Name: shifting zebrafish lethal skeletal mutant penetrance by progeny testing
Uploaded: 2017-09-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Shifting Zebrafish Lethal Skeletal Mutant Penetrance by Progeny Testing at JoVE.com

ونود أن أشكر كيميل تشاك للتوجيه ووكر Macie لعملها في إتقان وصمة عار الهيكل العظمى، ووكر تشارلين ودوود جون للحصول على مساعدة في وضع هذه الاستراتيجية تربية أولمان بوني لمشورة مفيدة الزرد. وأيد هذا العمل DE024190 K99/R00 إلى جتن.

وأنجزت جميع التجارب المبينة في هذا البروتوكول وفقا والامتثال من جامعة كولورادو وجامعة "ولاية أوريغون رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجان (إياكوك)-
 1-إعداد "الأوراق المالية غير محددة ابتداء من" <ol><li>تحديد الناقلين متخالف من اليل طافرة من اهتمام زعنفة مقطع 11</su...

<ol>
	<li>Nichols, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligament+versus+bone+cell+identity+in+the+zebrafish+hyoid+skeleton+is+regulated+by+mef2ca.">Ligament versus bone cell identity in the zebrafish hyoid skeleton is regulated by mef2ca.</a> Development. 143 (23), 4430-4440 (2016).</li><li>Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Zhao, F., Liu, D., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ahsa1+and+Hsp90+activity+confers+more+severe+craniofacial+phenotypes+in+a+zebrafish+model+of+hypoparathyroidism,+sensorineural+deafness+and+renal+dysplasia+(HDR).">Ahsa1 and Hsp90 activity confers more severe craniofacial phenotypes in a zebrafish model of hypoparathyroidism, sensorineural deafness and renal dysplasia (HDR).</a> Dis Model Mech. 6 (5), 1285-1291 (2013).</li><li>Cox, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+role+of+variant+histone+H3.3+for+ectomesenchyme+potential+of+the+cranial+neural+crest.">An essential role of variant histone H3.3 for ectomesenchyme potential of the cranial neural crest.</a> PLoS Genet. 8 (9), e1002938 (2012).</li><li>DeLaurier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+mef2ca+in+developmental+buffering+of+the+zebrafish+larval+hyoid+dermal+skeleton.">Role of mef2ca in developmental buffering of the zebrafish larval hyoid dermal skeleton.</a> Dev Biol. 385 (2), 189-199 (2014).</li><li>McGurk, P. D., Ben Lovely, C., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+Craniofacial+Morphogenesis+in+Zebrafish+Using+4D+Confocal+Microscopy.">Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy.</a> J Vis Exp. (83), e51190 (2014).</li><li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation.">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> J Vis Exp. (29), e1394 (2009).</li><li>Lush, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progeny+test+and+individual+performance+as+indicators+of+an+animal's+breeding+value.">Progeny test and individual performance as indicators of an animal's breeding value.</a> J Dairy Science. 18 (1), 1-19 (1935).</li><li>Lerner, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Population Genetics and Animal Improvement. , (1950).</li><li>Shinya, M., Sakai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Highly+Homogeneous+Strains+of+Zebrafish+Through+Full+Sib-Pair+Mating.">Generation of Highly Homogeneous Strains of Zebrafish Through Full Sib-Pair Mating.</a> G3. 1 (5), 377-386 (2011).</li><li>Neff, M. M., Neff, J. D., Chory, J., Pepper, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dCAPS,+a+simple+technique+for+the+genetic+analysis+of+single+nucleotide+polymorphisms:+experimental+applications+in+Arabidopsis+thaliana+genetics.">dCAPS, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics.</a> Plant J. 14 (3), 387-392 (1998).</li><li>Xing, L. Y., Quist, T. S., Stevenson, T. J., Dahlem, T. J., Bonkowsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+Efficient+Zebrafish+Genotyping+Using+PCR+with+High-resolution+Melt+Analysis.">Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis.</a> Jove-Journal of Visualized Experiments. (84), e51138 (2014).</li><li>He, C., Holme, J., Anthony, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNP+genotyping:+the+KASP+assay.">SNP genotyping: the KASP assay.</a> Methods Mol Biol. 1145, 75-86 (2014).</li><li>Semagn, K., Babu, R., Hearne, S., Olsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+nucleotide+polymorphism+genotyping+using+Kompetitive+Allele+Specific+PCR+(KASP):+overview+of+the+technology+and+its+application+in+crop+improvement.">Single nucleotide polymorphism genotyping using Kompetitive Allele Specific PCR (KASP): overview of the technology and its application in crop improvement.</a> Molecular Breeding. 33 (1), 1-14 (2014).</li><li>Yuan, J., Wen, Z., Gu, C., Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+high+throughput+and+cost+effective+SNP+genotyping+platforms+in+soybean.">Introduction of high throughput and cost effective SNP genotyping platforms in soybean.</a> Plant Genet Genomics Biotech. 2 (1), 90-94 (2014).</li><li>Walker, M. B., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-color+acid-free+cartilage+and+bone+stain+for+zebrafish+larvae.">A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae.</a> Biotech Histochem. 82 (1), 23-28 (2007).</li><li>Nasiadka, A., Clark, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+breeding+in+the+laboratory+environment.">Zebrafish breeding in the laboratory environment.</a> ILAR J. 53 (2), 161-168 (2012).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Schilling, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jaw+and+branchial+arch+mutants+in+zebrafish+I:+branchial+arches.">Jaw and branchial arch mutants in zebrafish I: branchial arches.</a> Development. 123, 329-344 (1996).</li><li>McCune, A. R., Carlson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twenty+ways+to+lose+your+bladder:+common+natural+mutants+in+zebrafish+and+widespread+convergence+of+swim+bladder+loss+among+teleost+fishes.">Twenty ways to lose your bladder: common natural mutants in zebrafish and widespread convergence of swim bladder loss among teleost fishes.</a> Evol Dev. 6 (4), 246-259 (2004).</li><li>Mrakov&#269;i&#269;, M., Haley, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inbreeding+depression+in+the+Zebra+fish+Brachydanio+rerio+(Hamilton+Buchanan).">Inbreeding depression in the Zebra fish Brachydanio rerio (Hamilton Buchanan).</a> J Fish Biol. 15 (3), 323-327 (1979).</li><li>Charlesworth, D., Willis, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+inbreeding+depression.">The genetics of inbreeding depression.</a> Nat Rev Genet. 10 (11), 783-796 (2009).</li><li>McCune, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+low+genomic+number+of+recessive+lethals+in+natural+populations+of+bluefin+killifish+and+zebrafish.">A low genomic number of recessive lethals in natural populations of bluefin killifish and zebrafish.</a> Science. 296 (5577), 2398-2401 (2002).</li><li>Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+clones+of+homozygous+diploid+zebra+fish+(Brachydanio+rerio).">Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio).</a> Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).</li><li>Dreosti, E., Lopes, G., Kampff, A. R., Wilson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+social+behavior+in+young+zebrafish.">Development of social behavior in young zebrafish.</a> Front Neural Circuits. 9, 39 (2015).</li><li>Eames, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FishFace:+interactive+atlas+of+zebrafish+craniofacial+development+at+cellular+resolution.">FishFace: interactive atlas of zebrafish craniofacial development at cellular resolution.</a> BMC Dev Bio. 13 (1), 23 (2013).</li><li>Nichols, J. T., Pan, L., Moens, C. B., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=barx1+represses+joints+and+promotes+cartilage+in+the+craniofacial+skeleton.">barx1 represses joints and promotes cartilage in the craniofacial skeleton.</a> Development. 140 (13), 2765-2775 (2013).</li><li>Sasaki, M. M., Nichols, J. T., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=edn1+and+hand2+Interact+in+early+regulation+of+pharyngeal+arch+outgrowth+during+zebrafish+development.">edn1 and hand2 Interact in early regulation of pharyngeal arch outgrowth during zebrafish development.</a> PLoS One. 8 (6), e67522 (2013).</li></ol>

الوراثي، يكشف عن الخفايا وظيفة الجينات
التحول تعمل متحولة أن تكون أكثر أو أقل حدة بالانتقاء الوراثي طريقة مباشرة لاكتساب رؤى جديدة في وظيفة الجينات. بالمقارنة مع الأساليب القياسية لتربية غير محددة، يمكن أن تسفر عن البروتوكول المعروضة هنا فهم كثير أكثر اكتمالا لت?...

الزرد نظام نموذج قوي لفهم التنمية الهيكل العظمى. مع سلالات متحولة الزرد، يمكن فك علماء البيولوجيا وظيفة الجينات أثناء سكيليتوجينيسيس. ومع ذلك، يمكن أن يقدم الزرد تعمل متحولة الهيكل العظمى مع متغير بينيترانسي1،2،3،4 التي يمكن أن تعيق تحليلات الخلقية والوراثية. والغرض من هذا الأسلوب ثلاثة إضعاف. أولاً، توليد خطوط متحولة الزرد التي تنتج دائماً تعمل شديدة تمكن الدراسات الإنمائية المتلقين للمعلومات مثل تسجيل الوقت الفاصل بين5 وزرع6. يمكن أن تكون شلت هذه الأنواع من الدراسات بمحاولة دراسة تعمل فقط المجاهرة بشكل غير متسق. ثانيا، يمكن إنقاص التهجين سلالات الزرد اختلاف الخلفية الوراثية، وبالتالي تعزيز الاتساق التجريبية وإمكانية تكرار نتائج. على سبيل المثال، أداء جميع في الموقع التهجين تحليلات على السلالة الفطرية بشكل انتقائي واحد يمكن الحد من تقلب التباس وتعزيز النتائج. ثالثا، سوف تكشف توليد سلالات شديدة وخفيفة المظهرية السلسلة بأكملها التي يمكن أن تنتج عن طفرة خاصة.
للوهلة الأولى، يبدو من المستحيل الوراثي من طفرات مميتة. كيف يمكن لسلالة واحدة ل penetrance عند الحيوانات التي هي سجل للتحديد ميتة؟ لحسن الحظ، أساليب لتربية انتقائية حسب الأسرة التحديد، التحديد ذرية الاختبار، قد أثبتت فعالية في تنمية الثروة الحيوانية البرامج للعديد من السنوات7،8. وتستخدم هذه البرامج أساسا للانتقاء الوراثي للصفات التي موجودة فقط في جنس واحد، مثل إنتاج الحليب في الأبقار أو إنتاج البيض في الدجاج. الذكور من هذه الأنواع لا يمكن أن يكون سجل مباشرة، ولكن سجل ذرياتهم وثم يتم تعيين قيمة للآباء والأمهات. الاقتراض من هذه الاستراتيجية، يتضمن البروتوكول المعروضة هنا النقاط الثابتة والملون المسخ نسل من زوج من الزرد التي متخالف لجينة متحولة للفائدة. يتم تعيين بينيترانسي من النمط الظاهري في ذرية متحولة قاتلة متماثل للآباء والأمهات عند البت فيها الأفراد سوف تنتج الجيل التالي في السطر. أننا نجد أن هذا الأسلوب وسيلة فعالة لتحويل penetrance في الزرد طفرات الهيكل العظمى القاتلة1.
مماثلة لغيرها من الدراسات، يأخذ هذا البروتوكول الوراثي تحت النظر في معايير مثل حجم مخلب، بقاء النسل، والتطور الطبيعي للأجنة، ونسبة الجنس9. ومع ذلك، هذه العوامل جميعا نظرت في سياق خلفية متحولة بهدف تحويل penetrance متحولة. ولذلك، يمتد هذا البروتوكول السابق الوراثي نماذج بتوفير طريقة لتعزيز التحليلات متحولة التنموية، فضلا عن زيادة تجانس الخلفية.
يتطلب هذا البروتوكول التنميط واسعة النطاق، حيث أنه من المهم وضع بروتوكول الوراثي السريع، ويمكن الاعتماد عليها في وقت مبكر. هناك كثير من التنميط البروتوكولات المتوفرة10،11، ومع ذلك نجد الصناعية التنميط12،،من1314 أسرع وتكلفة أكثر كفاءة وأكثر موثوقية من أساليب استناداً إلى انشقاق إنزيم التقييد لتضخيم تسلسل10. ولذلك، نقوم بتضمين بروتوكول الصناعية في هذا العمل. بالإضافة إلى ذلك، نركز على الهيكل العظمى تعمل المسخ في هذا البروتوكول وتشمل إجراء السيان الأزرق/الأليزارين الأحمر تلطيخ معدلة من البروتوكولات السابقة15.
الأسلوب الموصوفة هنا وضع استراتيجية واضحة لتحويل penetrance متحولة قاتلة إلى الأعلى أو إلى الأسفل. بينما يركز هذا البروتوكول على الهيكل العظمى تعمل متحولة، ونعتقد أنها ستكون استراتيجية مفيدة لتربية جميع خطوط الزرد المسخ. وفي الواقع، فائدة هذه الاستراتيجية تربية يحتمل يمتد إلى أبعد من الزرد. ونتنبأ بأنه يمكن تعديل هذا البروتوكول إزاحة penetrance في طائفة واسعة من الكائنات الحية. تحويل penetrance القاتلة عن طريق اختبار ذرية يمكن أن تساعد في دفع التقدم المحرز في أي الوراثة التنموية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="627">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Paraformaldehyde, pelleted, solid</td>
			<td style="width:125px;">Ted Pella Co.</td>
			<td style="width:119px;">18501</td>
			<td style="width:167px;">Pelleted PFA is a safer alternative to powdered PFA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Magnesium Chloride, solid</td>
			<td style="width:125px;">Acros Organics</td>
			<td>223210010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10x PBS, Aqueous</td>
			<td style="width:125px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP3994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">190 proof Ethanol</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alcian Blue, solid</td>
			<td style="width:125px;">Anatech Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">867</td>
			<td>Must be from Anatech</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alizarin Red, solid</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A5533-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycerol, liquid</td>
			<td style="width:125px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP229 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hydrogen peroxide, liquid</td>
			<td style="width:125px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP263500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Potassium hydroxide,&#160; solid</td>
			<td style="width:125px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">P250 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">StepOnePlus Real-time PCR Machine</td>
			<td style="width:125px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction Plate with Barcode (0.1mL)</td>
			<td style="width:125px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">4346906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microseal &#39;B&#39; seal</td>
			<td style="width:125px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">MSB1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KASP Master Mix, High ROX</td>
			<td style="width:125px;">LGC</td>
			<td>KBS-1016-022</td>
			<td>https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KASP By Design Primer Mix</td>
			<td style="width:125px;">LGC</td>
			<td style="width:119px;">KBS-2100-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris HCl, solid</td>
			<td style="width:125px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP153 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">potassium chloride, solid</td>
			<td style="width:125px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP366 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tween-20, liquid</td>
			<td style="width:125px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP337 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nonidet P40</td>
			<td style="width:125px;">ThermoFisher</td>
			<td>28324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tricaine-S</td>
			<td style="width:125px;">Western Chemicals</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:125px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1700 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T100 Thermal Cycler</td>
			<td style="width:125px;">BioRad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Controlled Drop Pasteur Pipets</td>
			<td style="width:125px;">Fisher</td>
			<td>13-678-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nanodrop</td>
			<td style="width:125px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>for DNA quantitation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

shifting zebrafish lethal skeletal mutant penetrance by progeny testing

وغالباً ما تعمل متحولة الزرد الاختراق غير كامل، يظهر فقط في بعض طفرات. تعمل المثيرة للاهتمام التي تظهر غير متسق يمكن أن يكون من الصعب على الدراسة، ويمكن أن يؤدي إلى التباس النتائج. بروتوكول الموصوفة هنا نموذج تربية مباشرة الزيادة والنقصان penetrance في طفرات مميتة الزرد الهيكل العظمى. لأنه لا يمكن بشكل انتقائي ولدت طفرات مميتة مباشرة، وتستخدم الاستراتيجية الكلاسيكية الوراثي لاختبار ذرية. ويشمل هذا الأسلوب أيضا بروتوكولات الزرد التنميط كومبيتيتيفي اليل محددة بكر (الصناعية) والمصبوغة الزرد اليرقات الغضاريف والعظام. تطبيق استراتيجية تربية الموصوفة هنا يمكن أن تزيد في بينيترانسي النمط الظاهري الهيكل العظمى للاهتمام تمكين المزيد من النتائج استنساخه في تطبيقات المتلقين للمعلومات. وباﻹضافة إلى ذلك، تناقص penetrance متحولة من خلال هذه الاستراتيجية الوراثي يمكن أن تكشف عن العمليات الإنمائية الأكثر حاسمة تتطلب وظيفة الجينات المتحولة. بينما على وجه التحديد يعتبر الهيكل العظمى هنا، فإننا نقترح أن هذه المنهجية ستكون مفيدة لجميع خطوط متحولة الزرد.

هذا البروتوكول أسلوب تربية طويلة الأمد مفيدة لفهم الزرد طفرات الهيكل العظمى (الشكل 1). تربية انتقائية عن طريق اختبار ذرية ينبغي أن تسفر عن تحول في بينيترانسي عموما كل التنازلي والتصاعدي في بضعة أجيال (الشكل 2). في عملنا السابق، قاد جولتين من...

Watch this Scientific Journal Video about Shifting Zebrafish Lethal Skeletal Mutant Penetrance by Progeny Testing at JoVE.com

Shifting Zebrafish Lethal Skeletal Mutant Penetrance by Progeny Testing

والهدف من هذا البروتوكول لتغيير بينيترانسي لقاتله تعمل متحولة الهيكل العظمى في الزرد بالانتقاء الوراثي. طفرات قاتلة لا يمكن أن ينمو إلى مرحلة البلوغ، وولدت أنفسهم، ولذلك يصف هذا البروتوكول وسيلة لتتبع وتحديد penetrance عبر أجيال متعددة من ذرية الاختبار.

تحويل الزرد الفتاكة Penetrance متحولة الهيكل العظمى بذرية اختبار

Zebrafish mutant phenotypes are often incompletely penetrant, only manifesting in some mutants. Interesting phenotypes that inconsistently appear can be ...

The overall goal of this breeding strategy is to manipulate mutant penetrance upward or downward. This selective breeding method enables a more complete understanding of mutant phenotypes. By generating high and low penetrance mutant strains, the entire phenotypic series of a mutation can be understood.Most zebrafish scale where mutants are recessive lethal, so homozygous mutants die before they can be directly bred. Therefore, we employ the classical selective breeding strategy of progeny testing, which we demonstrate here. We first had the item for this method when attempting to time lapse record ectopic bone cell development.Frustratingly, extra bone cells appeared in it frequently, so we set out to alter mutant penetrants by selective breeding. Although we perform this method on a zebrafish scale with a mutant line, it can also be applied to other zebrafish mutant phenotypes and likely, other organisms. After preparing unselected starting zebrafish stock according to the text protocol, carry out KASP genotyping as follows.Place the zebrafish tail tissue in 50 microliters of lysis buffer in the wells of a 96 well plate. Add 10 microliters of 10 milligrams per milliliter proteinase k per well and digest the tissue samples in a thermocycler at 55 degree celsius for two to five hours. Followed by a 20 minute 94 degree celsius inactivation step.Refrigerate the lysis product after digestion. Use a spectrophotometer to quantify the genomic DNA. Then, using molecular biology grade water, dilute the genomic template so that each reaction contains approximately 20 to 30 nanograms.Add 0.14 microliters of the KASP primer mix and five microliters of the KASP master mix per sample on ice, into a 1.5 milliliter microcentrifuge tube and mix well. Then, briefly centrifuge to collect the contents at the bottom of the tube. Pipette five microliters of primer master mix solution into the wells of a 96 well optical PCR plate suitable for the real time PCR machine being used.Then, pipette five microliters of diluted DNA template samples into each well and aspirate with a pipette to mix. Place an optically clear film seal over the plate, ensuring that the film is fully sealed on each well. Briefly centrifuge the plate at 600 x G to collect the contents at the bottom and to remove bubbles from the mix.After performing the main KASP reaction, view the resulting scatter plot produced by the analysis computer. House the identified heterozygous animals together on the main water system. After the animal recover from the fin clip, set up pairwise intercrosses, use dividers to ensure embryos are synchronized.Collect the embryos, and keep the parental pairs isolated in breeding cages. Monitor isolated adults, so that aggressive fish can be separated or provided with cover. To rear the embryos on day five or six, when the swim bladders is inflated in 75%of a clutch, use a glass pipette to collect phenotypically wild type animals.Place phenotypic wild types in the nursery, recording which parents yielded them. After anesthetizing larvae that do not inflate their swim bladders according to the text protocol, use a wide bore glass pasteur pipette to collect the animals into 1.5 milliliters microcentrifuge tubes. Remove the embryo water from each tube and replace it with one milliliter of 2%paraformaldehyde in 1x PBS.Rock the tubes for one hour to fix the animals. Track the tubes regularly during this and all subsequent rocking steps to ensure no larvae have become stuck to the side or clumped in the bottom of the tube. Use a glass pipette to remove the fixative from the tubes.Then add one milliliter of 50%ethanol. Rock the samples for an additional 10 minutes. Prepare fresh staining solution by adding 20 microliters of 0.5%alizarin red per one milliliter of Alcian premix.Remove the 50%ethanol, and add one milliliter of staining solution to each tube. Then, rock the tubes overnight. Within a few days after bleaching the embryos according to the text protocol, score stained mutant offspring for penetrants.In this example, we score for any occurrence of a topic bone. For the next generation, choose two high penetrants and two low penetrants families. Give each parental pair a sub stock identifier, for example, family 4.01, 02, et cetera.It's also helpful to indicate the or inbred generation number on all labels. House parental pairs on the main system with several mixed sex companion fish. Companion fish can be any zebrafish line with permanent obvious distinguishing features, such as altered pigmentation or fin structure.Label the tanks containing the wild type sibling larvae from selected families with the penetrants from the mutant siblings and raise the fish to adulthood as normal. Selective breeding by progeny testing, should yield a shift in overall penetrants both downward and upward in a few generations. In these examples, apply to the mef2ca b1086 mutant, high or low penetrants of a topic bone between the opercal and the branchiostegal ray in lethal homozygous mutants was selected for.In a successful cast procedure, type groupings of samples corresponding to gene type should be recognized by the computer program and the NTCs should be located near the origin of the plot after sufficient cycles have been performed. As demonstrated here, successful Alcian blue, alizarin red stain will have vibrantly stained bone and cartilage elements that are not transparent or faint. The boundaries of the cartilage elements should appear crisp and individual contracytes will be discernible.Alcian blue that is too concentrated were not clear from other tissues making analysis impossible. Implementing this technique from zebrafish line maintenance will likely alter penetrants in a few generations. Following this procedure, other methods like NC2 hybridization and timelapse imaging studies may yield more consistent results.We use this technique to explore the heritability of phenotype variation. After watching this video, you should have a good understanding of how to selectively breed your mutant strains to alter penetrance, even if the mutation is lethal.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Developmental Biology

Unit 2

Mendelian Genetics

SCIENTISTS IN ACTION

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

التجديد الكلى في اسماك الزرد الكبار قبل جنتاميسين المستحثة الإصابات

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Microbead زرع الأجنة الزرد

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

تحليل الزرد اليرقات الهيكل العظمي النزاهة العضلات مع ايفانز الأزرق صبغ

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

جيل من التعايش الالتصاقي الزرد الأجنة التي كتبها فيوجن الجراحي لتطوير الأريمات

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

تحريض الحاد الهيكل العظمي تجديد العضلات التي Cardiotoxin حقن

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

تشريح اليرقات الزرد الغدد التناسلية الأنسجة

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

تحديد أسلاف ريدثروميلويد وذريتهم في الجنين الماوس عن طريق التدفق الخلوي

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

ثقافة الكبار المعدلة وراثيا الزرد الشبكية إإكسبلنتس التصوير خلية حية من قبل Multiphoton المجهر

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

عزل من النوع الأول والنوع الثاني بيريسيتس من عضلات الماوس الهيكل العظمي

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

تحديد خلايا الهيكل العظمى والعضلات الأقمار الصناعية قبل الفلورة مع Pax7 والأجسام المضادة لامينين

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...