Name: flow cytometry-based drug screening system for the identification of small molecules that promote cellular differentiation of glioblastoma stem cells
Uploaded: 2018-01-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells at JoVE.

इस काम को आंशिक रूप से NIH R01CA187780 ने समर्थन दिया है ।

नोट: Astroglial और न्यूरॉन lentivirus रिपोर्टर सिस्टम पूर्व पैक, केंद्रित lentiviral तैयारी के रूप में खरीदा गया था. प्रवाह cytometry तकनीक के बुनियादी ज्ञान की आवश्यकता है । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल के एक पूर्ण उपयोग के लिए उपयो?...

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	<li>Maher, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+glioma:+genetics+and+biology+of+a+grave+matter.">Malignant glioma: genetics and biology of a grave matter.</a> Genes Dev. 15 (11), 1311-1333 (2001).</li><li>Bonavia, R., Inda, M. M., Cavenee, W. K., Furnari, F. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+therapy+of+acute+promyelocytic+leukemia+with+tretinoin+(all-trans-retinoic+acid).">Differentiation therapy of acute promyelocytic leukemia with tretinoin (all-trans-retinoic acid).</a> N Engl J Med. 324 (20), 1385-1393 (1991).</li><li>Piccirillo, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+proteins+inhibit+the+tumorigenic+potential+of+human+brain+tumour-initiating+cells.">Bone morphogenetic proteins inhibit the tumorigenic potential of human brain tumour-initiating cells.</a> Nature. 444 (7120), 761-765 (2006).</li><li>Bar, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclopamine-mediated+hedgehog+pathway+inhibition+depletes+stem-like+cancer+cells+in+glioblastoma.">Cyclopamine-mediated hedgehog pathway inhibition depletes stem-like cancer cells in glioblastoma.</a> Stem Cells. 25 (10), 2524-2533 (2007).</li><li>Bar, E. E., Lin, A., Mahairaki, V., Matsui, W., Eberhart, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+increases+the+expression+of+stem-cell+markers+and+promotes+clonogenicity+in+glioblastoma+neurospheres.">Hypoxia increases the expression of stem-cell markers and promotes clonogenicity in glioblastoma neurospheres.</a> Am J Pathol. 177 (3), 1491-1502 (2010).</li><li>Kahlert, U. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133/CD15+defines+distinct+cell+subpopulations+with+differential+in+vitro+clonogenic+activity+and+stem+cell-related+gene+expression+profile+in+in+vitro+propagated+glioblastoma+multiforme-derived+cell+line+with+a+PNET-like+component.">CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component.</a> Folia Neuropathol. 50 (4), 357-368 (2012).</li><li>Lim, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+monocarboxylate+transporter-4+depletes+stem-like+glioblastoma+cells+and+inhibits+HIF+transcriptional+response+in+a+lactate-independent+manner.">Inhibition of monocarboxylate transporter-4 depletes stem-like glioblastoma cells and inhibits HIF transcriptional response in a lactate-independent manner.</a> Oncogene. 33 (35), 4433-4441 (2014).</li><li>Kahlert, U. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZEB1+Promotes+Invasion+in+Human+Fetal+Neural+Stem+Cells+and+Hypoxic+Glioma+Neurospheres.">ZEB1 Promotes Invasion in Human Fetal Neural Stem Cells and Hypoxic Glioma Neurospheres.</a> Brain Pathol. 25 (6), 724-732 (2014).</li><li>Hu, Y., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELDA:+extreme+limiting+dilution+analysis+for+comparing+depleted+and+enriched+populations+in+stem+cell+and+other+assays.">ELDA: extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays.</a> J Immunol Methods. 347 (1-2), 70-78 (2009).</li><li>Meyer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell-derived+clonal+analysis+of+human+glioblastoma+links+functional+and+genomic+heterogeneity.">Single cell-derived clonal analysis of human glioblastoma links functional and genomic heterogeneity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), 851-856 (2015).</li><li>Galli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+tumorigenic,+stem-like+neural+precursors+from+human+glioblastoma.">Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma.</a> Cancer Res. 64 (19), 7011-7021 (2004).</li><li>Spina, R., Voss, D. M., Asnaghi, L., Sloan, A., Bar, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atracurium+Besylate+and+other+neuromuscular+blocking+agents+promote+astroglial+differentiation+and+deplete+glioblastoma+stem+cells.">Atracurium Besylate and other neuromuscular blocking agents promote astroglial differentiation and deplete glioblastoma stem cells.</a> Oncotarget. 7 (1), 459-472 (2016).</li></ol>

जबकि GSCs के पिछले अध्ययनों के सबसे मुख्य रूप से मार्करों कि उंहें परिभाषित पर ध्यान केंद्रित, इस अध्ययन में हम रिवर्स दृष्टिकोण लेने का फैसला किया । हम GSCs द्वारा उत्पन्न विभेदित जिन्नों पर मुख्य रूप से ध?...

हाल के अध्ययनों से पता चला है कि ट्यूमर कोशिकाओं की एक छोटी सी आबादी होते हैं, कैंसर स्टेम सेल (सीएससीएस) या ट्यूमर की शुरुआत कोशिकाओं, जो ट्यूमर प्रगति, मेटास्टेसिस, और chemo के प्रतिरोध के लिए जिंमेदार है-और रेडियो- 1चिकित्सा, 2. कैंसर की उपस्थिति स्टेम कोशिकाओं और उनके ट्यूमर के भीतर अधिक विभेदित जिन्नों intratumoral विविधता को बढ़ावा देने के एक महत्वपूर्ण कारक माना जाता है और इस प्रकार3कैंसर के इलाज में एक बड़ी बाधा का प्रतिनिधित्व करता है । ट्यूमर कोशिका पदानुक्रम, कैंसर स्टेम सेल सिद्धांत द्वारा प्रदान की गई है, नई रणनीतियों के विकास के लिए प्रेरित किया है 4कैंसर का इलाज । कैंसर को लक्षित करने के लिए एक दृष्टिकोण स्टेम सेल की पहचान करने और संकेत रास्ते है कि प्रभावित अंग के भ्रूण विकास के दौरान आवश्यक हो जाना जाता है रोकना है । दरअसल, हम और दूसरों को पहले से कई के लिए चल रही आवश्यकता का वर्णन कागजात प्रकाशित किया है स्टेम सेल-प्रासंगिक संकेतन रास्ते ध्वनि हेज हॉग और ग्लियोब्लास्टोमा में पायदान5,6,7। इस काम के कई जीबीएम नैदानिक परीक्षणों के लिए तर्क जमना में मदद मिली है । कैंसर स्टेम सेल लक्ष्यीकरण के लिए एक दूसरा दृष्टिकोण को अपने विभेद को बढ़ावा देने है । यह दृष्टिकोण retinoic एसिड (अतरा, एक विटामिन-एक एनालॉग) के साथ तीव्र promyelocytic ल्यूकेमिया के इलाज में नैदानिक और नैदानिक अध्ययनों से अनुकूल परिणाम के कारण समर्थन का एक बहुत कुछ प्राप्त हुआ है । यहां अतरा के लिए परिपक्वता ब्लॉक हटाने और कैंसर सेल विभेद8को बढ़ावा मिला था । हाल ही में, Piccirillo और सहकर्मियों को खूबसूरती से पता चला है कि BMP-4 astrocytes में महत्वपूर्ण विरोधी जीबीएम प्रभाव के साथ और vivo में9में GSC भेदभाव को बढ़ावा देता है ।
वर्तमान अध्ययन के लिए तर्क GSCs लक्ष्यीकरण के लिए एक "उलट इंजीनियरिंग" दृष्टिकोण पर आधारित है । जीबीएम में विशाल विविधता वर्तमान को देखते हुए और गरीब भेदभाव कैंसर की पहचान में से एक होने के साथ, हमने पूछा कि क्या हम एक astrocyte की तरह राज्य में एक और अधिक अनुकूल phenotype-भेदभाव को बढ़ावा देने सकता है । यहाँ, हम एक दिया ट्यूमर नमूना में GSCs बनाए रखने के संकेत रास्ते की पूर्व ज्ञान नहीं है, लेकिन बल्कि एक वांछित phenotype (उदाहरण के लिए GFAP धनात्मकता) को प्राप्त करने के लिए उद्देश्य.
इस रिपोर्ट में GSC-समृद्ध संस्कृतियों के transduction से GSC विभेदक रिपोर्टर-लाइनें स्थापित करने के लिए प्रयुक्त प्रक्रियाओं का वर्णन GSC क्लोनल चयन के लिए किया गया है । ग्लियोब्लास्टोमा neurosphere इस्तेमाल किया लाइनों अस्पताल San Raffaele में प्राथमिक ग्लियोब्लास्टोमा के निदान के साथ रोगियों से प्रोफेसर एंजेलो Vescovi की प्रयोगशाला में स्थापित किया गया-मिलानो, इटली । इन पंक्तियों में बड़े पैमाने पर कई प्रकाशनों 6,10,11,12,13,14में अध्ययन किया गया है । यह अत्यधिक की सिफारिश की है कि व्यक्तियों, जो अपनी प्रयोगशाला में इन तकनीकों को लागू करने में रुचि रखते है रिपोर्टर की प्रासंगिकता कैंसर स्टेम सेल स्वयं कोशिकाओं वे अध्ययन करने की योजना में नवीकरण क्षमता का निर्धारण (यह किसी भी रिपोर्टर के लिए सच है) । इन विट्रो clonogenic में से एक के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल क्षेत्र में स्वीकार किए जाते है परख इस15,16पूरा करने के लिए प्रदान की जाती है । अंत में, एक विस्तृत प्रोटोकॉल एक प्रवाह-cytometry आधारित दवा स्क्रीन में भिंनता रिपोर्टर लाइनों के उपयोग का वर्णन अंत में प्रदान की जाती है । नोट की, इसी तरह astroglial भेदभाव प्रणाली के लिए यहां वर्णित है, हम सफलतापूर्वक स्थापित किया है और पुष्टि GSC रिपोर्टर एक MAP2: GFP (न्यूरॉन भेदभाव) रिपोर्टर लाइनों को एकीकृत । इसलिए, इस पत्र में वर्णन के तरीके विभिंन कोशिका वंश में सेलुलर भेदभाव का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है ।
इस रिपोर्ट में कुछ आंकड़े हाल ही में एक प्रकाशन में पाया जा सकता है: "Atracurium Besylate और अंय neuromuscular ब्लॉकिंग एजेंटों astroglial भेदभाव और गिरेगा ग्लियोब्लास्टोमा स्टेम कोशिकाओं को बढ़ावा देने के18।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>ESGRO Complete Accutase</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SF006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (Hank&#39;s Balanced Salt Solution)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H6648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human GFAP Differentiation Reporter (pGreenZeo, Virus)</td>
			<td>SBI (System Biosciences)</td>
			<td>SR10015VA-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml sterile disposable reagent reservoirs</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>130184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolite T25 cm&#178; Flask Vented</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>130189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolite T75 cm&#178; Flask Vented</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>130190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Centrifuge tubes</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5ml Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 0.5 - 20uL</td>
			<td>VistaLab Technologies</td>
			<td>1060-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 5-250uL</td>
			<td>VistaLab Technologies</td>
			<td>1060-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi 12-channel pipette tips 25 &#956;l</td>
			<td>VistaLab Technologies</td>
			<td>4060-1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi 12-channel pipette tips 250 &#956;l</td>
			<td>VistaLab Technologies</td>
			<td>4060-9025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guava easyCyte 5HT Benchtop Flow Cytometer</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>0500-4005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH Clinical Collections 1 and 2 small molecule libraries</td>
			<td>Evotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For the preparation of neural stem cell media (500 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>GoldBio.com</td>
			<td>A-421-250</td>
			<td>0.20%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 10X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>90-091-PB</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3149</td>
			<td>0.0002%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1M</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4036</td>
			<td>5.4 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin- Selenium (ITS -G) (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>41400-045</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S-5761</td>
			<td>14.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8783</td>
			<td>16 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5780</td>
			<td>4.8 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic FGF (FGF2), Human</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>1140-02-50</td>
			<td>10 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF, Human</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>1150-04-100</td>
			<td>20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle-Top Filter, 150ml, 33mm, 0.22um, Pes, S, Ind</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431160</td>
			<td>Use to filter sterlize media</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometry-based drug screening system for the identification of small molecules that promote cellular differentiation of glioblastoma stem cells

ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम) वयस्कों में सबसे आम और सबसे घातक प्राथमिक मस्तिष्क ट्यूमर है, मोटे तौर पर अकेले अमेरिका में १४,००० मौतें हर साल होता है । माध्य अस्तित्व के बाद निदान अधिक से अधिक सर्जिकल लकीर, विकिरण, और temozolomide कीमोथेरेपी के साथ 15 महीने से भी कम है । अधिक प्रभावी जीबीएम उपचार के विकास में निहित चुनौतियों का तेजी से स्पष्ट हो गया है, और अपनी झुकते इनवेसिव, मानक उपचार के लिए अपने प्रतिरोध, अपनी आनुवंशिक जटिलता और आणविक अनुकूलन क्षमता, और जीबीएम की उपआबादी शामिल सामान्य स्टेम कोशिकाओं के लिए phenotypic समानता के साथ कोशिकाओं, इस के साथ साथ ग्लियोब्लास्टोमा स्टेम सेल (GSCs) के रूप में भेजा. क्योंकि GSCs ट्यूमर विकास और प्रगति के लिए आवश्यक हैं, भेदभाव आधारित चिकित्सा इन लाइलाज ट्यूमर के लिए एक व्यवहार्य उपचार रूपरेखा का प्रतिनिधित्व करता है ।
निंनलिखित प्रोटोकॉल प्रक्रियाओं का एक संग्रह का वर्णन एक उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग छोटे अणुओं है कि GSC astroglial भेदभाव को बढ़ावा देने की पहचान के उद्देश्य से मंच स्थापित करने के लिए । प्रणाली के मूल में एक glial fibrillary अंलीय प्रोटीन (GFAP) भेदभाव रिपोर्टर-निर्माण है । प्रोटोकॉल में निंनलिखित सामांय कार्यविधियां हैं: (1) GSC विभेदन रिपोर्टर लाइनें स्थापित करना; (2) GSC स्व-नवीकरण/clonogenic क्षमता के लिए रिपोर्टर की प्रासंगिकता को सत्यापित करने के लिए परीक्षण/ और (३) उच्च क्षमता वाली प्रवाह-cytometry आधारित औषध स्क्रीनिंग.
स्क्रीनिंग मंच एक सीधी और सस्ती दृष्टिकोण प्रदान करता है छोटे अणुओं है कि GSCs भेदभाव को बढ़ावा देने की पहचान । इसके अलावा, एफडीए अनुमोदित दवाओं के पुस्तकालयों का उपयोग एजेंटों की पहचान है कि अधिक तेजी से reपर्पज किया जा सकता है के लिए क्षमता रखती है । इसके अलावा, उपचार है कि कैंसर को बढ़ावा देने के सेल विभेद स्टेम वर्तमान के साथ synergistically काम करने की उंमीद कर रहे है "देखभाल के मानक" चिकित्सा कि लक्ष्य और मुख्य रूप से अधिक विभेदित कैंसर कोशिकाओं को खत्म करने के लिए दिखाया गया है ।

तीन स्वतंत्र रोगी-व्युत्पंन neurospheres लाइनों lentivirus astroglial रिपोर्टर एक ग्रीन-फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) में आपस में जुड़े के लिए एंकोडिंग के साथ transduced थे एक Zeocin प्रतिरोध कैसेट के साथ फ्रेम और मानव GFAP प्रवर्?...

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Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

ग्लियोब्लास्टोमा स्टेम कोशिकाओं के सेलुलर भेदभाव को बढ़ावा देने कि छोटे अणुओं की पहचान के लिए प्रवाह Cytometry आधारित दवा स्क्रीनिंग प्रणाली

एक कुशल स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल छोटे अणुओं है कि ग्लियोब्लास्टोमा स्टेम सेल (GSCs) में astroglial भेदभाव को बढ़ावा देने की पहचान के लिए प्रस्तुत किया है । परख एक स्टेम सेल भेदभाव रिपोर्टर जिससे बढ़ाया GFP (eGFP) की अभिव्यक्ति मानव GFAP प्रवर्तक से प्रेरित है पर आधारित है ।

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

The overall goal of this procedure is to screen small molecule libraries for agents that promote astroglial differentiation in glioblastoma stem cells. This method can help answer key questions in the cancer stem cell field, such as what are the signaling pathways that are required for maintaining glioblastoma stem cells in the undifferentiated state. Proper execution of this technique allows for the straightforward identification of small molecules that promote glioblastoma stem cell differentiation.The implication of this technique extend toward therapy for Ehlers-Danlos glioblastoma because reducing the percentage of glioblastoma stem cells may decrease the likelihood of recurrence. This method can also be applied to setting differentiation into other cell lineages using other reporter constructs. Our report is the first to establish a high throughput approach to screen for agents that force glioma stem cells to differentiate.Working with lentivirus particles in cancer cells derived from patients can be extremely hazardous. Therefore standard procedure for working with bloodborne pathogens should always be followed. To begin, seed one million glioblastoma stem cells or GSCs in two milliliters of complete neural stem cell growth medium in a six-well plate.Next, transduce the cells with the lentivirus reporter at a multiplicity of infection equal to five. To the cell and virus mixture, add two microliters of polybrene such that the final concentration is eight micrograms per milliliter, and incubate the cells at 37 degrees Celsius and 5%CO2 overnight. After incubation, replace the growth medium to remove unbound virus.And centrifuge cells at 360 times G for five minutes. Then carefully aspirate medium and plate cells back in a six-well plate. And continue to incubate the cells for 24 hours.Harvest 0.5 milliliters of the total culture volume. Pellet cells by centrifugation at 360 times G for five minutes at room temperature. Resuspend cells in 0.5 milliliters fresh neural stem cell growth medium.Place the plate back in the incubator to allow for expansion for at least 72 hours. Add 200 microliters of dissociation reagent and incubate for five minutes in a water bath set to 37 degrees Celsius. Dissociate cells by pippetting up and down gently.To the dissociated cells add 800 microliters of HBSS to ensure minimal cell attachment or aggregation. Next, transfer 200 microliters of each cell suspension into wells of a 96-multiwell plate. Determine the percentage of cells expressing the green fluorescent protein by flow cytometry.Record at least 10, 000 viable cells in each acquisition. In all flow cytometric analysis use parental non-transduced cells or vector-transduced nonfluorescent cells to establish baseline fluorescence. To select and expand individual subclones seed cells at a density of 0.7 cells per well in 100 microliters of neural stem cell medium in a 96-well plate.Maintain these clones in culture for 11 days. Look out for neurospheres with a diameter greater than 100 microns. We have previously established this cutoff size to retrospectively determine if the neuorsphere was originated by a self-renewing glioblastoma stem cell.This cutoff size may need optimization when working with different glioblastoma cell models. Observe the cells under a fluorescence microscope equipped with a FITC filter and mark wells that contain a single neurosphere in which approximately one 1%to 5%of the cells are GFP-positive. After marking, expand individual clones until a sufficient number of cells is available for flow cytometry analysis.Assuming the reporter clones contain 1%to 5%of GFP-positive cells, harvest 0.5 milliliters from each clone along with an equal quantity of non-transduced control cells to determine the exact percentage of GFP-positive cells. After pelleting cells at 360 times G for five minutes at room temperature, aspirate the supernatant. Add 200 microliters of dissociation reagent to each pellet and incubate the tubes in a water bath set to 37 degrees Celsius.After incubation, triturate the cells about 20 to 30 times to achieve a single cell suspension. Then add 800 microliters of HBSS to ensure minimal cell attachment or aggregation. Now transfer 200 microliters of each cell suspension into wells of a 96-multiwell plate.Finally, perform flow cytometry, recording at least 10, 000 viable cells in each acquisition. To assess the clonogenic capacity prepare single cell suspensions of differentiation reporter subclones by triturating the cells about 20 to 30 times. Then plate these cells in 100 microliters of complete neural stem cell growth medium at a density of about five to 500 cells per well in 96-multiwell plates.Maintain these cells in culture for nine to 11 days. Look for neurospheres under a light microscope. A well containing at least one single large neurosphere is considered positive.Considering parental non-transduced cells and GFP-positive lentivirus-transduced cells as controls input the total wells analyzed and the number of positive cells on the ELDA online interface. To begin screening, plate 5000 cells in 99 microliters of complete neural stem cell growth medium in a 96-well plate. Then with a 12-channel pipettor treat cells with two micromolar final concentration of diluted library compounds or with the DMSO control.Incubate the cells for 72 hours. Now add 150 microliters of cell dissociation reagent using a 12-channel pipettor in each well and incubate at 37 degrees Celsius for 20 minutes. Then gently triturate the cells in each well about 20 to 30 times using a 12-channel pipettor until a single cell suspension is achieved.Now perform flow cytometry and determine the percentage of cells expressing the GFAP:GFP reporter. First determine the cell size and viability from the forward and side scatters and gate the viable cell population. Then determine the GFP-positive cells within the viable cell population.An increase of percentage of GFP-positive cells by three standard deviations over controls is considered to be a positive hit which may be adjusted to accommodate user preference of stringency. Representative images of HSR-GBM1 GSC subclones expressing low and high levels of GFAP:GFP are shown. The subclones positive for GFAP:GFP expression were selected by flow cytometry for the patient-derived neurosphere line.Here, low GFAP:GFP indicates that less than 5%of the cells in the clone are GFP-positive, while high GFAP:GFP indicates that greater than 75%of the cells in the clone are GFP-positive. These results show that in vitro self-renewal capacity of GFAP-low subclones is higher than their GFAP-high counterparts as determined by ELDA. Therefore GH subclones are more differentiated than GL subclones.Finally, drug libraries were screened to identify agents capable to induce astroglial differentiation in GSCs. 12 drugs were found to significantly increase the percentage of cells expressing the GFAP:GFP reporter. Once mastered, this technique can be done in a few weeks if it is performed properly.Following this procedure other methods like alamarBlue assay, clonogenic assay in semisolid media, flank or intracranial xenograph injection can be performed in order to answer additional questions like the effect of selective drugs on cellular proliferation and clonogenicity in vitro and tumorigenicity in vivo. After watching this video, you should have a good understanding of how to identify compounds capable of inducing astroglial differentiation in glioblastoma stem cells.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

दवा स्क्रीनिंग के लिए उच्च प्रवाह तीन आयामी ट्यूमर Spheroids की पीढ़ी

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

लाइव सेल इमेजिंग परख ग्लियोब्लास्टोमा ब्रेन ट्यूमर स्टेम सेल प्रवासन और आक्रमण का अध्ययन करने के लिए

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

नव गठित स्तन कैंसर के प्रवाह Cytometric का पता लगाने के Apoptosis उत्क्रमण के बाद कोशिका की तरह स्टेम सेल

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

कैंसर स्टेम सेल को लक्षित करने के लिए एंटी-नोप्लास्टिक दवा स्क्रीनिंग के लिए फिजियोलॉजी रोगी व्युत्पन्न 3 डी स्फिरॉइड्स

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells

माउस स्तन एपिथेलियल एचसी11 और ईपीएच 4 कोशिकाओं का भेदभाव

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction ...

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Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter

ऐरेगए पुस्तकालयों की मध्यम-थ्रूपुट स्क्रीनिंग और ड्यूल-लूसिफ़ेरेज़-आधारित रिपोर्टर का उपयोग करके ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर नियामकों की पहचान

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

जेब्राफिश में प्राथमिक रोगी व्युत्पन्न ट्यूमर ज़ेनोग्राफ्ट की दवा जांच

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

प्रवासन और सेलुलर इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए पैटर्न वाले न्यूरॉन्स पर ग्लियोब्लास्टोमा स्टेम जैसी कोशिकाओं की सह-संस्कृति

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

Vivo में इम्युनोजेनेसिटी स्प्लेनिक टी कोशिकाओं के प्रवाह Cytometry द्वारा ट्यूमर व्युत्पन्न बाह्य कोशिकीय पुटिकाओं की स्क्रीनिंग

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...