Name: shifting zebrafish lethal skeletal mutant penetrance by progeny testing
Uploaded: 2017-09-01T15:00:00
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Nous tenons à remercier Chuck Kimmel pour orientation, John Dowd pour aide à l’élaboration de cette stratégie de reproduction, Macie Walker pour son travail en perfectionnant la tache squelettique et Charline Walker et Bonnie Ullmann pour obtenir des conseils utiles de poisson-zèbre. Ce travail a été soutenu par DE024190 K99/R00 à JTN.

toutes les expériences décrites dans le présent protocole ont été achevés en conformité et le respect de l’Université du Colorado et de l’Université de l’Oregon animalier institutionnel et utilisation comités (IACUC).
 1. préparer le Stock de départ non sélectionnés <ol><li>Identify hétérozygotes porteurs de l’allèle mutant d’intérêt par la nageoire clip 11 et génotypage un stock d’animaux plein-frère par une méthode de choix, tels ...

<ol>
	<li>Nichols, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligament+versus+bone+cell+identity+in+the+zebrafish+hyoid+skeleton+is+regulated+by+mef2ca.">Ligament versus bone cell identity in the zebrafish hyoid skeleton is regulated by mef2ca.</a> Development. 143 (23), 4430-4440 (2016).</li><li>Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Zhao, F., Liu, D., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ahsa1+and+Hsp90+activity+confers+more+severe+craniofacial+phenotypes+in+a+zebrafish+model+of+hypoparathyroidism,+sensorineural+deafness+and+renal+dysplasia+(HDR).">Ahsa1 and Hsp90 activity confers more severe craniofacial phenotypes in a zebrafish model of hypoparathyroidism, sensorineural deafness and renal dysplasia (HDR).</a> Dis Model Mech. 6 (5), 1285-1291 (2013).</li><li>Cox, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+role+of+variant+histone+H3.3+for+ectomesenchyme+potential+of+the+cranial+neural+crest.">An essential role of variant histone H3.3 for ectomesenchyme potential of the cranial neural crest.</a> PLoS Genet. 8 (9), e1002938 (2012).</li><li>DeLaurier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+mef2ca+in+developmental+buffering+of+the+zebrafish+larval+hyoid+dermal+skeleton.">Role of mef2ca in developmental buffering of the zebrafish larval hyoid dermal skeleton.</a> Dev Biol. 385 (2), 189-199 (2014).</li><li>McGurk, P. D., Ben Lovely, C., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+Craniofacial+Morphogenesis+in+Zebrafish+Using+4D+Confocal+Microscopy.">Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy.</a> J Vis Exp. (83), e51190 (2014).</li><li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation.">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> J Vis Exp. (29), e1394 (2009).</li><li>Lush, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progeny+test+and+individual+performance+as+indicators+of+an+animal's+breeding+value.">Progeny test and individual performance as indicators of an animal's breeding value.</a> J Dairy Science. 18 (1), 1-19 (1935).</li><li>Lerner, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Population Genetics and Animal Improvement. , (1950).</li><li>Shinya, M., Sakai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Highly+Homogeneous+Strains+of+Zebrafish+Through+Full+Sib-Pair+Mating.">Generation of Highly Homogeneous Strains of Zebrafish Through Full Sib-Pair Mating.</a> G3. 1 (5), 377-386 (2011).</li><li>Neff, M. M., Neff, J. D., Chory, J., Pepper, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dCAPS,+a+simple+technique+for+the+genetic+analysis+of+single+nucleotide+polymorphisms:+experimental+applications+in+Arabidopsis+thaliana+genetics.">dCAPS, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics.</a> Plant J. 14 (3), 387-392 (1998).</li><li>Xing, L. Y., Quist, T. S., Stevenson, T. J., Dahlem, T. J., Bonkowsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+Efficient+Zebrafish+Genotyping+Using+PCR+with+High-resolution+Melt+Analysis.">Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis.</a> Jove-Journal of Visualized Experiments. (84), e51138 (2014).</li><li>He, C., Holme, J., Anthony, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNP+genotyping:+the+KASP+assay.">SNP genotyping: the KASP assay.</a> Methods Mol Biol. 1145, 75-86 (2014).</li><li>Semagn, K., Babu, R., Hearne, S., Olsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+nucleotide+polymorphism+genotyping+using+Kompetitive+Allele+Specific+PCR+(KASP):+overview+of+the+technology+and+its+application+in+crop+improvement.">Single nucleotide polymorphism genotyping using Kompetitive Allele Specific PCR (KASP): overview of the technology and its application in crop improvement.</a> Molecular Breeding. 33 (1), 1-14 (2014).</li><li>Yuan, J., Wen, Z., Gu, C., Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+high+throughput+and+cost+effective+SNP+genotyping+platforms+in+soybean.">Introduction of high throughput and cost effective SNP genotyping platforms in soybean.</a> Plant Genet Genomics Biotech. 2 (1), 90-94 (2014).</li><li>Walker, M. B., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-color+acid-free+cartilage+and+bone+stain+for+zebrafish+larvae.">A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae.</a> Biotech Histochem. 82 (1), 23-28 (2007).</li><li>Nasiadka, A., Clark, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+breeding+in+the+laboratory+environment.">Zebrafish breeding in the laboratory environment.</a> ILAR J. 53 (2), 161-168 (2012).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Schilling, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jaw+and+branchial+arch+mutants+in+zebrafish+I:+branchial+arches.">Jaw and branchial arch mutants in zebrafish I: branchial arches.</a> Development. 123, 329-344 (1996).</li><li>McCune, A. R., Carlson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twenty+ways+to+lose+your+bladder:+common+natural+mutants+in+zebrafish+and+widespread+convergence+of+swim+bladder+loss+among+teleost+fishes.">Twenty ways to lose your bladder: common natural mutants in zebrafish and widespread convergence of swim bladder loss among teleost fishes.</a> Evol Dev. 6 (4), 246-259 (2004).</li><li>Mrakov&#269;i&#269;, M., Haley, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inbreeding+depression+in+the+Zebra+fish+Brachydanio+rerio+(Hamilton+Buchanan).">Inbreeding depression in the Zebra fish Brachydanio rerio (Hamilton Buchanan).</a> J Fish Biol. 15 (3), 323-327 (1979).</li><li>Charlesworth, D., Willis, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+inbreeding+depression.">The genetics of inbreeding depression.</a> Nat Rev Genet. 10 (11), 783-796 (2009).</li><li>McCune, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+low+genomic+number+of+recessive+lethals+in+natural+populations+of+bluefin+killifish+and+zebrafish.">A low genomic number of recessive lethals in natural populations of bluefin killifish and zebrafish.</a> Science. 296 (5577), 2398-2401 (2002).</li><li>Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+clones+of+homozygous+diploid+zebra+fish+(Brachydanio+rerio).">Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio).</a> Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).</li><li>Dreosti, E., Lopes, G., Kampff, A. R., Wilson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+social+behavior+in+young+zebrafish.">Development of social behavior in young zebrafish.</a> Front Neural Circuits. 9, 39 (2015).</li><li>Eames, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FishFace:+interactive+atlas+of+zebrafish+craniofacial+development+at+cellular+resolution.">FishFace: interactive atlas of zebrafish craniofacial development at cellular resolution.</a> BMC Dev Bio. 13 (1), 23 (2013).</li><li>Nichols, J. T., Pan, L., Moens, C. B., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=barx1+represses+joints+and+promotes+cartilage+in+the+craniofacial+skeleton.">barx1 represses joints and promotes cartilage in the craniofacial skeleton.</a> Development. 140 (13), 2765-2775 (2013).</li><li>Sasaki, M. M., Nichols, J. T., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=edn1+and+hand2+Interact+in+early+regulation+of+pharyngeal+arch+outgrowth+during+zebrafish+development.">edn1 and hand2 Interact in early regulation of pharyngeal arch outgrowth during zebrafish development.</a> PLoS One. 8 (6), e67522 (2013).</li></ol>

Élevage sélectif dévoile les subtilités de la fonction du gène
Déplacement des phénotypes mutants pour être plus ou moins graves par reproduction sélective est un moyen simple pour acquérir de nouvelles connaissances en fonction des gènes. En comparaison avec des méthodes normalisées de reproduction non sélectionnée, le protocole présenté ici peut donner une compréhension plus complète des phénotypes mutants. Plus précisément, en générant des souches qu...

Le poisson-zèbre est un système puissant modèle pour comprendre le développement du squelette. Avec des souches mutantes de poisson-zèbre, les biologistes peuvent déchiffrer la fonction du gène au cours de la formation squelettique. Cependant, les phénotypes mutants squelette de poisson-zèbre peuvent présenter avec une pénétrance variable1,2,3,4 qui peut gêner les analyses génétiques et de développement. Le but de cette méthode est triple. Tout d’abord, générant zebrafish lignées mutantes qui produisent régulièrement des phénotypes sévères permet des études sur le développement en aval comme enregistrement Time-lapse5 et transplantation6. Ces sortes d’études peuvent être paralysés en essayant d’étudier les phénotypes qui seulement manifestent de façon incohérente. Deuxièmement, consanguinité zebrafish souches peut diminuer la variation génétique, favorisant ainsi la reproductibilité et la cohérence expérimentale. Par exemple, les analyses d’hybridation sur une souche consanguine sélectivement tous in situ peuvent réduire la variabilité confondant et renforcer les conclusions. En troisième lieu, générant des souches sévères et douces vous révélera toute la série phénotypique qui peut résulter d’une mutation particulière.
À première vue, un élevage sélectif de mutants létaux semble impossible. Comment une race pour la pénétrance lorsque les animaux sont marqués pour la sélection sont morts ? Heureusement, méthodes d’élevage sélectif de sélection familiale, spécifiquement les descendants essais, ont démontré l’efficacité dans l’élevage des programmes pour les nombreuses années7,8. Ces programmes sont principalement utilisés pour la reproduction sélective pour les caractères qui ne sont présentes que dans un sexe, comme la production de lait chez la vache ou la production d’oeufs chez les poules. Les mâles de ces espèces ne peuvent être marqués directement, mais leur progéniture est notés et une valeur est alors attribuée aux parents. Empruntant cette stratégie, le protocole présenté ici consiste à marquer la progéniture mutante fixe et teintée d’une paire de poisson-zèbre qui sont hétérozygotes pour un gène mutant d’intérêt. La pénétrance d’un phénotype dans la descendance mutante mortelle homozygote est attribuée aux parents lorsqu’ils décident quels individus vont produire la prochaine génération de la ligne. Nous constatons que cette méthode est un moyen efficace de déplacer une pénétrance in zebrafish mutants squelettique létale1.
Semblable à d’autres études, ce protocole de reproduction sélective prend en vertu de critères d’examen comme couvée, la survie de la progéniture, développement normal des embryons et sex-ratio9. Toutefois, ces facteurs sont tous considérés dans le contexte d’un fond de mutants dans le but de déplacer la pénétrance mutante. Par conséquent, ce protocole étend précédent paradigmes de reproduction sélective en proposant une méthode pour renforcer les analyses mutants du développement ainsi que pour accroître l’homogénéité de l’arrière-plan.
Ce protocole requiert une vaste génotypage, aussi est-il important de développer un protocole fiable et rapide de génotypage à l’avance. Il y a nombreux génotypage protocoles disponibles10,11, cependant, nous trouvons le KASP génotypage12,13,14 est plus rapide, plus efficace et plus fiable que les méthodes de coût issu des enzymes de restriction le clivage des séquences amplifiées10. Par conséquent, nous incluons un protocole KASP dans ce travail. En outre, nous concentrer sur les phénotypes mutants squelettiques dans le présent protocole et incluent une procédure pour une coloration modifiée de précédents protocoles15Alcian bleu/alizarine rouge.
La méthode décrite ici est une stratégie simple pour déplacer une pénétrance mutante mortelle vers le haut ou vers le bas. Alors que ce protocole met l’accent sur les phénotypes mutants squelettiques, nous pensons que ce sera une stratégie utile pour l’élevage de poisson-zèbre mutant toutes les lignes. En fait, l’utilité de cette stratégie de reproduction susceptible s’étend au-delà de poisson-zèbre. Nous prédisons que ce protocole peut être modifié pour décaler la pénétrance dans un large éventail d’organismes. Décalant pénétrance létale de tests de descendance peut aider à faire avancer l’état d’avancement d’un généticien du développement.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="627">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Paraformaldehyde, pelleted, solid</td>
			<td style="width:125px;">Ted Pella Co.</td>
			<td style="width:119px;">18501</td>
			<td style="width:167px;">Pelleted PFA is a safer alternative to powdered PFA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Magnesium Chloride, solid</td>
			<td style="width:125px;">Acros Organics</td>
			<td>223210010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10x PBS, Aqueous</td>
			<td style="width:125px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP3994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">190 proof Ethanol</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alcian Blue, solid</td>
			<td style="width:125px;">Anatech Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">867</td>
			<td>Must be from Anatech</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alizarin Red, solid</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A5533-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycerol, liquid</td>
			<td style="width:125px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP229 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hydrogen peroxide, liquid</td>
			<td style="width:125px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP263500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Potassium hydroxide,&#160; solid</td>
			<td style="width:125px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">P250 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">StepOnePlus Real-time PCR Machine</td>
			<td style="width:125px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction Plate with Barcode (0.1mL)</td>
			<td style="width:125px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">4346906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microseal &#39;B&#39; seal</td>
			<td style="width:125px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">MSB1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KASP Master Mix, High ROX</td>
			<td style="width:125px;">LGC</td>
			<td>KBS-1016-022</td>
			<td>https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KASP By Design Primer Mix</td>
			<td style="width:125px;">LGC</td>
			<td style="width:119px;">KBS-2100-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris HCl, solid</td>
			<td style="width:125px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP153 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">potassium chloride, solid</td>
			<td style="width:125px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP366 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tween-20, liquid</td>
			<td style="width:125px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP337 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nonidet P40</td>
			<td style="width:125px;">ThermoFisher</td>
			<td>28324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tricaine-S</td>
			<td style="width:125px;">Western Chemicals</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:125px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1700 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T100 Thermal Cycler</td>
			<td style="width:125px;">BioRad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Controlled Drop Pasteur Pipets</td>
			<td style="width:125px;">Fisher</td>
			<td>13-678-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nanodrop</td>
			<td style="width:125px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>for DNA quantitation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

shifting zebrafish lethal skeletal mutant penetrance by progeny testing

Poisson zèbre phénotypes mutants sont souvent incomplètement par ressuage, se manifestant uniquement chez certains mutants. Des phénotypes intéressants qui apparaissent de manière irrégulière peuvent être difficiles à étudier et peuvent mener à la confusion des résultats. Le protocole décrit ici est un paradigme de reproduction simple pour augmenter ou diminuer la pénétrance chez les mutants squelettique létale de poisson-zèbre. Parce que des mutants létaux ne peuvent être sélectivement directement, la stratégie de reproduction sélective classique des tests de descendance est employée. Cette méthode comprend également les protocoles pour Kompetitive allèle spécifique PCR (KASP) génotypage poisson zèbre et coloration larves de poisson zèbre cartilage et OS. Application de la stratégie d’élevage décrite ici peut augmenter la pénétrance d’un phénotype squelettique intéressant permettant des résultats plus reproductibles dans les applications en aval. En outre, diminuant la pénétrance mutante grâce à cette stratégie de reproduction sélective peut révéler les processus de développement qui nécessitent surtout la fonction du gène muté. Le squelette est considérée comme plus précisément ici, nous proposons que cette méthodologie sera utile pour toutes les lignées mutantes de poisson-zèbre.

Ce protocole est une technique d’élevage à long terme utile pour les mutants de squelette de poisson-zèbre de compréhension (Figure 1). Élevage sélectif en testant la progéniture devrait produire un changement dans une pénétrance globale aussi bien vers le bas et vers le hausse dans quelques générations (Figure 2). Dans nos travaux précédents, deux cycles de reproduction sélective a roulé la pénétrance moyenne ...

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Shifting Zebrafish Lethal Skeletal Mutant Penetrance by Progeny Testing

Le but du présent protocole est de modifier la pénétrance de lethal phénotypes mutants squelettiques chez le poisson zèbre par reproduction sélective. Mutants létaux ne peuvent pas être cultivés à l’âge adulte et se sont élevés, donc ce protocole décrit une méthode de suivi et en sélectionnant une pénétrance à travers plusieurs générations de tests de descendance.

Décalage de pénétrance de Mutant squelettique létale Zebrafish Progeny test

Zebrafish mutant phenotypes are often incompletely penetrant, only manifesting in some mutants. Interesting phenotypes that inconsistently appear can be ...

The overall goal of this breeding strategy is to manipulate mutant penetrance upward or downward. This selective breeding method enables a more complete understanding of mutant phenotypes. By generating high and low penetrance mutant strains, the entire phenotypic series of a mutation can be understood.Most zebrafish scale where mutants are recessive lethal, so homozygous mutants die before they can be directly bred. Therefore, we employ the classical selective breeding strategy of progeny testing, which we demonstrate here. We first had the item for this method when attempting to time lapse record ectopic bone cell development.Frustratingly, extra bone cells appeared in it frequently, so we set out to alter mutant penetrants by selective breeding. Although we perform this method on a zebrafish scale with a mutant line, it can also be applied to other zebrafish mutant phenotypes and likely, other organisms. After preparing unselected starting zebrafish stock according to the text protocol, carry out KASP genotyping as follows.Place the zebrafish tail tissue in 50 microliters of lysis buffer in the wells of a 96 well plate. Add 10 microliters of 10 milligrams per milliliter proteinase k per well and digest the tissue samples in a thermocycler at 55 degree celsius for two to five hours. Followed by a 20 minute 94 degree celsius inactivation step.Refrigerate the lysis product after digestion. Use a spectrophotometer to quantify the genomic DNA. Then, using molecular biology grade water, dilute the genomic template so that each reaction contains approximately 20 to 30 nanograms.Add 0.14 microliters of the KASP primer mix and five microliters of the KASP master mix per sample on ice, into a 1.5 milliliter microcentrifuge tube and mix well. Then, briefly centrifuge to collect the contents at the bottom of the tube. Pipette five microliters of primer master mix solution into the wells of a 96 well optical PCR plate suitable for the real time PCR machine being used.Then, pipette five microliters of diluted DNA template samples into each well and aspirate with a pipette to mix. Place an optically clear film seal over the plate, ensuring that the film is fully sealed on each well. Briefly centrifuge the plate at 600 x G to collect the contents at the bottom and to remove bubbles from the mix.After performing the main KASP reaction, view the resulting scatter plot produced by the analysis computer. House the identified heterozygous animals together on the main water system. After the animal recover from the fin clip, set up pairwise intercrosses, use dividers to ensure embryos are synchronized.Collect the embryos, and keep the parental pairs isolated in breeding cages. Monitor isolated adults, so that aggressive fish can be separated or provided with cover. To rear the embryos on day five or six, when the swim bladders is inflated in 75%of a clutch, use a glass pipette to collect phenotypically wild type animals.Place phenotypic wild types in the nursery, recording which parents yielded them. After anesthetizing larvae that do not inflate their swim bladders according to the text protocol, use a wide bore glass pasteur pipette to collect the animals into 1.5 milliliters microcentrifuge tubes. Remove the embryo water from each tube and replace it with one milliliter of 2%paraformaldehyde in 1x PBS.Rock the tubes for one hour to fix the animals. Track the tubes regularly during this and all subsequent rocking steps to ensure no larvae have become stuck to the side or clumped in the bottom of the tube. Use a glass pipette to remove the fixative from the tubes.Then add one milliliter of 50%ethanol. Rock the samples for an additional 10 minutes. Prepare fresh staining solution by adding 20 microliters of 0.5%alizarin red per one milliliter of Alcian premix.Remove the 50%ethanol, and add one milliliter of staining solution to each tube. Then, rock the tubes overnight. Within a few days after bleaching the embryos according to the text protocol, score stained mutant offspring for penetrants.In this example, we score for any occurrence of a topic bone. For the next generation, choose two high penetrants and two low penetrants families. Give each parental pair a sub stock identifier, for example, family 4.01, 02, et cetera.It's also helpful to indicate the or inbred generation number on all labels. House parental pairs on the main system with several mixed sex companion fish. Companion fish can be any zebrafish line with permanent obvious distinguishing features, such as altered pigmentation or fin structure.Label the tanks containing the wild type sibling larvae from selected families with the penetrants from the mutant siblings and raise the fish to adulthood as normal. Selective breeding by progeny testing, should yield a shift in overall penetrants both downward and upward in a few generations. In these examples, apply to the mef2ca b1086 mutant, high or low penetrants of a topic bone between the opercal and the branchiostegal ray in lethal homozygous mutants was selected for.In a successful cast procedure, type groupings of samples corresponding to gene type should be recognized by the computer program and the NTCs should be located near the origin of the plot after sufficient cycles have been performed. As demonstrated here, successful Alcian blue, alizarin red stain will have vibrantly stained bone and cartilage elements that are not transparent or faint. The boundaries of the cartilage elements should appear crisp and individual contracytes will be discernible.Alcian blue that is too concentrated were not clear from other tissues making analysis impossible. Implementing this technique from zebrafish line maintenance will likely alter penetrants in a few generations. Following this procedure, other methods like NC2 hybridization and timelapse imaging studies may yield more consistent results.We use this technique to explore the heritability of phenotype variation. After watching this video, you should have a good understanding of how to selectively breed your mutant strains to alter penetrance, even if the mutation is lethal.

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