Name: evaluation of injury-induced senescence and in vivo reprogramming in the skeletal muscle
Uploaded: 2017-10-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle at JoVE.com

Vi står i skuld till Clemire Cimper för hennes utmärkt teknisk support. Arbete i laboratoriet för H.L. finansierades av Institut Pasteur, Centre National pour la Recherche vetenskapliga, och den Agence Nationale de la Recherche (Laboratoire d'Excellence Revive, Investissement pris; ANR-10-labx-73), den Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE13-0017-01) och Fondation ARC (PJA 20161205028). C.C. och A.C. finansieras av Ph.D. och postdoktorala stipendier från återuppliva konsortiet.

djur har hanterats enligt Europeiska gemenskapens riktlinjer och etikkommittén Institut Pasteur (CETEA) godkända protokoll.
 1. förberedelserna av de lösningar som lager <ol><li>förbereda material för muskel provet fixering. Lös 0,5 g tragacanth tuggummi med 20 mL vatten på RT att göra frysning-inbäddning medium för muskel fixering.</li>
	<li>Förbereda lösningarna för SA-β-Gal färgning.
	<ol><li>Förbereda stamlösningar av K 3 Fe(CN) 6...

<ol>
	<li>Munoz-Espin, D., Serrano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence:+from+physiology+to+pathology.">Cellular senescence: from physiology to pathology.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (7), 482-496 (2014).</li><li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+occurring+p16(Ink4a)-positive+cells+shorten+healthy+lifespan.">Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan.</a> Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).</li><li>Hayflick, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Limited+in+Vitro+Lifetime+of+Human+Diploid+Cell+Strains.">The Limited in Vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains.</a> Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).</li><li>Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+senescence-associated+secretory+phenotype:+the+dark+side+of+tumor+suppression.">The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression.</a> Annu Rev Pathol. 5, 99-118 (2010).</li><li>Yun, M. H., Davaapil, H., Brockes, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+turnover+of+senescent+cells+during+regeneration+of+a+complex+structure.">Recurrent turnover of senescent cells during regeneration of a complex structure.</a> Elife. 4, (2015).</li><li>Demaria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+role+for+senescent+cells+in+optimal+wound+healing+through+secretion+of+PDGF-AA.">An essential role for senescent cells in optimal wound healing through secretion of PDGF-AA.</a> Dev Cell. 31 (6), 722-733 (2014).</li><li>Mosteiro, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+damage+and+senescence+provide+critical+signals+for+cellular+reprogramming+in+vivo.">Tissue damage and senescence provide critical signals for cellular reprogramming in vivo.</a> Science. 354 (6315), (2016).</li><li>Chiche, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injury-Induced+Senescence+Enables+In+Vivo+Reprogramming+in+Skeletal+Muscle.">Injury-Induced Senescence Enables In Vivo Reprogramming in Skeletal Muscle.</a> Cell Stem Cell. , (2016).</li><li>Ritschka, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+senescence-associated+secretory+phenotype+induces+cellular+plasticity+and+tissue+regeneration.">The senescence-associated secretory phenotype induces cellular plasticity and tissue regeneration.</a> Genes Dev. 31 (2), 172-183 (2017).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+transcription+factor-mediated+reprogramming+to+pluripotency.">A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 183-193 (2016).</li><li>Abad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+in+vivo+produces+teratomas+and+iPS+cells+with+totipotency+features.">Reprogramming in vivo produces teratomas and iPS cells with totipotency features.</a> Nature. 502 (7471), 340-345 (2013).</li><li>Ohnishi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premature+Termination+of+Reprogramming+In+Vivo+Leads+to+Cancer+Development+through+Altered+Epigenetic+Regulation.">Premature Termination of Reprogramming In Vivo Leads to Cancer Development through Altered Epigenetic Regulation.</a> Cell. 156 (4), 663-677 (2014).</li><li>Guardiola, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Acute+Skeletal+Muscle+Regeneration+by+Cardiotoxin+Injection.">Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection.</a> J Vis Exp. (119), (2017).</li><li>Le Roux, I., Konge, J., Le Cam, L., Flamant, P., Tajbakhsh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numb+is+required+to+prevent+p53-dependent+senescence+following+skeletal+muscle+injury.">Numb is required to prevent p53-dependent senescence following skeletal muscle injury.</a> Nat Commun. 6, 8528 (2015).</li><li>Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+to+detect+senescence-associated+beta-galactosidase+(SA-betagal)+activity,+a+biomarker+of+senescent+cells+in+culture+and+in+vivo.">Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo.</a> Nat Protoc. 4 (12), 1798-1806 (2009).</li><li>Dimri, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biomarker+that+identifies+senescent+human+cells+in+culture+and+in+aging+skin+in+vivo.">A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (20), 9363-9367 (1995).</li><li>Lee, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+beta-galactosidase+is+lysosomal+beta-galactosidase.">Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase.</a> Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).</li><li>Krishna, D. R., Sperker, B., Fritz, P., Klotz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+pH+6+beta-galactosidase+activity+indicate+cell+senescence?.">Does pH 6 beta-galactosidase activity indicate cell senescence?.</a> Mech Ageing Dev. 109 (2), 113-123 (1999).</li><li>Cristofalo, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SA+beta+Gal+staining:+biomarker+or+delusion.">SA beta Gal staining: biomarker or delusion.</a> Exp Gerontol. 40 (10), 836-838 (2005).</li></ol>

Här presenterar vi en metod för att upptäcka både senescent och pluripotenta stamceller i skelettmuskulaturen kan programmeras om möss. Denna metod kan användas för att utvärdera och kvantifiera båda åldras och framkalla cellulär plasticitet i vivooch undersöka rollen som åldras i vävnad reparation och förnyelse.
I det nuvarande protokollet används åldras-associerade β-galaktosidas (SA-β-Gal) analysen för att upptäcka i vivo senescent celler i skelettmusk...

Cellulärt åldrande är en form av stressreaktion som kännetecknas av en stabil cellcykelarrest. Under det senaste decenniet, har forskning etablerat att åldras är associerade med olika biologiska och patologiska processer inklusive embryonal utveckling, fibros och organismen åldrande1,2. Cellulära åldras först identifierades i mänskliga fibroblaster i slutet av sin replikationsförmåga livslängd som utlöses av telomerförkortning3. Förutom replikationsförmåga stress finns det många andra stimuli som kan inducera åldras, inklusive DNA skador, oxidativ stress, onkogena signaler och genomisk/epigenetisk förändringar, något som så småningom kan aktivera p53/p21 eller pRB vägar till upprätta och förstärka den permanent tillväxt gripande1. En av de viktiga egenskaperna hos senescent celler är att de förblir metaboliskt aktiva och kraftfullt uttrycka en åldras-associerade sekretoriska fenotyp (SASP): utsöndring av många inflammatoriska cytokiner, tillväxtfaktorer och extracellulär matrix faktorer4. SASP faktorer har föreslagits att spela en viktig roll i medla och förstärka åldras effekt, på grund av sin potenta effekter på att locka immunceller och förändra lokala och systemiska vävnad FOI1. Intressant, har åldras nyligen föreslagits vara viktigt för vävnad reparation och förnyelse5,6. Data från flera labs, däribland vår, har dessutom föreslagit att vävnad skada-inducerad åldras kan förbättra cellulär plasticitet, via SASPs, att främja regenerering7–9. Därför belysa alla framväxande data vikten av att studera åldras i vivo.
I inlägget inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) eran är cellulär plasticitet en cell förmåga att skaffa sig en ny identitet och att anta en alternativ öde när de utsätts för olika stimuli både i kultur och i vivo10. Det är känt att full omprogrammering kan uppnås i vivo11,12, där uttrycket av den kassett som innehåller fyra Yamanaka faktorer: Oct4, Sox2, Klf4och c-Myc (OSKM) kan vara inducerade i vivo att främja Teratom formation i flera organ. Därför kan kan programmeras om musen modell (i4F) användas som ett kraftfullt system för att identifiera kritiska regulatorer och vägar som är viktiga för cellulär plasticitet11.
En lämplig och känslig i vivo -system är viktigt att förstå hur cellulära åldras reglerar cellulär plasticitet i samband med vävnadsregeneration. Här presenterar vi ett robust system och ett detaljerat protokoll att utvärdera sambandet mellan åldras och cellulär plasticitet i samband med vävnadsregeneration. Den kombination av cardiotoxin (CTX) inducerad muskelskada i gruppen muskeln Tibialis Anterior (TA), ett väl etablerat system att studera vävnadsregenerering och i4F musmodell, tillåter upptäckt av både cellulära åldras och i vivo omprogrammering under muskel regenerering.
För att utvärdera sambandet mellan cellulär plasticitet och åldras, är i4F möss skadade med CTX inducera akuta muskelskador och behandlas med doxycyklin (0,2 mg/mL) under 7 dagar att framkalla i vivo omprogrammering. Medan en CTX inducerad akut muskelskada och regenerering protokoll har varit nyligen publicerad13, av etiska skäl, kommer detta förfarande utelämnas i det nuvarande protokollet. TA muskel prover samlas på 10 dagar post skada13, när toppen av senescent celler har observerats tidigare14. Här, beskriver denna detaljerade protokollet alla steg krävs för att utvärdera den nivå av åldras (via SA-β-Gal) och omprogrammering (via IHC färgning av Nanog).
Åldras-associerade beta-galaktosidas (SA-β-Gal) analysen är den vanligaste analysen att upptäcka senescent celler både i kulturen och i vivo15. Jämfört med andra analyser, möjliggör SA-β-Gal analysen identifiering av de senescent cellerna i deras infödda miljö med intakt vävnad arkitektur, vilket är särskilt viktigt för i vivo studie. Dessutom är det möjligt att par SA-β-Gal analysen med andra markörer med IHC. Dock kräver SA-β-Gal analysen färsk eller fryst prover, som fortfarande är en stor begränsning. När färska eller frysta vävnader finns rutinmässigt, såsom frysta TA muskel prover, är SA-β-Gal uppenbarligen den mest lämpliga analysen att upptäcka senescent celler. Nanog är markören används för att upptäcka reprogramed celler av två skäl: 1) det är en viktig markör för pluripotens; 2) viktigare, dess uttryck drivs inte av doxycyklin (dox), därför den upptäcker inducerade pluripotenta i stället för uttrycket påtvingad av Yamanaka kassetten.
Det är viktigt att Observera att de olika färgprotokollen presenteras i denna studie kan ske separat för att förenkla förfarandet för kvantifiering, men kan också göras i en samtidig färgningsproceduren att visualisera både senescent och pluripotenta stamceller på samma avsnitt.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>K3Fe(CN)6</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>13746-66-2</td>
			<td>For SA-&#946; Gal staining solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K4Fe(CN)6</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14459-95-1</td>
			<td>For SA-&#946; Gal staining solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7786-30-3</td>
			<td>For SA-&#946; Gal staining solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Gal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4252</td>
			<td>For SA-&#946; Gal staining solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D3447</td>
			<td>For inducing in vivo reprogramming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiotoxin</td>
			<td>Lotaxan Valence, France</td>
			<td>L8102</td>
			<td>For muscle injury</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>111-30-8</td>
			<td>For Fixation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron microscopy science</td>
			<td>50-980-487</td>
			<td>For Fixation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCitrate : Sodium Citrate monobasic bioxtra, anhydre</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>18996-35-5</td>
			<td>For permeabilization solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93443</td>
			<td>For permeabilization solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3608</td>
			<td>Washing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti- Nanog</td>
			<td>Cell signalling</td>
			<td>8822S</td>
			<td>Rabbit monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision+ Kits (HRP. Rabbit. DAB+)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>K4010</td>
			<td>For Nanog revelation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin 1%</td>
			<td>Leica</td>
			<td>380159EOF</td>
			<td>Counterstainning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast red</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-3403</td>
			<td>Counterstainning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Shandon Immu-Mount</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>9990402</td>
			<td>Mounting solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-hardening mounting medium for microscopy : Eukitt&#174;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>25608-33-7</td>
			<td>Mounting solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Phase Contrast Brightfield CKX41: 10X-20X-40X objectives</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX41</td>
			<td>Microscope for Nanog quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: i4F-A</td>
			<td>Abad et al., 2013</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Reprogrammable mouse model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skeletal muscle, Tibialis Anterior</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Scanner</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Scan Z1</td>
			<td>slides scanning</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of injury-induced senescence and in vivo reprogramming in the skeletal muscle

Cellulärt åldrande är en stressreaktion som kännetecknas av en stabil cellulära tillväxt gripandet, vilket är viktigt för många fysiologiska och patologiska processer, såsom cancer och åldrande. Nyligen, åldras har också varit inblandad i vävnad reparation och förnyelse. Därför har det blivit alltmer kritisk till identifiera senescent celler i vivo. Åldras-associerade β-galaktosidas (SA-β-Gal) analysen är den vanligaste analysen att upptäcka senescent celler både kultur och i vivo. Denna analys bygger på ökad lysosomala innehållet i senescent cellerna, vilket gör histochemical detektion av lysosomala β-galaktosidas aktivitet vid suboptimum pH (6 eller 5.5). I jämförelse med andra analyser, såsom flödescytometri, Detta tillåter identifiering av senescent celler i deras inhemska miljö, som ger värdefull information såsom platsen avser vävnad arkitekturen, morfologi, och den möjlighet till koppling med andra markörer via immunhistokemi (IHC). Den största begränsningen av SA-β-Gal analysen är kravet på färska eller frysta prover.
Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för att förstå hur cellulära åldras främjar cellulär plasticitet och vävnad förnyelse i vivo. Vi använder SA-β-Gal för att upptäcka senescent celler i skelettmuskulaturen vid skada, som är ett väl etablerat system att studera vävnadsregeneration. Dessutom använder vi IHC för att upptäcka Nanog, en markör av pluripotenta stamceller, i en transgen musmodell. Detta protokoll gör det möjligt för oss att undersöka och kvantifiera cellulära åldras i samband med inducerad cellulär plasticitet och i vivo omprogrammering.

Att upptäcka muskel skada-inducerad cellulära åldras
Det har nyligen visats att muskelskada inducerar övergående cellulära åldras14. På 10 dagar efter skada (DPI), majoriteten av den skadada myofibers genomgår regenerering med centralt belägna kärnor, ett kännetecken för regenererande myofibers, och arkitekturen av muskeln har återupprättats. Infiltrating inflammatoriska celler reduceras drama...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle at JoVE.com

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Utvärdering av nervskade-inducerad åldras och In Vivo omprogrammering i skelettmuskulaturen

Här presenterar vi ett detaljerat protokoll att upptäcka både senescent och pluripotenta stamceller i skelettmuskulaturen vid skada samtidigt förmå i vivo omprogrammering. Denna metod är lämplig för att utvärdera rollen av cellulära åldras under vävnadsregenerering och omprogrammering i vivo.

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

The overall goal of this protocol is to evaluate both in vivo senescence and reprogramming in the skeletal muscle upon tissue injury. This method can help to address critical questions in the regenerative medicine field, such as how to enhance cellular plasticity to promote muscle regeneration. The main advantage of this technique is to provide a reliable method to detect and quantify senescence cells in the resident environment.Cell senescence has been recently implicated in tissue repair and regeneration. Understanding the mechanisms of how senescence contributes to tissue repair and the regeneration will certainly have an impact on regenerative medicine. We first had the idea for this method when we investigated the potential impact of tissue damage on in vivo reprogramming in skeletal muscle.To begin this procedure, fix the slides of muscle samples in 1%paraformaldehyde and 0.2%glutaraldehyde in PBS for four minutes. Then, wash the slides with PBS two times, each time for 10 minutes. Then, wash the slides with PBS, pH 5.5 for 30 minutes.Next, incubate the sections with the X-gal solution in the dark at 37 degrees Celsius for a minimum of 24 hours. Afterward, wash the slides with PBS three times, each time for 10 minutes. Then, post-fix the slides with PBS containing 1%paraformaldehyde for 30 minutes.Finally, wash the slides with PBS three times. Subsequently, counterstain with 0.2%eosin by immersing the slides in the eosin solution for one minute. Then, rinse them with distilled water briefly.Mount the slides with aqueous non-fluorescing mounting medium. Fix the slides with PBS containing 4%paraformaldehyde for 10 minutes. Wash them with PBS twice, each time for 10 minutes.Subsequently, add the permeabilization solution, and incubate for five minutes. Following this, wash the slides with PBS twice, each time for five minutes. In the last wash, add 200 microliters of PBS, containing 0.25%BSA, directly on the slides for five minutes.Incubate the slides with the primary anti-Nanog antibody at 1.25 micrograms per milliliter overnight at 4 degrees Celsius in PBS containing 5%FBS. Wash the slides with PBS twice, each time for 10 minutes. In the last wash, use 200 microliters of PBS containing 0.25%BSA for five minutes.Subsequently, incubate the slides with 100 microliters of RAB-HRP secondary antibody from a ready-to-use kit for 45 minutes. Then, wash the slides with PBS three times, each time for five minutes to remove the secondary antibody. After that, dilute DAB in the substrate buffer, provided by the ready-to-use kit.Vortex vigorously. Add 100 microliters of DAB solution, directly onto each slide, and incubate for a maximum of 10 minutes at room temperature. Next, remove DAB solution by rinsing the slides with water.Counterstain the slides with fast red solution for two minutes. Then, wash the slides with water again, briefly. Following that, dehydrate them with 95%ethanol for five minutes, followed by 100%ethanol twice, each time for five minutes.After that, mount the slides with quick-hardening mounting medium. Observe the slides under the microscope in brightfield at 20x to avoid background. In this procedure, scan the slides and choose the two best quality sections on each slide with the maximum possible distance in-between base on tissue integrity, quality of the staining, and counterstaining.Count the SA-Beta-Gal positive cells in these two sections and calculate the mean value. Then, determine the rank of the pixel size by manually selecting the smallest and the largest positive SA-Beta-Gal cells. In ImageJ Interface, click Analyze, Tools, ROI Manager, Analyze, Set Measurement.Then, select Area. Use the selection tool and surround the smallest and biggest positive SA-Beta-Gal cell, and add it to the ROI Manager by clicking on, Add. After that, measure the sizes, using the Measure button, and save the values for later use.Next, adjust the threshold parameter to ensure all the visible positive cells are selected. Convert the image to grayscale by clicking, Image, Type, then 8-bit. Afterward, go to Image, Adjust, and Threshold.Move the second cursor until all the positive SA-Beta-Gal cells are covered in red, then click, Apply. Analyze the particles by clicking, Analyze, Analyze Particles, followed by Size and apply the value defined earlier. Enter Circularity, 0.00-1.00, and click OK.A summary of all the counted particles will be shown in the ROI Manager.Now, transfer all the selected particles to the original image. Adjust the selection manually to ensure accurate quantification. Add positive cells or remove false positive cells.Finally, measure the area by outlining the section using the selection tool. Click ROI Manager, Add, then Measure. Under the microscope, count the Nanog positive cells in the brightfield manually at 20x magnification.Shown here is a schematic representation to evaluate in vivo reprogramming and senescence level after muscle injury. Here are the representative pictures of SA-Beta-Gal and Nanog staining on the frozen sections of damaged skeletal muscle. These images show SA-Beta-Gal staining, counterstained with eosin, and the staining of Nanog, counterstained with fast red.The non-injured muscles are shown on the top, whereas the injured muscles are shown at the bottom. This graph shows the quantification and correlation of SA-Beta-Gal positive and Nanog positive cells in consecutive sections at 10 days post-injury. While attempting this procedure, it's important to remember to always include a negative control to ensure the specificity of the staining.Following this procedure, all the methods, like immunofluorescence, choosing different marker of senescence, all cell types can be performed in order to answer additional questions, like the cellular identity of the senescent cells. After each development, this technique paved the way for researchers in the field of senescence, or tissue repair and regeneration, to explore how cellular senescence can promote cellular plasticity to facilitate tissue repair and regeneration in mammals. So after watching this video, you should have a good understanding of how to identify both senescent and reprogrammed cells in vivo.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analys av Zebrafish Larver skelettmuskulatur Integrity med Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Använda Isolerad Mitokondrier från minimala kvantiteter av mus skelettmuskulatur för hög genomströmning Mikroandnings Mätningar

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Induktion av akut Skeletal Muscle Regeneration av Cardiotoxin Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissektion och Immunofluorescerande färgning av svamp kropp och ljusmätare nervceller i vuxen Drosophila melanogaster hjärnor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Tillämpningen av kronisk stimulering att studera kontraktila aktivitet-inducerad råtta skelettmuskulaturen fenotypiska anpassningar

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Identifiering av skelettmuskulaturen satellit celler genom immunofluorescens med Pax7 och Laminin antikroppar

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Avbildning av muskel-senan morfogenes i Drosophila puppor

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

Induktion och validering av cellulära åldras i primära mänskliga celler

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

A Quantitative Measurement of Reactive Oxygen Species and Senescence-associated Secretory Phenotype in Normal Human Fibroblasts During Oncogene-induced Senescence

En kvantitativ mätning av reaktiva syreradikaler och åldras-associerade sekretoriska fenotyp i normala mänskliga fibroblaster under onkogen-inducerad åldras

Cellular senescence has been considered a state of irreversible growth arrest upon exhaustion of proliferative capacity or exposure to various stresses. ...