Name: afm and microrheology in the zebrafish embryo yolk cell
Uploaded: 2017-11-29T12:30:00
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Agradecemos a Amayra Hernández-Vega y Philippe Alexandre Pouille por participar en la creación de la base de estos protocolos. También agradecemos a la plataforma de proyección de imagen Molecular IBMB-PCB, Xavier Esteban y los miembros del laboratorio de apoyo continuo. El programa de grupos consolidados de la Generalitat de Catalunya y DGI y becas Consolider del Ministerio de economía y competitividad de España OE y DN apoya esta labor.

Todos los pasos del Protocolo se describen a continuación siguen las pautas de cuidado de los animales de nuestras instituciones.
1. pez cebra cultura
<ol><li>Criar y mantener el pez cebra adulto en condiciones normales. Nota: AB y TL tipo salvaje embriones se utilizaron para este estudio.</li>
	<li>Recoger embriones y cultivarlas a 28,5 ° C en el E3 embrión media24. Etapa según la morfología descrita19.</li>
</ol>...

<ol>
	<li>Hernandez-Vega, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+cortical+tension+drives+zebrafish+epiboly+movements.">Polarized cortical tension drives zebrafish epiboly movements.</a> EMBO J. 36, 25-41 (2017).</li><li>Brodland, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video+force+microscopy+reveals+the+mechanics+of+ventral+furrow+invagination+in+Drosophila.">Video force microscopy reveals the mechanics of ventral furrow invagination in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 22111-22116 (2010).</li><li>Grill, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+up+is+stressful:+biophysical+laws+of+morphogenesis.">Growing up is stressful: biophysical laws of morphogenesis.</a> Curr Opin Genet Dev. 21, 647-652 (2011).</li><li>Krieg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensile+forces+govern+germ-layer+organization+in+zebrafish.">Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish.</a> Nat Cell Biol. 10, 429-436 (2008).</li><li>Koser, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensing+is+critical+for+axon+growth+in+the+developing+brain.">Mechanosensing is critical for axon growth in the developing brain.</a> Nat Neurosci. 19, 1592-1598 (2016).</li><li>Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle-tracking+microrheology+of+living+cells:+principles+and+applications.">Particle-tracking microrheology of living cells: principles and applications.</a> Annu Rev Biophys. 38, 301-326 (2009).</li><li>de Pablo, P. J., Carri&#243;n-V&#225;zquez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Biological+Samples+with+Atomic+Force+Microscopy.">Imaging Biological Samples with Atomic Force Microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014, 167-177 (2014).</li><li>Roca-Cusachs, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheology+of+passive+and+adhesion-activated+neutrophils+probed+by+atomic+force+microscopy.">Rheology of passive and adhesion-activated neutrophils probed by atomic force microscopy.</a> Biophys J. 91, 3508-3518 (2006).</li><li>Evans, E., Yeung, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apparent+viscosity+and+cortical+tension+of+blood+granulocytes+determined+by+micropipet+aspiration.">Apparent viscosity and cortical tension of blood granulocytes determined by micropipet aspiration.</a> Biophys J. 56, 151-160 (1989).</li><li>Fabry, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+scale+and+other+invariants+of+integrative+mechanical+behavior+in+living+cells.">Time scale and other invariants of integrative mechanical behavior in living cells.</a> Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 68, 041914 (2003).</li><li>Kashef, J., Franz, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+methods+for+analyzing+cell-cell+adhesion+in+development.">Quantitative methods for analyzing cell-cell adhesion in development.</a> Dev Biol. 401, 165-174 (2015).</li><li>Chevalier, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+micromechanical+properties+of+embryonic+tissues.">Measuring the micromechanical properties of embryonic tissues.</a> Methods. 94, 120-128 (2016).</li><li>Reichlin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+native+coronary+artery+endothelium+in+situ+and+in+cell+culture+by+scanning+force+microscopy.">Investigating native coronary artery endothelium in situ and in cell culture by scanning force microscopy.</a> J Struct Biol. 152, 52-63 (2005).</li><li>Rho, J. Y., Tsui, T. Y., Pharr, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+properties+of+osteon+and+trabecular+bone+measured+by+nanoindentation.">Elastic properties of osteon and trabecular bone measured by nanoindentation.</a> J Biomech. 31, 21 (1998).</li><li>Grant, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+characterisation+and+biomechanical+analysis+of+the+sclera+by+atomic+force+microscopy.">Surface characterisation and biomechanical analysis of the sclera by atomic force microscopy.</a> J Mech Behav Biomed Mat. 4, 535-540 (2011).</li><li>Efremov, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+of+living+and+fixed+Xenopus+laevis+embryos.">Atomic force microscopy of living and fixed Xenopus laevis embryos.</a> Micron. 42, 840-852 (2011).</li><li>Henkels, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+Mechanical+Variation+Reveals+Critical+Role+for+Rho+Kinase+During+Primitive+Streak+Morphogenesis.">Spatiotemporal Mechanical Variation Reveals Critical Role for Rho Kinase During Primitive Streak Morphogenesis.</a> Ann Biomed Eng. 41, 421-432 (2013).</li><li>Solnica-Krezel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrulation+in+zebrafish+--+all+just+about+adhesion?.">Gastrulation in zebrafish -- all just about adhesion?.</a> Curr Opin Genet Dev. 16, 433-441 (2006).</li><li>Kimmel, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Rohde, L. A., Heisenberg, C. 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L., Bechhoefer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calibration+of+atomic-force+microscope+tips.">Calibration of atomic-force microscope tips.</a> Review of Scientific Instruments. 64, 1868-1873 (1993).</li><li>Lomakina, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheological+analysis+and+measurement+of+neutrophil+indentation.">Rheological analysis and measurement of neutrophil indentation.</a> Biophys J. 87, 4246-4258 (2004).</li><li>Alcaraz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+Microrheological+Measurements+of+Soft+Samples+with+Atomic+Force+Microscopy+for+the+Hydrodynamic+Drag+on+the+Cantilever.">Correction of Microrheological Measurements of Soft Samples with Atomic Force Microscopy for the Hydrodynamic Drag on the Cantilever.</a> Langmuir. 18, 716-721 (2002).</li><li>Daniels, B. R., Masi, B. C., Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+single-cell+micromechanics+in+vivo:+the+microrheology+of+C.+elegans+developing+embryos.">Probing single-cell micromechanics in vivo: the microrheology of C. elegans developing embryos.</a> Biophys J. 90, 4712-4719 (2006).</li><li>Kalwarczyk, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+viscosity+of+complex+liquids+and+cytoplasm+of+mammalian+cells+at+the+nanoscale.">Comparative analysis of viscosity of complex liquids and cytoplasm of mammalian cells at the nanoscale.</a> Nano Lett. 11, 2157-2163 (2011).</li><li>Soroldoni, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+oscillations.+A+Doppler+effect+in+embryonic+pattern+formation.">Genetic oscillations. A Doppler effect in embryonic pattern formation.</a> Science. 345, 222-225 (2014).</li><li>He, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+constriction+drives+tissue-scale+hydrodynamic+flow+to+mediate+cell+elongation.">Apical constriction drives tissue-scale hydrodynamic flow to mediate cell elongation.</a> Nature. 508, 392-396 (2014).</li><li>Johansen, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+micromanipulation+of+nanoparticles+and+cells+inside+living+zebrafish.">Optical micromanipulation of nanoparticles and cells inside living zebrafish.</a> Nat Commun. 7, 10974 (2016).</li></ol>

Aquí nos muestran que las propiedades del material y algunos parámetros biomecánicos de la célula de yema de huevo de pez cebra durante epiboly pueden ser fácilmente estimadas por AFM y nanopartículas de microrheology.
Mientras que AFM se ha empleado para recuperar características reológicas de las células y tejidos en condiciones fisiológicas4,5,25,28, aqu...

Los principios físicos subyacentes el control biomecánico de procesos morfogenéticos son en gran parte indefinidos. Mientras que estudios biomecánicos en el nivel molecular y celular están cobrando impulso considerable, la exploración de los parámetros biomecánicos en el nivel de tejido/organismo está en su infancia. Hidrodinámica de la regresión1 o Video microscopia de la fuerza2 permiten a los investigadores distinguir fuerzas activas y pasivas, mientras que el láser microcirugía3, o el menos intrusiva microscopía de fuerza atómica (AFM) de células disociadas4 o en vivo 5 o nanopartículas microrheology6 permite la anticipación de respuestas y propiedades mecánicas de los tejidos.
AFM es una técnica topográfica tridimensional de alta resolución atómica resolución de rugosidad de la superficie y el cumplimiento de la desviación de consejos de voladizo al entrar en contacto con una superficie sondeado7. Se han desarrollado diferentes metodologías con AFM para investigar propiedades de superficie, incluyendo medición de fricción, fuerzas de adhesión y propiedades viscoelásticas de materiales diversos. Recientemente, AFM ha emergido como una potente herramienta para recuperar información sobre las propiedades mecánicas de muestras biológicas. En particular, AFM puede extraer forma no invasiva el módulo de corte complejo de las células aplicando sangrías oscilatorias con una punta micro conectada a un voladizo de la constante flexión conocido8. Esto nos permite inferir las fuerzas resultantes. Sin embargo, AFM no es único y diferentes metodologías permiten extraer datos de reología y propiedades mecánicas de las células individuales (p. ej., micropipeta aspiración9, magnético de torsión citometría (MTC)10o uniaxial extensible prueba11).
Sin embargo, la aplicación de estas metodologías novedosas en complejos procesos morfogenéticos no es sencilla. Los principales desafíos que enfrentan al determinar las propiedades mecánicas de los tejidos embrionarios son los pequeños (μm a mm), suave (en el 102 - 104 gama de Pa) y la naturaleza visco-elástica (dando lugar a fenómenos dependientes del tiempo) de los materiales12. Por lo tanto, es importante adaptar los métodos empleados para la determinación de propiedades mecánicas (rigidez, viscosidad, adherencia) para el caso concreto de los embriones y organismos en desarrollo. Dos cuestiones importantes deben tenerse en cuenta al analizar los métodos reológicos para el estudio de desarrollo: para evitar interferencia intrusa y proporcionar accesibilidad. En este escenario, aspiración de la micropipeta, MTC y ensayos de tracción presentan limitaciones. En el primer caso, la alta deformación que sufre una célula podría alterar sus propiedades fisiológicas y mecánicas9. En el segundo caso, la necesidad de adherirse firmemente el tejido experimental a un sustrato para que las tensiones aplicadas deforman el citoesqueleto localmente también puede introducir efectos en el estado de activación de las células y, por lo tanto, en sus características mecánicas10 . Últimos enfoques extensibles uniaxiales están limitados por la geometría de desarrollar organismos y accesibilidad11.
AFM parece ser más adecuado para el estudio de procesos de desarrollo ya que permite el estudio de muestras biológicas directamente en su ambiente natural sin ninguna preparación engorrosa. Por otra parte, como la disociación de los tejidos embrionarios es generalmente difícil, el reducido tamaño de sondas de AFM proporciona un alto grado de versatilidad sin limitación en la elección del tipo de medio (acuoso o no acuoso), temperatura de la muestra o producto químico composición de la muestra. AFM es suficientemente versátil para ser aplicada a grandes dominios y escalas de tiempo y se ha empleado para recuperar propiedades de los materiales de los tejidos en distintas etapas de desarrollo o en condiciones fisiológicas. Conjunto nativos tejidos como las arterias13 o huesos14 han sido estudiados desde un punto de vista topográfico y en algunos casos, como la esclerótica, propiedades mecánicas han sido obtenido15. Topografía se ha explorado también en embriones vivos permitiendo la visualización de, por ejemplo, cambio de celular durante la morfogénesis en Xenopus16. Protocolos de preparación de muestra última y completa se han desarrollado para determinar parámetros mecánicos durante diferentes procesos de desarrollo. Se han generado mapas de nanoindentación en secciones de tejido interpretaciones nativas para la chica tubo digestivo embrionario11; propiedades adhesivas y mecánicas obtenido por ectodermo, mesodermo y endodermo progenitoras células individuales aisladas de embriones de pez cebra gastrulating4; mediciones de rigidez para el epiblasto y la línea primitiva en explantes de embriones aviar17; y un patrón distinto de gradientes de rigidez definida directamente en el cerebro embrionario de Xenopus5.
Un salto cualitativo importante para la aplicación de AFM para explorar desarrollo embrionario puede provenir de acercarse a procesos morfogenéticos acceso sencillos. Pez cebra epiboly es un evento esencial y conservado, en el que diferentes tejidos coordinarán en un espacio esférico restringido para dirigir la expansión del blastoderm en pocas horas. En el inicio de pez cebra epiboly (etapa esférica), una capa superficial de células, la capa envolvente (EVL), cubre una tapa semiesférica de blastómeros centrado en el polo animal del embrión sentado en una célula sincicial yema masiva. Epiboly consiste en la expansión de la cortical ward vegetal de la Vet, las células profundas (DCs) del blastoderm y la capa externa de la célula sincicial yema (E YSL) alrededor de la yema. Epiboly termina con el cierre de la Vet y los controladores de dominio en el polo vegetal18,19,20. Cómo y donde las fuerzas se generan durante el epiboly y cómo se juntan a nivel mundial todavía no está claro de1,21.
Aquí describimos en detalle cómo aplicar AFM para inferir propiedades mecánicas pasivas del tejido durante la progresión del epiboly en la yema de huevo de pez cebra de la célula en vivo. Para ello, empleamos pequeñas microesferas atadas AFM voladizos como sondas. Esto permite la recuperación de información local precisa dentro de la superficie de la célula de yema no uniforme y gradientes tensionales y su dinámica en el tiempo. AFM alternativo enfoques tales como utilizando ménsulas de cuña22, serán datos locales no render que es bastante precisos. La técnica de cuña, que requiere habilidades de manipulación muy cuidadosa para pegar una cuña más grande que el tamaño de la muestra en el extremo del voladizo, no está bien adaptada para sondear el embrión (~ 2 más grande que la longitud del voladizo) mecánica.
Modelado y caracterización de las propiedades viscoelásticas de las células de manera cualitativa y cuantitativa permiten una mejor comprensión de su biomecánica. Desde un punto de vista biomecánico, es esencial entender epiboly y no sólo demanda conocimiento de las medidas corticales de tensión y dinámica, que puede ser extraído por AFM; por lo tanto hay necesidad de información sobre las propiedades biofísicas del tejido. Para extraer esta información, se han desarrollado una variedad de técnicas de reología celular durante los años para caracterizar diversos tipos celulares bajo diferentes condiciones fisiológicas23. Incluyen AFM, MTC y pinzas ópticas (OT). Estos métodos, sin embargo, se ha demostrado insuficientes para análisis mesoscópica en la escala de embriones o de los órganos. Como alternativa, nos hemos adaptado con éxito seguimiento de nanopartículas microrheology6 para en vivo las medidas reológicas. Esta técnica analiza los desplazamientos browniano de las partículas individuales y deduce propiedades locales micromechanical.
Junto microrheology AFM y nanopartículas permiten la definición de cortical tensional dinámica y propiedades mecánicas internas de la yema durante epiboly. Esta información apoya plenamente un modelo en el que tensión anisotrópica se desarrolla como consecuencia de las diferencias en la respuesta de deformación de la Vet y la capa citoplasmática de yema de huevo (YCL) a la contracción isotrópica actomyosin de la corteza E YSL es esencial para el movimiento neto direccional del EVL y epiboly progresión1.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Inverted optical microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE2000</td>
			<td>Visualization of the sample and AFM cantilever</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic force microscope (AFM)</td>
			<td>Custom made</td>
			<td>-</td>
			<td>Any commercialized AFM could be employed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM780</td>
			<td>Nanorheology data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose D1 Low EEO</td>
			<td>Conda</td>
			<td>8016.00</td>
			<td>Casting embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure LMP Agarose (low melting)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-100</td>
			<td>Securing embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish Microinjection and Transplantation Molds</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>Z-MOLDS</td>
			<td>Casting embryos. Custom made with the original dimensions can also be employed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont 5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-20</td>
			<td>1.5 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Si3N4 cantilever</td>
			<td>Novascan</td>
			<td>PT.GS</td>
			<td>Measuring the embryo by AFM. Spherical tip: 4.5 &#181;m diameter and k=0.01 N/m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent nanoparticles</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>FluoSpheres F8811,</td>
			<td>For tracking nanorheology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-2000</td>
			<td>Fabricating tailored microneedles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate capillary glass</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>G100TF-4</td>
			<td>Fabricating tailored microneedles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MN-153</td>
			<td>Manipulating the micropipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>FemtoJet Express</td>
			<td>Controlling injection time and pressure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC365FX</td>
			<td>Visualization of the embryos during injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis Software</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>Matlab</td>
			<td>Analyzing AFM and particle tracking data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish</td>
			<td>AB and TL wild type</td>
			<td>-</td>
			<td>Strains employed for embryo collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Plates</td>
			<td>Mat Tek</td>
			<td>P35G-0.170-14-C</td>
			<td>Mounting embryos for nanorheology data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage micrometer</td>
			<td>FST</td>
			<td>29025-02</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

afm and microrheology in the zebrafish embryo yolk cell

Dilucidar los factores que dirigen la organización espacio-temporal de la evolución de los tejidos es uno de los objetivos primordiales en el estudio del desarrollo. Varias proposiciones afirman han sido contribuciones importantes a la comprensión de las propiedades mecánicas de las células y tejidos en su organización espacio-temporal en los diferentes procesos morfogenéticos y de desarrollo. Sin embargo, debido a la falta de herramientas fiables y accesibles para medir las propiedades del material y parámetros tensional en vivo, validación de estas hipótesis ha sido difícil. Aquí presentamos métodos empleando microscopía de fuerza atómica (AFM) y rastreo con el fin de cuantificar las propiedades mecánicas de la célula de yema de embrión de pez cebra intacto durante epiboly de partículas. Epiboly es un proceso conservado principios cuyo estudio es facilitada por la transparencia del embrión. Estos métodos son fáciles de implementar, fiable y ampliamente aplicable ya que superan las intervenciones intrusivas que pueden afectar la mecánica del tejido. Se aplicó una estrategia simple para el montaje de especímenes, grabación de AFM e inyecciones de nanopartículas y seguimiento. Este enfoque hace que estos métodos fácilmente adaptable a otras épocas del desarrollo u organismos.

Mediciones de tensión cortical Para cada punto de medición, cinco curvas de fuerza-desplazamiento (F-z) fueron adquiridas por AFM por rampa del cantilever en 1 Hz con una amplitud pico a pico de 5 μm (velocidad = 10 μm/s) hasta una muesca máxima de ~ 2 μm. Este procedimiento fue tomando menos de 20 minutos y no fue afectado por la progresión de epiboly. Cada condición experimental se probó en embriones de al menos 5.
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AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

AFM y Microrheology en la celda de yema de embrión de pez cebra

La falta de herramientas para medir las propiedades del material y parámetros tensional en vivo impide validar sus papeles durante el desarrollo. Se emplean microscopía de fuerza atómica (AFM) y nanopartículas de seguimiento para cuantificar características mecánicas en la célula de yema de embrión intacto de pez cebra durante epiboly. Estos métodos son fiables y ampliamente aplicables evitando intervenciones intrusivas.

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

The overall goal of these procedures is to adapt specific methodologies for the determination of mechanical properties such as, stiffness, viscosity and adhesion to the specific case of embryos and developing organisms. The methods that we introduce in this paper can answer questions in the mechanobiology field, such as how their properties may respond to genetic or physical input during development or a pinch in the regulation of cellular activities. The many advantages of this technique is that they allow retrieval of crucial information with minimal manipulation, addressing questions that are inoperable by other procedures.These methods provide insight into understanding the role of the yolk cell during a and then they can be applied to different domains in the embryo to different developmental status and even to other model organisms. Visual demonstration of this methods is critical as embryo mounting and handling are difficult to learn. To begin, collect zebra fish embryos and grow them at 28 degrees Celsius in E3 embryo medium.Stage the embryos according to morphology. Manually decurionate stage zebra fish embryos at different ages, according to individual interest under a dissecting stereo microscope with an adjustable range in magnification between eight times and 50 times. Remove the chorions with two thin and sharp forceps.Grip the chorion using one set of forceps and make a tear in it with the other set of forceps, then, holding the chorion in a region opposite of that of the tear, push the embryo gently through the opening. To mount the embryos for AFM, first fill a 35 millimeter petri dish with 2%agarose and embryo medium and let it solidify. Then, make small holes of approximately 1.5 millimeter in diameter and approximately 350 microns depth with thin forceps in the agarose bed.Place the embryos in the pokes make in the agarose layer. Then, pour a solution of 0.5%low melting agarose and embryo medium, just around the embryos to secure them in the holes. Before the low melting point agarose solidifies at room temperature, rotate the embryos in such a way that the region of interest to be probed by AFM will face upwards.Examine the embryos. Locate and image them in the petri dish, employing a 20 times objective in an inverted optical microscope coupled with the atomic force microscope at room temperature. Probing the yolk cell surface at the right angle and at the right amplitude of oscillation and frequency is essential to retrieve those data.Different tests must be performed to optimize this parameters. Probe the yolk cell surface of the casted embryos, employing spherical polystyrene beads to 4.5 micron in diameter, attached to a cantilever with a nominal spring constant of 0.01 Newtons per meter. Set the peak to peak amplitude of cantilever oscillation to five microns and it's frequency to one Hertz.Collect data for each region to be tested in different positions and in several embryos as a routine for data averaging. To perform particle microinjection into the yolk cell fabricate tailored microneedles using a vertical micropipette puller in borosilicate capillary glass. Prepare microneedles that have an outer diameter or 1.00 millimeter, an inner diameter or 0.58 millimeters and a length of 10 centimeters.Prepare an injection petri dish plate by creating straight indentation lines in a 2%agarose and embryo medium bed employing custom made molds. Turn the molds upside down and place them on top of the liquid agarose gel. Remove the molds once the gel has solidified.Then, pipette the embryos into the grooves made by the molds in the agarose, under dissecting stereo microscope at 1.2 times magnification. Before injection, almost completely remove the medium. The surface tension prevents the embryo and chorion from sticking to the needle, when removing it after injection.Injection of the correct amount of piece is critical and will facilitate their dispersion within the yolk, afterwards and also, it's important for the retrieval of them in square displacement. Use florescent nano particles diluted in water for microinjection into the vegetal part of the embryo yolk cell. Adjust the micropipette with precision micromanipulators and use an automatic microinjector with time and pressure controls.Set the pressure between 10 and 20 psi. Employ a magnification of 1.6 times in the dissecting stereo microscope to visualize the embryos during the injections with are performed at room temperature. To assess the viscoelastic behavior of the yolk, first decurionate the microinjected embryos, as before.Then, embed the embryos in a 0.5%low melting point agarose and embryo medium solution at 30 degrees Celsius. While the agarose is still liquid, transfer the embryos to glass bottom plates. Orient and push them towards the cover slip.Place the embryos mounted in the glass bottom pates on the stage of a confocal inverted microscope two hours after microinjection. Capture images of the nano particles for 26 seconds at a sampling rate of 25 Hertz, with a 63 times objective at room temperature in an inverted confocal microscope, employing standard commercial microscope software. Force indentation curves were retrieved from individual AFM measurements at a distance of 10 microns from each other in different embryos.On average, force curves reflect a linear increase in deflection upon contact with the embryo yolk cell surface. And accurate fitting of the data with a liquid balloon model let's to infer cortical tension values, which increased gradually towards the vegetal pole and with time. Further, the observed differences between the approaching and retracting deflection values retrieved at AFM at each point in the force displacement curves, indicates the viscoelastic character of the cortex.This viscoelastic character of the yolk cell cortex can be characterized by multi-frequency oscillations AFM measurements to retrieve it's effective complex modulus in Pascals. The elastic modulus is at least four times higher than the viscous modulus at all tested frequencies. On the other hand, the yolk mechanics was probed with microparticle rhealogy.The mean squared displacement of individual nanoparticles injected in the yolk cell exhibited an approximately linear dependence with time lag. The ensemble average of the MSD's of the nanoparticle's population exhibits predominantly viscous character and diffusive properties. From these data, the viscosity of the yolk was calculated to be 129 millipascal seconds.Once mastered, AFM can be done in a few hours if it's performed properly. Following this procedure, additional questions, like the role of a specific genes or mechanical inputs and tensional parameters or material properties can be studied. After watching this video, you should have a good understanding of how to determine the mechanical properties of the yolk cell of the zebrafish embryo during epiboly When attempting a particle injection rheological data retrieval, it is important to remember to properly stage the embryo and be precise on the quantities of media to be injected as not to perturb embryo development.After this development, this technique will help exploration of the mechanobiology of model organisms in development and possibly on pathological conditions.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Microbead Implantación en el embrión de pez cebra

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Análisis de pez cebra larvas esquelético Integridad del músculo con el colorante azul de Evans

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

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In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos

Endodérmico primario de células epiteliales Cultura de la membrana del saco vitelino de embriones de codorniz japonesa

We established an endodermal epithelial cell culture model (EEC) for studying the function of certain enzymes and proteins in mediating nutrient ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

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Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Identificación de progenitores eritromioideos y su progenie en el embrión de ratón por citometría de flujo

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Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

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Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout (Oncorhynchus Mykiss) and Brown Trout (Salmo Trutta Morpha fario)

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Egg collection is one of the most crucial procedures during fish reproduction in salmonid hatcheries. Classic methods involve the use of hand massage on ...

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