Name: protocol for the solid-phase synthesis of oligomers of rna containing a 2'-o-thiophenylmethyl modification and characterization via circular dichroism
Uploaded: 2017-07-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism at JoVE

이 원고의 작성은 Colorado University Denver (JMRE)의 창업 자금을 통해 지원되었습니다. AF는 연구 및 창조 활동 상 (RaCAS, CU Denver)에서 지원을 인정하고자합니다. 콜로라도 주립 대학 덴버 연구 서비스 사무소 (University of Colorado Denver)에서 기부금을 충당하기 위해 자금을 지원합니다. 비디오 부분에 공헌 한 Cassandra Herbert 선생님과 Yannick K. Dzowo 선생님 께 감사드립니다.

1. RNA Oligonucleotides의 고상 합성 <ol><li> 각 포스 포르 아미 다이 트를 함유 한 용액의 제조 (표 1). <ol><li> 뉴클레오타이드의 수를 세고 각 염기에 해당하는 n + 1 방정식 (n = 뉴클레오타이드의 수)에 맞추고 표에 누락 된 값을 기입하십시오. 용적 = 0.1 M 농도의 뉴클레오타이드 당 0.15 mL, 무수 아세토 니트릴에 용해. </li><li> 오븐 건조한 10 mL 앰버 병 (Septum Top Amber 394 Amidite 13 mm ID x 20 mm OD Top)...

<ol>
	<li>Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+synthesis+of+oligodeoxypyrimidines+on+a+polymer+support.">The synthesis of oligodeoxypyrimidines on a polymer support.</a> Tetrahedron Lett. 21 (8), 719-722 (1980).</li><li>Beaucage, S. L., Caruthers, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deoxynucleoside+phosphoramidites-A+new+class+of+key+intermediates+for+deoxypolynucleotides.">Deoxynucleoside phosphoramidites-A new class of key intermediates for deoxypolynucleotides.</a> Tetrahedron Lett. 22 (20), 1859-1862 (1981).</li><li>Caruthers, M. 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R., Zuker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UNAFold:+software+for+nucleic+acid+folding+and+hybridization.">UNAFold: software for nucleic acid folding and hybridization.</a> Methods Mol Biol. 453, 3-31 (2008).</li><li>Breslow, R., Huang, D. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+metal+ions+including+Mg2++and+lanthanides+on+the+cleavage+of+ribonucleotides+and+RNA+model+compounds.">Effects of metal ions including Mg2+ and lanthanides on the cleavage of ribonucleotides and RNA model compounds.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (10), 4080-4083 (1991).</li><li>Blumberg, D. 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이 원고의 취지는 DNA 또는 RNA의 올리고 뉴클레오타이드의 합성을 성공적으로 달성하거나 향상시키기위한 분야의 연구자, 초보자 또는 전문가에게 가이드 역할을하는 것입니다. 설명 된 방법론은 표준 phosphoramidite 화학을 통해 자동화 된 DNA / RNA 합성기를 사용하는 고상 합성의 사용에 중점을 둡니다. 보고서는 RNA dodecamer의 합성, 정제 및 특성 분석을 단계별로 설명합니다. 또한, CD의 사용은 2 차 ?...

DNA / RNA의 올리고 뉴클레오타이드를 얻기위한 고상 합성은 포스 포르 아미 다이 빌딩 블록 4를 사용하는 1970 년대 1 , 2 , 3 이후 여러 분야에서 여러 분야에서 응용되고있다. 그 광범위한 영향의 예는 다음과 같습니다 : 클릭 화학 반응을 통한 라벨링에 미치는 영향 5 , 구조적 탐침 6 및 안티센스 기술 7 , 생물학적 메커니즘 8 , 9 , 유전 물질 10의 출처 및 다양한 천연 및 / 또는 화학적 변형 11 , 12를 포함 한다. 우리가 여기에서 사용하는 변형은 포함하는 RNA 올리고 뉴클레오타이드를 얻기위한 우리의 노력의 첫 번째 단계를 나타낸다.이 중요한 생체 고분자의 구조와 기능을 일시적으로 제어 할 수있는 광활성 프로브. 5 &#39;- [CUA CG G A AU CAU] -3&#39;/ 5 &#39;- [AUG AUU CCG UAG] -3&#39;(밑줄 친 위치는 C2&#39;- O- 티오 페닐 메틸 변형의 도입을 나타낸다. )이 연구의 초점을 구성합니다. 이 서열은 RNA 가닥의 단일 가닥 또는 이들의 상응하는 이중 구조 (다른 2 차 구조는 열역학적으로 안정한 것으로 예측되지 않음)의 정량 및 측정을 가능하게하기 위해 선택되었다. CD는 구조 파라미터, 즉 이중 형성 및 열 변성 전이를 확립하는 데 사용되었습니다. 합성 이러한 올리고 뉴클레오타이드를 얻는 전반적인 절차는 그림 1 에 나와 있으며 단계별 프로세스를 따르고 있습니다 : 자동화 된 고체상 합성 → Depr→ 정제 → 정량 → 특성화. 그림 2 는이 절차에서 필요한 단량체 단위를 표시합니다. RNA의 고체상 합성 (도 2 좌측) 및 예 G, A 및 C에 친 핵성 엑소 사이 클릭 아민을위한 염기 - 불안정성 보호기의 사용이 포스 화학에 기초한다는 점에서 DNA의 것과 유사 아세틸, 벤조일, 페녹시 아세틸, t- 부틸 또는 N , N- 디메틸 포름 아미드 ( 도 2 , 오른쪽). C2&#39;-OH 그룹 (데 옥시 올리고 뉴클레오타이드 바이오 폴리머에서 결핍 됨)의 존재로 인해 RNA에서 고려해야 할 또 하나의 측면은이 친 핵성 위치의 보호 및 후속 탈 보호에 통합되어야하는 추가 단계이다. 이와 관련하여, 실리콘 기반의 보호 그룹은 biorthogonal moieties (특정tert- 부틸 디메틸 실릴 (TBDMS) 및 트리 이소 프로필 실릴 옥시 메틸 (TOM)기를 대중적인 선택 ( 도 2 , 좌측 하단)으로 사용하여 불소 존재 하에서 탈 보호시켰다. 이 작업에서 표준화 된 phosphoramidite 화학을 사용하는 DNA / RNA 합성기에서 자동 합성을 수행했습니다. 인스트루먼트의 제조업체 설정에는 DNA 용 인산염 버전을 사용하는 경우 자동 희석 단계가 포함되며 사용자가 설정 한 양으로 희석하는 옵션이 포함됩니다. 그러나, 우리는 RNA phosphoramidite의 중량을 측정하고 수동으로 희석하기로 결정했다. 1) 표준 RNA의 가격은 더 높다 (어떤 경우에는 50 배 이상 비싸다). 2) 개질 된 포스 포르 아미 다이 트는 종종 소량으로 얻어진다; 3) 자동화 된 희석 단계 (제조자에 의해 설정 됨)를 사용할 때 낭비되는 물질의 양이 많다. 또한, 1) 상업적으로 입수 가능한 고체 지지체3 &#39;말단으로 기능하는 보호 된 핵 염기를 포함하는 핵산 ( 예 , CPG); 및 2) C2&#39;- O- 위치에서 TBDMS 그룹으로 보호 된 상업적 포스 포르 아미 다이 트 (표준 핵 염기). RNA 합성을 위해 조정 된 단계에 대한 자세한 설명과 설명과 함께 합성 단계의 자세한 목록이 그림 3 과 표 1 에 나와 있습니다. 또한, 그림 4 는 각각의 트리 트리 틸화 단계에서 방출 된 트리 튬 양이온을 정량화하는 &#39;Trityl Monitor&#39;옵션을 선택한 후 모든 단계에서 관찰되는 단계별 수율을 보여줍니다. 전형적으로, 우리의 경험에서, 제한 요인은 원하는 변형을 함유하는 포스 포르 아미 다이 트를 얻는 것이었다는 점은 주목할 가치가있다. 즉, 선택 사이트에서 수정 사항을 통합 할 수있는 합성 방법론을 개발하는 것입니다. 이 보고서에서 우리는우리가 상응하는 합성 방법론 인 C2&#39;- O- 티오 페닐 메틸기를 확립 한 변형 된 뉴클레오타이드의 혼입. 이 그룹은 크기가 작으며 어떤 방식 으로든 고상 합성에 영향을 미치지 않습니다. 이 그룹을 RNA의 올리고 뉴클레오타이드에 혼입시키는 것이 구조적 및 열역학적 파라미터 4 와 함께보고 되었기 때문에, 변형 된 포스 포르 아미 다이 트를 유도하는 유기 합성의 어떠한 측면도 본원에서 기술되지 않을 것이다. 탈 보호, 정제 및 특성화 외래 아민 및 β- 시아 노 에틸 기의 탈 보호는 CPG- 수지로부터의 절단과 동일한 단계에서 일어난다. 우리는 AMA의 수용액의 존재 하에서 얻어진 수지를 가열하고, 플루오 라이드 이온의 존재하에 C2&#39;- O- 실릴기를 절단하고,이어서 겔을 통해 정제하는 통상적으로 사용되는 조건을 적용 하였다전기 영동. 이들이 많은 경우에 표준 조건이되었지만, 염기성 조건이나 불소 이온에 불안정한 변형은 메탄올 / 탄산 칼륨 (MeOH / K 2 CO 3 ) 또는 부틸 아민과 같은 보다 온화한 조건 13 , 14 가 필요할 수 있습니다. 따라서, 대응하는 포스 포르 아미 다이 트상의 상이한 세트의 보호기가 필요하다. 또한, 우리는이 방법으로 이전의 경험과 다른 계기의 부족을 감안할 때 탈 보호 된 올리고머를 정제하는 데 바람직한 대안으로 전기 영동을 선택했습니다. 그러나 HPLC를 효과적인 방법으로 사용할 수도 있습니다 15 . 정제 된 올리고 뉴클레오티드의 특성 우리 그룹 (16)에 의해보고 된 절차를 사용하여, 질량 분석법, 비행의 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 시간 (MALDI-TOF)을 통하여 수행 하였다. 구조적 특성 분석 및<html> 얻어진 이중 가닥의 안정성은 CD 를 통해 수행되었다. 구체적으로, 우리는 CD를 이용하여, RNA의 변형 된 및 변형되지 않은 올리고 뉴클레오티드의 열 변성 전이를 결정하는데, 이는 ca에서 밴드의 타원율의 감소를 따른다. 270 nm, 그리고 210 nm에서 λ max 의 밴드 (음의 타원율)의 소멸. 하이브리드 화 전후의 스펙트럼 비교는 그들의 차이점을 설명하고 사용 된 방법론의 타당성을 입증하기 위해 제공됩니다. CD의 사용은 널리 핵산 구조적 모티프의 결정으로 인정하고 17 아미노산, 따라서 다양한 구조 및 열역학적 파라미터 (18)를 결정하는 도구로 이용 될 수있다; 그러나이 기술이 열 변성 전이를 평가하는 데 사용되는 예는 많지 않습니다. 일부 경우에는 G-quadruplexes를 포함하는 DNA에 대한 열 안정성 결정이 포함됩니다19 , 20 또는 RNA의 이중 가닥과 머리핀 21 . 이 보고서는 전문가가 아닌 독자 또는 시청자에게 이러한 유형의 조사를 원활하게 시작할 수있는 도구 세트를 제공 할 계획입니다. 이 흥미로운 과학 분야와 관련된 다른 연구소의 방법론 및 기술을 향상시키고 비교하는 데 도움이 될 것입니다. 이 보고서의 내용은 다양한 소스에서이 기술의 기존 프로토콜을 추가하고 각 단계에 대한 시각적 지원을 강화하고 경험을 촉진합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="778">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:445px;">AbsolveTM</td>
			<td style="width:152px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:117px;">6NE9711</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile 99.9%, HPLC Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>75-05-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile 99.9%, anhydrous for DNA sequencing</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>75-05-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acrylamide, 99+%</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>164850025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium chloride 98+%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>12125-02-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium citrate, dibasic 98%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3012-65-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium Fluoride&#160; 98.0%, ACS grade</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>12125-01-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium hydroxide 28-30% in water, ACS Plus</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>1336-21-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium persulfate</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>1444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Argon-ultra high purity</td>
			<td>&#160;Airgas</td>
			<td>7440-37-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bis-acrylamide Ultra pure</td>
			<td>VWR-Amresco</td>
			<td>172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Boric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A73-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Diethyl pyrocarbonate, 97%</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>A0368487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol, anhydrous, histological grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dehydrate 100.2%</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formamide&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-12-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydrochloric acid, 36.5-38.0%, Certified ACS Plus</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>7647-01-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Magnesium chloride hexahydrate, 99%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7786-30-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methanol, 99.9%,&#160; HPLC Grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methylamine 40% in water</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>74-89-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-Methyl-2-pyrrolidinone, andhydrous, 99.5%</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>872-50-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Opti-TOFTM 96 Well Insert (123 x 81 mm)&#160;</td>
			<td>MDS SCIEX</td>
			<td>1020157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase Away</td>
			<td>Molecular BioProducts</td>
			<td>7005-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium acetate, anhydrous 99.2%, Certified ACS</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>127-09-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium chloride, 100.5%, Certified ACS</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium phosphate monobasic dihydrate 99.0%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>13472-35-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2&#8217;,4&#8217; Triethylamine, 99+%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>121-44-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TEMED</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triethylamine trihydrofluoride, 98%</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>73602-61-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trifluoroacetic acid, 99%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>76-05-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">6&#8217;-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>480-66-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP154-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Urea</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>U15-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reagents for the RNA synthesis:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Deblocking mix, 3% trichloroacetic acid in dichloromethane</td>
			<td>Glen Research</td>
			<td>&#160;40-4140-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cap Mix A, THF/Pyridine/Acetic anhydride</td>
			<td>Glen Research</td>
			<td>40-4110-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cap Mix B, 10% 1-methylimidazole in THF</td>
			<td>Glen Research</td>
			<td>40-4120-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Activator, 0.25 M 5-ethylthio-1H-tetrazole in anhydrous acetonitrile</td>
			<td>Glen Research</td>
			<td>&#160;30-3140-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Oxidizing Solution, 0.02 M iodine in THF/Pyridine/Water</td>
			<td>Glen Research</td>
			<td>40-4330-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">U-RNA-CPG</td>
			<td>Glen Research</td>
			<td>20-3330-xx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ac-G-RNA-CPG&#160;</td>
			<td>Glen Research</td>
			<td>20-3324-xx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ac-G-CE Phosphoramidite&#160;</td>
			<td>Glen Research</td>
			<td>10-3025-xx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">U-CE Phosphoramidite</td>
			<td>Glen Research</td>
			<td>10-3030-xx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ac-C-CE Phosphoramidite</td>
			<td>Glen Research</td>
			<td>10-3015-xx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bz-A-CE Phosphoramidite&#160;</td>
			<td>Glen Research</td>
			<td>10-3003-xx</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protocol for the solid-phase synthesis of oligomers of rna containing a 2'-o-thiophenylmethyl modification and characterization via circular dichroism

고상 합성은 핵산, 특히 DNA 또는 RNA의 정식 및 변형 중합체를 수득하는데 사용되어 다양한 분야의 응용 및 상이한 연구 목적을 위해 널리 사용되는 방법론이되었다. 본원에 기술 된 절차는 C2&#39;- O- 위치에 위치한 0 개, 1 개 또는 2 개의 변형을 함유하는 RNA 5 &#39;- [CUA CGG AAU CAU] -3&#39;의 도데 카머의 합성, 정제 및 특성 규명에 초점을 둔다. 프로브는 2- 티오 페닐 메틸기를 기본으로하며, 표준 유기 합성법을 통해 RNA 뉴클레오타이드에 통합되고 각각의 포스 포르 아미 다이 트를 통해 상응하는 올리고 뉴클레오타이드로 도입된다. 이 보고서는 2&#39;- O- 아미노 말단에서 변형 된 2- 티오 페닐 메틸 작용 화 된 뉴클레오타이드뿐만 아니라 4 개의 정준 핵산 염기 (Uridine (U), Cytosine (C), Guanosine (G), Adenosine (A))를 통한 포스 포르 아미 다이 트 화학 반응을 이용한다. 위치; 그러나이 방법론은 큰 var수년에 걸쳐 개발 된 수정 사항들. 올리고 뉴클레오타이드는 표준 조건, 즉 암모니아와 메틸 아민 (AMA)과 불화 수소 / 트리 에틸 아민 / N- 메틸 피 롤리 디논의 혼합물 하에서 수지로부터 분리하고 탈 보호 한 제어 된 구멍 유리 (CPG) 지지체상에서 합성 하였다. 상응하는 올리고 뉴클레오티드는 역상 크로마토 그래피 (9 월 박, C (18) 칼 럼)을 통해 용출 탈염하고, 분리 한 다음 폴리 아크릴 아미드 전기 영동 (20 % 변성)를 통해 정제 하였다. 정량 및 구조 파라미터는 자외선 - 가시 광선 (UV-vis) 및 원 편광 이색 성 (CD) 광도 분석을 통해 각각 평가되었습니다. 이 보고서는이 분야에 착수하는 데 관심이있는 초보자 및 전문가를위한 자료 및 가이드 역할을하는 것을 목표로합니다. 새로운 기술과 방법론이 개발되면서 진행중인 작업으로 기대됩니다. 방법론과 기술에 대한 설명(phosphoramidite) 화학을 사용하는 DNA / RNA 신디사이저 (2013 년에 리퍼브되고 구매 됨)에 해당합니다.

C2&#39;- O- 위치에서 0, 1 또는 2 개의 2- 티오 페닐 메틸 변형을 함유하는 RNA 도데 카머의 합성은 상응하는 정제 및 특성화와 함께 기술된다. 또한 CD를 통해 수행 된 구조 분석에 대한 자세한 설명이 포함되어 있습니다. RNA의 4 가닥 (상보적인 서열을 갖는 가닥 포함)은 고상 합성을 통해 얻어졌으며,이어서 각 올리고 뉴클?...

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Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

이 기사는 C2&#39;- O 위치에서 변형 된 RNA의 dodecamer의 고체상 합성, 정제 및 특성화에 대한 자세한 절차를 제공합니다. UV-vis 및 원 편광 이색 광도 분석을 사용하여 구조적 측면, 즉 단일 가닥 또는 이중 가닥을 정량화하고 특성을 분석합니다.

2&#39;- 포스 핀 올리고 뉴클레오타이드를 함유하는 올리고머의 고상 합성을위한 프로토콜<em&gt; O</em&gt; 원형 이색 성을 통한 - 티오 페닐 메틸 변형 및 특성 분석

Solid-phase synthesis has been used to obtain canonical and modified polymers of nucleic acids, specifically of DNA or RNA, which has made it a popular ...

The overall goal of this report is to illustrate the procedure to obtain oligonucleotides of RNA via solid-phase synthesis. Dodecamers of RNA will be synthesized as models and their purification and characterization will also be demonstrated. Through its visual component, this publication will broaden the scope of the methodologies and facilities used to researchers in various fields.Providing a visual aid, along with a little protocol will enable researchers to employ these techniques. One advantage of this technique is its amenability to a wide range of modifications. As today's applications become more demanding, it is important to have a standard protocol.Phosphoramidite chemistry is experiencing a resurgence due to the robustness of the method and its potential for obtaining a oligonucleotides for therapeutic applications. While purchasing oligonucleotides is attractive, price and availability of modifications shift interest towards preparing these oligomers in-house, thus making this procedure of utmost importance. To begin this procedure, weigh each phosphoramidite into oven-dried 10-milliliter amber bottles and cap each bottle with a septum previously perforated with a 20-gauge needle.Place the bottles immediately under vacuum using a dessicator containing a drying agent. After filling the dessicator with dry argon, remove each bottle and immediately add anhydrous acetonitrile before securing onto a solid-phased peptide synthesizer. Next, remove the septa from each bottle, and place on the synthesizer via a bottle-change function.To set up the solid-phase synthesis, select the software icon. Select the synthesizer name, and click on OK.Then, create a new synthesis by selecting File, and New Synthesis Order. Following this, use the prompt window to enter the run date, customer, and run ID.Select the instrument, sequence name, and sequence.Under the Cycle tab, assign the previously created method. Then, choose the End Procedure manual, which leaves the oligonucleotide bound to the CPG resin. Select DMT Off.Save the file by selecting File and Save As.Then, provide a name for the experiment and click on Save. Next, send the file to begin synthesis by selecting Order and Send Order to Synthesizer. On the prompt window, select a column position and click on OK.On the Synthesizer window, select Trityl Monitor.Click on Choose Function, and Trityl Monitor every step by typing 1. Begin the synthesis by selecting Synthesizer and Prepare to Start. Place the columns with the desired three-prime end on the positions indicated on the instrument.Then, click Start and No on the instrument. Once the synthesis is complete, remove the column from the instrument and place it in a round-bottomed flask. Dry the column under reduced pressure for about 0.5 hours.Transfer the white resin from the column to a 1.6-milliliter centrifuge tube, and add 0.5 milliliters of an aqueous methylamine and ammonia solution. Secure the centrifuge tube cap with parafilm, and heat the contents to 60 degrees Celsius for one and a half hours. Place a heavy object on top of the tubes to ensure the concentration is kept constant.After cooling to room temperature, briefly centrifuge the sample to spin down contents. Then, transfer the supernatant to a new centrifuge tube. Cool the tube to 70 degrees Celsius by placing in a dry-ice ethanol bath for five minutes, and then concentrate until dry using a speed vac concentrator.Now, resuspend the solids in 0.4 milliliters of an amine trihydrafluoride solution, and then secure the cap with laboratory film. Heat the solution to 60 degrees Celsius for one and a half hours. Place a heavy object on top of the tubes to ensure constant concentration.After cooling the solution to room temperature, add 0.04 milliliters of a sodium acetate solution followed by gentle mixing with a pipette tip. Add one milliliter of ethanol and cool the solution to approximately 70 degrees Celsius with a dry-ice ethanol bath for 15 minutes. Following this, centrifuge the solution at 15, 000 RPM at four degrees Celsius for ten minutes.Use a pipette to extract the supernatant and dry the resulting pellet under reduced pressure. After drying, resuspend the obtained solid and loading buffer, and mix until the solution is homogenous. Then, load the suspension onto a previously prepared polyacrylamide gel.Apply a current through the gel until the bromethymol blue marker is located between one-half to two-thirds down the gel. After removing the gel from the stand, transfer the gel contents from the glass to the plastic wrap and place over a thin layer chromatography plate covered with silica, to visualize the bands using a UV lamp. Use a marker to delineate the position where the upper band is located, and cut it using a razor blade.Place the gel containing the RNA into a 50-milliliter conical tube, and crush it to small pieces using a glass rod. Now, suspend the gel residues into an aqueous sodium chloride solution, and shake the suspension at 37 degrees Celsius for 12 hours. Transfer the suspension into a 15-milliliter tube, and then centrifuge at 3400 RPM for ten minutes.To desalt the sample using a reverse-phase C18 cartridge, first wash the cartridge with acetonitrile, water, aqueous ammonium chloride, and the RNA solution, leaving the gel residues behind. After washing with water, elute the RNA from the column using three milliliters of 60%aqueous methanol solution into three different test tubes. Cool the tubes to 70 degrees Celsius in a dry ice bath for five minutes, and then concentrate the contents to dryness using a speed vac concentrator.After concentrating the eluant under reduced pressure, redissolve the residue in 0.3 milliliters of RNase-free water. After diluting the solution, deposit one microliter on the UV vis instrument to measure the UV vis spectrum between 200 and 450 nanometers. For MALDI-TOF analysis, first wash a C18 pipette tip with 50%acetonitrile.Equilibrate the pipette tip with 0.1%trifluoroacetic acid. Then, load the pipette tip with a solution containing 100 to 150 picomoles of sample. After washing the pipette tip with 0.1%TFA and water, elute the sample into a solution containing the desired matrix.Deposit 0.9 microliters of the solution onto a MALDI plate and allow the sample to dry. For RNA structure analysis, transfer the sample containing RNA into a microcuvette and position in the sample changer of a circular dichroism instrument. Open the nitrogen tank to provide a flow that moves the air floater located on the instrument to approximately 40.Then, turn on the cooler. Now, turn on the instrument. Open the software by clicking on the Spectrum Manager icon, and then open the Acquisition window by clicking on Spectrum Measurement.After purging the instrument with nitrogen, acquire the circular dichroism spectra by selecting Measure and Parameters. Under the General tab, select 200-350 nanometers for the scan, CD and HT for the channels, 0.1 nanometers for the data pitch, 100 nanometers per minute for the scanning speed, one nanometer for the bandwidth, and five for the number of accumulations. Under the Cell Unit tab, chose 20 degrees Celsius.Under the Control tab, select Shutter is opened and closed automatically. Under the Information tab, input the sample name, operator, concentration, and solvent. Under the Data tab, browse to desired folder, and click on OK.Acquire the spectra by clicking on Measure, and Sample Measurement.Finally, identify the positions of the cuvettes in sample changer one through six, and click on OK.The four strands of RNA were obtained via solid-phase synthesis, and following purification yielded between 300 and 700 nanomoles of each oligonucleotide. The MALDI-TOF chromatograms of the oligonucleotides are shown here. No major difference in the normalized UV vis spectra is observed from comparison of the band at 260 nanometers and canonical and modified oligonucleotides, whether comparing single-stranded samples or duplex structures.However, minor changes are observed upon measurement of their circular dichroism spectra. In addition, Tm measurements of the three duplex structures displayed a distinct value that was indicative of the destabilization induced by the incorporation of the two prime othyo phenylmethyl modification on one of the strands. It is important to remember that the yield of the solid-phase synthesis is depending on reagent purity.Moisture will have a negative impact on each step, cause the amount of water present must be reagent at all time. The reported methodology is meant to serve as a general resource for scientists. The technique may vary depending on the desired modification, available instrumentation, or time constraints.The type of chemistry employed herein represents a very robust methodology that has been in use since the 1980s, and is still heavily used in academic as well as industrial settings. After watching this video, you should be able to perform the synthesis, purification and characterization of your own modified or canonical oligonucleotides of RNA or DNA. Don't forget that working with the necessary reagents can be hazardous, and protective equipment such a safety goggles, gloves, and lab coats should be worn at all times.All reagents should be handled with care, and inside a fume hood when appropriate.

Research

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