GFP-positive cells within the viable cell population.An increase of percentage of GFP-positive cells by three standard deviations over controls is considered to be a positive hit which may be adjusted to accommodate user preference of stringency. Representative images of HSR-GBM1 GSC subclones expressing low and high levels of GFAP:GFP are shown. The subclones positive for GFAP:GFP expression were selected by flow cytometry for the patient-derived neurosphere line.Here, low GFAP:GFP indicates that less than 5%of the cells in the clone are GFP-positive, while high GFAP:GFP indicates that greater than 75%of the cells in the clone are GFP-positive. These results show that in vitro self-renewal capacity of GFAP-low subclones is higher than their GFAP-high counterparts as determined by ELDA. Therefore GH subclones are more differentiated than GL subclones.Finally, drug libraries were screened to identify agents capable to induce astroglial differentiation in GSCs. 12 drugs were found to significantly increase the percentage of cells expressing the GFAP:GFP reporter. Once mastered, this technique can be done in a few weeks if it is performed properly.Following this procedure other methods like alamarBlue assay, clonogenic assay in semisolid media, flank or intracranial xenograph injection can be performed in order to answer additional questions like the effect of selective drugs on cellular proliferation and clonogenicity in vitro and tumorigenicity in vivo. After watching this video, you should have a good understanding of how to identify compounds capable of inducing astroglial differentiation in glioblastoma stem cells.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Génération des sphéroïdes High-Throughput tumeur en trois dimensions pour le dépistage des drogues

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Épreuves d’imagerie de cellules vivantes pour étude glioblastome Brain Tumor Stem Cell Migration et Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

Débit par cytométrie en flux détection de cellules de cellules souches-comme pour le Cancer du sein nouvellement formé après le renversement de l’apoptose

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Patients physiologiques dérivés sphéroïdes 3D pour le dépistage des médicaments anti-néoplastiques pour cibler les cellules souches cancéreuses

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells

Différenciation des cellules Epithéliales De l’épithélial de souris HC11 et EpH4

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

Établissement et caractérisation des sphéroïdes neuroendocrines de la petite intestin

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter

Identification des régulateurs des facteurs de transcription à l’aide du dépistage à débit moyen des bibliothèques à débit moyen et d’un reporter à double luciferase

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Dépistage de drogue des xénogreffes dérivées de tumeur de patient primaire dans le poisson-zèbre

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

Co-culture de cellules souches de glioblastome sur des neurones à motifs pour étudier la migration et les interactions cellulaires

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In vivo Dépistage de l’immunogénicité des vésicules extracellulaires dérivées de tumeurs par cytométrie en flux de lymphocytes T spléniques

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...