Name: flow cytometry-based drug screening system for the identification of small molecules that promote cellular differentiation of glioblastoma stem cells
Uploaded: 2018-01-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells at JoVE.

Эта работа частично поддерживается R01CA187780 низ.

Примечание: Астроглиальных и нейрональных человека репортер систем были приобретены как расфасованных, концентрированные лентивирусные препаратов. Базовые знания потока цитометрии техники не требуется. Кроме того для полного использования этого протокола пользователю необходим до...

<ol>
	<li>Maher, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+glioma:+genetics+and+biology+of+a+grave+matter.">Malignant glioma: genetics and biology of a grave matter.</a> Genes Dev. 15 (11), 1311-1333 (2001).</li><li>Bonavia, R., Inda, M. M., Cavenee, W. K., Furnari, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+maintenance+in+glioblastoma:+a+social+network.">Heterogeneity maintenance in glioblastoma: a social network.</a> Cancer Res. 71 (12), 4055-4060 (2011).</li><li>Bao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+stem+cells+promote+radioresistance+by+preferential+activation+of+the+DNA+damage+response.">Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response.</a> Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).</li><li>Sul, J., Fine, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+gliomas:+new+translational+therapies.">Malignant gliomas: new translational therapies.</a> Mt Sinai J Med. 77 (6), 655-666 (2010).</li><li>Bar, E. E., Chaudhry, A., Farah, M. H., Eberhart, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+promotes+medulloblastoma+survival+via+Bc/II.">Hedgehog signaling promotes medulloblastoma survival via Bc/II.</a> Am J Pathol. 170 (1), 347-355 (2007).</li><li>Chu, Q., Orr, B. A., Semenkow, S., Bar, E. E., Eberhart, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+inhibition+of+glioblastoma+xenograft+initiation+and+clonogenic+growth+following+in+vivo+Notch+blockade.">Prolonged inhibition of glioblastoma xenograft initiation and clonogenic growth following in vivo Notch blockade.</a> Clin Cancer Res. 19 (12), 3224-3233 (2013).</li><li>Schreck, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Notch+target+Hes1+directly+modulates+Gli1+expression+and+Hedgehog+signaling:+a+potential+mechanism+of+therapeutic+resistance.">The Notch target Hes1 directly modulates Gli1 expression and Hedgehog signaling: a potential mechanism of therapeutic resistance.</a> Clin Cancer Res. 16 (24), 6060-6070 (2010).</li><li>Warrell, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+therapy+of+acute+promyelocytic+leukemia+with+tretinoin+(all-trans-retinoic+acid).">Differentiation therapy of acute promyelocytic leukemia with tretinoin (all-trans-retinoic acid).</a> N Engl J Med. 324 (20), 1385-1393 (1991).</li><li>Piccirillo, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+proteins+inhibit+the+tumorigenic+potential+of+human+brain+tumour-initiating+cells.">Bone morphogenetic proteins inhibit the tumorigenic potential of human brain tumour-initiating cells.</a> Nature. 444 (7120), 761-765 (2006).</li><li>Bar, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclopamine-mediated+hedgehog+pathway+inhibition+depletes+stem-like+cancer+cells+in+glioblastoma.">Cyclopamine-mediated hedgehog pathway inhibition depletes stem-like cancer cells in glioblastoma.</a> Stem Cells. 25 (10), 2524-2533 (2007).</li><li>Bar, E. E., Lin, A., Mahairaki, V., Matsui, W., Eberhart, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+increases+the+expression+of+stem-cell+markers+and+promotes+clonogenicity+in+glioblastoma+neurospheres.">Hypoxia increases the expression of stem-cell markers and promotes clonogenicity in glioblastoma neurospheres.</a> Am J Pathol. 177 (3), 1491-1502 (2010).</li><li>Kahlert, U. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133/CD15+defines+distinct+cell+subpopulations+with+differential+in+vitro+clonogenic+activity+and+stem+cell-related+gene+expression+profile+in+in+vitro+propagated+glioblastoma+multiforme-derived+cell+line+with+a+PNET-like+component.">CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component.</a> Folia Neuropathol. 50 (4), 357-368 (2012).</li><li>Lim, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+monocarboxylate+transporter-4+depletes+stem-like+glioblastoma+cells+and+inhibits+HIF+transcriptional+response+in+a+lactate-independent+manner.">Inhibition of monocarboxylate transporter-4 depletes stem-like glioblastoma cells and inhibits HIF transcriptional response in a lactate-independent manner.</a> Oncogene. 33 (35), 4433-4441 (2014).</li><li>Kahlert, U. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZEB1+Promotes+Invasion+in+Human+Fetal+Neural+Stem+Cells+and+Hypoxic+Glioma+Neurospheres.">ZEB1 Promotes Invasion in Human Fetal Neural Stem Cells and Hypoxic Glioma Neurospheres.</a> Brain Pathol. 25 (6), 724-732 (2014).</li><li>Hu, Y., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELDA:+extreme+limiting+dilution+analysis+for+comparing+depleted+and+enriched+populations+in+stem+cell+and+other+assays.">ELDA: extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays.</a> J Immunol Methods. 347 (1-2), 70-78 (2009).</li><li>Meyer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell-derived+clonal+analysis+of+human+glioblastoma+links+functional+and+genomic+heterogeneity.">Single cell-derived clonal analysis of human glioblastoma links functional and genomic heterogeneity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), 851-856 (2015).</li><li>Galli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+tumorigenic,+stem-like+neural+precursors+from+human+glioblastoma.">Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma.</a> Cancer Res. 64 (19), 7011-7021 (2004).</li><li>Spina, R., Voss, D. M., Asnaghi, L., Sloan, A., Bar, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atracurium+Besylate+and+other+neuromuscular+blocking+agents+promote+astroglial+differentiation+and+deplete+glioblastoma+stem+cells.">Atracurium Besylate and other neuromuscular blocking agents promote astroglial differentiation and deplete glioblastoma stem cells.</a> Oncotarget. 7 (1), 459-472 (2016).</li></ol>

Хотя большинство предыдущих исследований GSCs, сосредоточены главным образом на маркеры, которые определяют их в этом исследовании мы решили взять обратный подход. Мы ориентируемся прежде всего на дифференцированной потомков, порожденных GSCs (например, клетки, выражая астроглиальных и н...

Недавние исследования показали, что опухоли содержат небольшой численностью населения клеток, Рак стволовых клеток (ПОК) или инициирование опухоли клетки, которые отвечают за прогрессии опухоли, метастазы и устойчивость к химио - и радио терапии 1, 2. наличие раковых стволовых клеток и их более дифференцированной потомков в опухоли считается важным фактором содействия внутриопухолевых неоднородность и таким образом является главным препятствием в лечении рака3. Опухоли клеток иерархии, представленной теории стволовых клеток рака, вдохновило развитие новых стратегий для лечения рака 4. Один из подходов для ориентации Рак стволовых клеток заключается в выявлении и подавляют сигнальных путей, которые известны как требуется во время эмбрионального развития пораженного органа. Действительно мы и другие ранее опубликовали несколько документов, описывающих текущие требования нервные стволовых клеток соответствующие сигнальные пути Еж Соник и паз, глиобластома5,6,7. Эта работа помогла застывающих обоснование несколько GBM клинических испытаний. Второй подход для ориентации Рак стволовых клеток заключается в содействии их дифференциация. Этот подход получил много поддержки из-за благоприятные результаты доклинических и клинических исследований в лечении острого promyelocytic лейкоза с ретиноевой кислоты (ATRA, аналог витамина А). Здесь был найден ATRA удалить блок созревания и поощрять дифференциацию клеток рака8. Совсем недавно Пикирилло и коллеги элегантно показали, что BMP-4 вызывает дифференцировку РКГ в астроциты с значительным анти GBM эффекты in vitro и in vivo9.
Основания для нынешнего исследования основана на подходе «обратный инжиниринг» для ориентации GSCs. Учитывая огромные неоднородность, присутствующие в GBM и с плохой дифференциацией, будучи одним из отличительных признаков рака, мы спросили, если мы могли бы содействовать более благоприятные фенотип - дифференциация в экзоцитоз подобное состояние. Здесь мы не имеют предварительных знаний о сигнальных путей, которые поддерживать GSCs в данной опухоли образец, но скорее стремимся достичь желаемого фенотип (например СВМС позитивности).
В настоящем докладе описываются процедуры, используемые для установления GSC дифференциация репортер линии от трансдукции GSC-обогащенный культур GSC клонового отбора. Глиобластома нейросферы линии, используемые были созданы в лаборатории профессора Анджело Вескови от пациентов с диагнозом первичной глиобластомы в госпитале San Raffaele - Милан, Италия. Эти линии были широко изучены в ряде публикаций 6,10,11,12,13,14. Настоятельно рекомендуется, что люди, которые заинтересованы в осуществлении этих методов в их лаборатории определяют актуальность репортер способность самообновления Рак стволовых клеток в клетки, они планируют изучать (это верно для любого репортер). Подробный протокол для одного в vitro колониеобразования анализов в поле предоставляется для достижения этого15,16. Наконец подробный протокол описания использования дифференциация репортер линий на экране наркотиков цитометрии основе предоставляется в конце. Следует отметить аналогично системе дифференциации астроглиальных, описанных здесь, мы успешно создали и проверены линии репортер GSC интеграции репортер (нейрональных дифференциации) MAP2:GFP. Таким образом, методологии описывают в этом бумаги могут быть применены для изучения клеточной дифференцировке в различные ячейки.
Некоторые из фигур в настоящем докладе можно найти в недавней публикации: «атракурия бесилат других нервно блокирующих агентов астроглиальных дифференциация и содействия разрушающим стволовых клеток глиобластомы18.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>ESGRO Complete Accutase</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SF006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (Hank&#39;s Balanced Salt Solution)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H6648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human GFAP Differentiation Reporter (pGreenZeo, Virus)</td>
			<td>SBI (System Biosciences)</td>
			<td>SR10015VA-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml sterile disposable reagent reservoirs</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>130184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolite T25 cm&#178; Flask Vented</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>130189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolite T75 cm&#178; Flask Vented</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>130190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Centrifuge tubes</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5ml Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 0.5 - 20uL</td>
			<td>VistaLab Technologies</td>
			<td>1060-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 5-250uL</td>
			<td>VistaLab Technologies</td>
			<td>1060-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi 12-channel pipette tips 25 &#956;l</td>
			<td>VistaLab Technologies</td>
			<td>4060-1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi 12-channel pipette tips 250 &#956;l</td>
			<td>VistaLab Technologies</td>
			<td>4060-9025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guava easyCyte 5HT Benchtop Flow Cytometer</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>0500-4005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH Clinical Collections 1 and 2 small molecule libraries</td>
			<td>Evotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For the preparation of neural stem cell media (500 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>GoldBio.com</td>
			<td>A-421-250</td>
			<td>0.20%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 10X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>90-091-PB</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3149</td>
			<td>0.0002%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1M</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4036</td>
			<td>5.4 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin- Selenium (ITS -G) (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>41400-045</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S-5761</td>
			<td>14.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8783</td>
			<td>16 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5780</td>
			<td>4.8 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic FGF (FGF2), Human</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>1140-02-50</td>
			<td>10 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF, Human</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>1150-04-100</td>
			<td>20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle-Top Filter, 150ml, 33mm, 0.22um, Pes, S, Ind</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431160</td>
			<td>Use to filter sterlize media</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometry-based drug screening system for the identification of small molecules that promote cellular differentiation of glioblastoma stem cells

Глиобластома (GBM) является наиболее распространенным и наиболее смертоносных первичного мозга опухоль в взрослых, вызывая примерно 14 000 смертей каждый год в США в одиночку. Медиана выживаемости после диагностики находится менее чем в 15 месяцев с максимальной хирургической резекции, радиации и Темозоламид химиотерапии. Проблемы, присущие в разработке более эффективных методов лечения GBM стали все более очевидными и включить его непоколебимой инвазивность, его устойчивость к стандартной процедуры, ее генетических сложности и молекулярных адаптируемость и субпопуляций GBM клетки с фенотипические сходство с обычной стволовых клеток, далее именуемая глиобластома стволовых клеток (GSCs). Потому что GSCs необходимы для роста опухоли и прогрессии, на основе дифференциации терапия представляет механизм эффективным методом лечения для этих неизлечимой новообразования.
Следующий протокол описывает коллекцию процедур установить высокую пропускную способность, скрининг платформы, направленные на выявление малых молекул, которые способствуют GSC астроглиальных дифференцировки. Ядром системы является конструкцией репортер дифференциация глиальных фибриллово кислой белка (СВМС). Протокол содержит следующие общие процедуры: (1) создание РКГ дифференциация репортер линии; (2) тестирование/Проверка актуальности репортер GSC self обновление/колониеобразования емкости; и (3) высокой емкости цитометрии наркотиков скрининг.
Скрининг платформа обеспечивает простой и недорогой подход для выявления малые молекулы, которые способствуют GSCs дифференцировки. Кроме того использование библиотек FDA утвержденных препаратов имеет потенциал для идентификации агентов, которые можно многократно использовать более быстрыми темпами. Кроме того методы лечения, которые способствуют дифференцировки стволовых клеток рака, как ожидается, синергетически работать с текущей «стандарт медицинской помощи» терапии, которые показали и ликвидации прежде всего более дифференцированной раковые клетки.

Три независимых пациента производные neurospheres линии были преобразованы с журналистом астроглиальных человека, кодирование для Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) сливается в рама с Zeocin сопротивление кассету и управляется элементом человеческого СВМС промоутер (<strong cl...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells at JoVE.

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

Потока на основе цитометрии наркотиков скрининг системы для идентификации малых молекул, которые способствуют клеточной дифференцировки стволовых клеток глиобластомы

Эффективный скрининг протокол представлен для идентификации малых молекул, которые способствуют астроглиальных дифференцировки стволовых клеток глиобластомы (GSCs). Assay основан на которой выражение расширенной GFP (eGFP) управляется человека промоутер СВМС репортер дифференцировки стволовых клеток.

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

The overall goal of this procedure is to screen small molecule libraries for agents that promote astroglial differentiation in glioblastoma stem cells. This method can help answer key questions in the cancer stem cell field, such as what are the signaling pathways that are required for maintaining glioblastoma stem cells in the undifferentiated state. Proper execution of this technique allows for the straightforward identification of small molecules that promote glioblastoma stem cell differentiation.The implication of this technique extend toward therapy for Ehlers-Danlos glioblastoma because reducing the percentage of glioblastoma stem cells may decrease the likelihood of recurrence. This method can also be applied to setting differentiation into other cell lineages using other reporter constructs. Our report is the first to establish a high throughput approach to screen for agents that force glioma stem cells to differentiate.Working with lentivirus particles in cancer cells derived from patients can be extremely hazardous. Therefore standard procedure for working with bloodborne pathogens should always be followed. To begin, seed one million glioblastoma stem cells or GSCs in two milliliters of complete neural stem cell growth medium in a six-well plate.Next, transduce the cells with the lentivirus reporter at a multiplicity of infection equal to five. To the cell and virus mixture, add two microliters of polybrene such that the final concentration is eight micrograms per milliliter, and incubate the cells at 37 degrees Celsius and 5%CO2 overnight. After incubation, replace the growth medium to remove unbound virus.And centrifuge cells at 360 times G for five minutes. Then carefully aspirate medium and plate cells back in a six-well plate. And continue to incubate the cells for 24 hours.Harvest 0.5 milliliters of the total culture volume. Pellet cells by centrifugation at 360 times G for five minutes at room temperature. Resuspend cells in 0.5 milliliters fresh neural stem cell growth medium.Place the plate back in the incubator to allow for expansion for at least 72 hours. Add 200 microliters of dissociation reagent and incubate for five minutes in a water bath set to 37 degrees Celsius. Dissociate cells by pippetting up and down gently.To the dissociated cells add 800 microliters of HBSS to ensure minimal cell attachment or aggregation. Next, transfer 200 microliters of each cell suspension into wells of a 96-multiwell plate. Determine the percentage of cells expressing the green fluorescent protein by flow cytometry.Record at least 10, 000 viable cells in each acquisition. In all flow cytometric analysis use parental non-transduced cells or vector-transduced nonfluorescent cells to establish baseline fluorescence. To select and expand individual subclones seed cells at a density of 0.7 cells per well in 100 microliters of neural stem cell medium in a 96-well plate.Maintain these clones in culture for 11 days. Look out for neurospheres with a diameter greater than 100 microns. We have previously established this cutoff size to retrospectively determine if the neuorsphere was originated by a self-renewing glioblastoma stem cell.This cutoff size may need optimization when working with different glioblastoma cell models. Observe the cells under a fluorescence microscope equipped with a FITC filter and mark wells that contain a single neurosphere in which approximately one 1%to 5%of the cells are GFP-positive. After marking, expand individual clones until a sufficient number of cells is available for flow cytometry analysis.Assuming the reporter clones contain 1%to 5%of GFP-positive cells, harvest 0.5 milliliters from each clone along with an equal quantity of non-transduced control cells to determine the exact percentage of GFP-positive cells. After pelleting cells at 360 times G for five minutes at room temperature, aspirate the supernatant. Add 200 microliters of dissociation reagent to each pellet and incubate the tubes in a water bath set to 37 degrees Celsius.After incubation, triturate the cells about 20 to 30 times to achieve a single cell suspension. Then add 800 microliters of HBSS to ensure minimal cell attachment or aggregation. Now transfer 200 microliters of each cell suspension into wells of a 96-multiwell plate.Finally, perform flow cytometry, recording at least 10, 000 viable cells in each acquisition. To assess the clonogenic capacity prepare single cell suspensions of differentiation reporter subclones by triturating the cells about 20 to 30 times. Then plate these cells in 100 microliters of complete neural stem cell growth medium at a density of about five to 500 cells per well in 96-multiwell plates.Maintain these cells in culture for nine to 11 days. Look for neurospheres under a light microscope. A well containing at least one single large neurosphere is considered positive.Considering parental non-transduced cells and GFP-positive lentivirus-transduced cells as controls input the total wells analyzed and the number of positive cells on the ELDA online interface. To begin screening, plate 5000 cells in 99 microliters of complete neural stem cell growth medium in a 96-well plate. Then with a 12-channel pipettor treat cells with two micromolar final concentration of diluted library compounds or with the DMSO control.Incubate the cells for 72 hours. Now add 150 microliters of cell dissociation reagent using a 12-channel pipettor in each well and incubate at 37 degrees Celsius for 20 minutes. Then gently triturate the cells in each well about 20 to 30 times using a 12-channel pipettor until a single cell suspension is achieved.Now perform flow cytometry and determine the percentage of cells expressing the GFAP:GFP reporter. First determine the cell size and viability from the forward and side scatters and gate the viable cell population. Then determine the GFP-positive cells within the viable cell population.An increase of percentage of GFP-positive cells by three standard deviations over controls is considered to be a positive hit which may be adjusted to accommodate user preference of stringency. Representative images of HSR-GBM1 GSC subclones expressing low and high levels of GFAP:GFP are shown. The subclones positive for GFAP:GFP expression were selected by flow cytometry for the patient-derived neurosphere line.Here, low GFAP:GFP indicates that less than 5%of the cells in the clone are GFP-positive, while high GFAP:GFP indicates that greater than 75%of the cells in the clone are GFP-positive. These results show that in vitro self-renewal capacity of GFAP-low subclones is higher than their GFAP-high counterparts as determined by ELDA. Therefore GH subclones are more differentiated than GL subclones.Finally, drug libraries were screened to identify agents capable to induce astroglial differentiation in GSCs. 12 drugs were found to significantly increase the percentage of cells expressing the GFAP:GFP reporter. Once mastered, this technique can be done in a few weeks if it is performed properly.Following this procedure other methods like alamarBlue assay, clonogenic assay in semisolid media, flank or intracranial xenograph injection can be performed in order to answer additional questions like the effect of selective drugs on cellular proliferation and clonogenicity in vitro and tumorigenicity in vivo. After watching this video, you should have a good understanding of how to identify compounds capable of inducing astroglial differentiation in glioblastoma stem cells.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Assays клеток опухоли стволовых клеток глиобластомы мозга исследования миграции и вторжения

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

Обнаружение потока гранулярных новообразованной груди Рак стволовых клеток как клеток после разворота апоптоз

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Физиологические пациент выведенных 3D сфероидов для анти-неопластических наркотиков скрининга целевой рак стволовых клеток

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells

Дифференциация мышиной груди Эпителиальная HC11 и EpH4 клетки

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction ...

Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter

Идентификация регуляторов транскрипционных факторов с использованием средне-пролимчатого скрининга архиерейных библиотек и репортера на основе двойной люциферазы

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Скрининг наркотиков первичного пациента, полученных опухоли Xenografts в зебрафиш

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

Кокультура стволовых клеток глиобластомы на узорчатых нейронах для изучения миграции и клеточных взаимодействий

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

В городе Виво Скрининг иммуногенности внеклеточных везикул опухолевого происхождения методом проточной цитометрии селезеночных Т-клеток

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...

Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype

Объединенный скрининг библиотеки шРНК для выявления факторов, модулирующих фенотип лекарственной устойчивости

Understanding clinically relevant driver mechanisms of acquired chemo-resistance is crucial for elucidating ways to circumvent resistance and improve ...

Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells

Одновременная визуализация и обнаружение на основе проточной цитометрии множественных флуоресцентных маркеров старения в терапевтических стареющих раковых клетках, вызванных терапией

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, ...