Name: ground state depletion super-resolution imaging in mammalian cells
Uploaded: 2017-11-05T08:30:00
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Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione AHA a r.e.d. (15SDG25560035). Gli autori si desidera ringraziare Dr. Fernando Santana per l'uso del suo microscopio 3D Leica SR GSD e Dr. Johannes Hell per gentilmente fornire l'anticorpo FP1.

1. lavaggio vetrini coprioggetti <ol><li>il giorno prima dell'elaborazione del campione, pulire #1.5 vetrini coprioggetti di sonicating in una soluzione 1 M di KOH per 1 h. Questa operazione rimuove qualsiasi fluorescente contaminanti che possono essere presenti sui coprioggetti.
	<ol><li>Risciacquare accuratamente il KOH da lamelle con acqua deionizzata.</li>
		<li>Una volta puliti in KOH, conservare i coprioggetti in etanolo al 70% fino all'uso.</li>
	</ol></li></ol> 2. Lamell...

<ol>
	<li>Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+microscopy+reveals+that+synaptotagmin+remains+clustered+after+synaptic+vesicle+exocytosis.">STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis.</a> Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).</li><li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+structured-illumination+microscopy:+wide-field+fluorescence+imaging+with+theoretically+unlimited+resolution.">Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13081-13086 (2005).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Hell, S. W., Kroug, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ground-state-depletion+fluorscence+microscopy:+A+concept+for+breaking+the+diffraction+resolution+limit.">Ground-state-depletion fluorscence microscopy: A concept for breaking the diffraction resolution limit.</a> JAppl Phys B. 60 (5), 495-497 (1995).</li><li>Bretschneider, S., Eggeling, C., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+diffraction+barrier+in+fluorescence+microscopy+by+optical+shelving.">Breaking the diffraction barrier in fluorescence microscopy by optical shelving.</a> Phys Rev Lett. 98 (21), 218103 (2007).</li><li>Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+transcriptional+profiling+of+adult+mouse+cardiomyocytes.">Single cell transcriptional profiling of adult mouse cardiomyocytes.</a> J Vis Exp. (58), e3302 (2011).</li><li>Davare, M. A., Horne, M. C., Hell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatase+2A+is+associated+with+class+C+L-type+calcium+channels+(Cav1.2)+and+antagonizes+channel+phosphorylation+by+cAMP-dependent+protein+kinase.">Protein phosphatase 2A is associated with class C L-type calcium channels (Cav1.2) and antagonizes channel phosphorylation by cAMP-dependent protein kinase.</a> J Biol Chem. 275 (50), 39710-39717 (2000).</li><li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging.">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).</li><li>Chozinski, T. J., Gagnon, L. A., Vaughan, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twinkle,+twinkle+little+star:+photoswitchable+fluorophores+for+super-resolution+imaging.">Twinkle, twinkle little star: photoswitchable fluorophores for super-resolution imaging.</a> FEBS Lett. 588 (19), 3603-3612 (2014).</li><li>Dempsey, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoswitching+mechanism+of+cyanine+dyes.">Photoswitching mechanism of cyanine dyes.</a> J Am Chem Soc. 131 (51), 18192-18193 (2009).</li><li>Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., van den Broek, B., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+Imaging+Conditions+for+Demanding+Multi-Color+Super+Resolution+Localization+Microscopy.">Optimizing Imaging Conditions for Demanding Multi-Color Super Resolution Localization Microscopy.</a> PLoS One. 11 (7), e0158884 (2016).</li><li>Ovesny, M., Krizek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ThunderSTORM:+a+comprehensive+ImageJ+plug-in+for+PALM+and+STORM+data+analysis+and+super-resolution+imaging.">ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging.</a> Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).</li><li>Veeraraghavan, R., Gourdie, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+optical+reconstruction+microscopy-based+relative+localization+analysis+(STORM-RLA)+for+quantitative+nanoscale+assessment+of+spatial+protein+organization.">Stochastic optical reconstruction microscopy-based relative localization analysis (STORM-RLA) for quantitative nanoscale assessment of spatial protein organization.</a> Mol Biol Cell. 27 (22), 3583-3590 (2016).</li><li>Ries, J., Kaplan, C., Platonova, E., Eghlidi, H., Ewers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+versatile+method+for+GFP-based+super-resolution+microscopy+via+nanobodies.">A simple, versatile method for GFP-based super-resolution microscopy via nanobodies.</a> Nat Methods. 9 (6), 582-584 (2012).</li><li>Dixon, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graded+Ca2+/calmodulin-dependent+coupling+of+voltage-gated+CaV1.2+channels.">Graded Ca2+/calmodulin-dependent coupling of voltage-gated CaV1.2 channels.</a> Elife. 4, (2015).</li><li>Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+clustering+artifacts+in+photoactivated+localization+microscopy.">Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy.</a> Nat Methods. 8 (7), 527-528 (2011).</li><li>Nan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+superresolution+imaging+allows+quantitative+analysis+of+RAF+multimer+formation+and+signaling.">Single-molecule superresolution imaging allows quantitative analysis of RAF multimer formation and signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18519-18524 (2013).</li><li>Fricke, F., Beaudouin, J., Eils, R., Heilemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One,+two+or+three?+Probing+the+stoichiometry+of+membrane+proteins+by+single-molecule+localization+microscopy.">One, two or three? Probing the stoichiometry of membrane proteins by single-molecule localization microscopy.</a> Sci Rep. 5, 14072 (2015).</li></ol>

La recente esplosione di tecnologie che permettono la formazione immagine oltre il limite di diffrazione hanno offerto nuove finestre nella complessità della cellula di mammiferi segnalazione nello spazio e nel tempo. Queste tecnologie includono tempesta, STED, PALM, GSD, SIM e le loro varianti (ad es., dSTORM, FPALM). L'ingegnosità degli scienziati dietro queste tecniche ha permesso di eludere i limiti imposti dalle leggi della fisica che regolano la diffrazione della luce. Nonostante questo risultato enorme,...

Le reazioni cellulari di segnalazione traducono cambiando ambienti interni ed esterni per avviare una risposta cellulare. Esse regolano tutti gli aspetti della fisiologia umana, che serve da base per l'ormone e rilascio di neurotrasmettitori, il battito cardiaco, visione, fertilizzazione e funzione conoscitiva. Rottura di queste cascate di segnalazione può avere gravi conseguenze sotto forma di condizioni patologiche tra cui cancro, morbo di Parkinson e di Alzheimer. Per decenni, gli investigatori biologici e medici sono utilizzati con successo le proteine fluorescenti, sonde e biosensori accoppiati con microscopia di fluorescenza come i principali strumenti per comprendere l'organizzazione spaziale e temporale preciso di questi cellulari segnali.
I punti di forza di tecniche ottiche quali epifluorescenza, confocale, o microscopia a fluorescenza (TIRF) riflessione interna totale sono loro sensibilità, velocità e compatibilità con live cell imaging, mentre la maggiore limitazione è loro diffrazione limitata risoluzione, strutture di significato o complessi di proteine inferiori a 200-250 nm non possono essere risolto. Con lo sviluppo teorico e pratico di deterministico super-risoluzione (per esempio, microscopia di svuotamento stimolato dell'emissione (STED1), strutturato microscopia di illuminazione (SIM2) o stocastici super-risoluzione (ad es. , deplezione di fotoattivazione localizzazione microscopia (PALM3), o stato fondamentale (GSD4,5)), risoluzione assiale e laterale in microscopia a fluorescenza è stata estesa oltre la barriera di diffrazione, all'ordine di decine di nanometri. Così, gli investigatori hanno ora la possibilità senza precedenti per visualizzare e comprendere come organizzazione e dinamica di proteine si traduce in funzione al livello vicino-molecolare.
Microscopia di svuotamento di stato fondamentale seguita da ritorno di singola molecola (GSDIM), o semplicemente GSD come è noto, aggira il limite di diffrazione riducendo il numero di emettere simultaneamente fluorofori4,5. Luce laser ad alta energia è usata per eccitare l'esempio fluorophore-etichettati, bombardando gli elettroni con fotoni e aumentando la probabilità saranno sottoposte a un 'spin-flip' e inserire il tripletto o 'buio-stato' stato eccitato4. Questo impoverisce efficacemente lo stato di terra, da qui il nome «suolo lo svuotamento dello stato». In stato di tripletto, fluorofori non emettono fotoni e il campione appare dimmer. Tuttavia, questi fluorofori casualmente ritorno allo stato di terra e possono passare attraverso diversi fotoni che emettono le transizioni di stato eccitato a terra prima di ritornare allo stato di tripletto. Con meno fluorofori che emettono in un dato momento, fotone scoppi emessa da singoli fluorophores diventare spazialmente e temporalmente distinte dai vicini fluorofori. La raffica di fotoni possa essere in forma con una funzione gaussiana, il centroide calcolato che corrisponde alla posizione del fluoroforo con una precisione di localizzazione che dipenda l'apertura numerica (NA) della lente, la lunghezza d'onda della luce utilizzata per eccitazione e fondamentalmente, il numero di fotoni emessi al fluoroforo. Una limitazione di GSD è che, poiché solo un sottoinsieme dei fluorofori emette attivamente in qualsiasi momento, migliaia di immagini dovrà essere raccolti nel corso di alcuni minuti per costruire una mappa di localizzazione completa. Il tempo di acquisizione lungo combinato con il requisito di laser ad alta potenza, significa che la GSD è più adatto a piuttosto che campioni dal vivo.
Questo articolo descrive la preparazione di campioni fissati per formazione immagine di microscopia di Super-risoluzione della membrana e del reticolo endoplasmatico (ER)-proteine residenti (per un elenco dei materiali di consumo necessari e reagenti Vedi Tabella materiali). Esempi di come questo protocollo può essere facilmente adattato per quantificare la dimensione e il grado di clustering di L-tipo scanalature tensione-gated Ca2 + (Cav1.2) nel sarcolemma dei miociti cardiaci, o usato per prevedere la distribuzione cellulare dell'ER, sono dimostrati. Comprendere la distribuzione e l'organizzazione di questi componenti cellulari è criticamente importante per capire l'iniziazione, traduzione e, infine, la funzione di molte Ca2 +-cascate di segnalazione dipendente. Ad esempio, Cav1.2 canali sono fondamentalmente importante per accoppiamento, mentre il ricevitore-mediata Ca2 + rilascio dall'ER è forse la più onnipresente cascata di segnalazione in cellule di mammifero eccitazione-contrazione.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P250-500</td>
			<td>To clean coverglass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1.5 coverglass 18 x 18 mm</td>
			<td>Marienfeld Superior</td>
			<td>0107032)</td>
			<td>To grow/process/image cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>BP3994</td>
			<td>Dilute to 1X with de-ionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4832</td>
			<td>Aids with cell adhesion to cover glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>114956-81-9</td>
			<td>Aids with cell adhesion to cover glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11150-059</td>
			<td>Ventricular myocyte culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM 11995</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10437028</td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-052-CL</td>
			<td>Cell culture solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td>Transient transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca2+-free PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1419-144</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 % Methanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A414-4</td>
			<td>Cell Fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Cell Fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SLBR6504V</td>
			<td>Cell Fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEAblock</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>37527</td>
			<td>BSA or other blocking solution alternatives exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Detergent to permeabilize cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-CaV1.2 (FP1)</td>
			<td>Gift</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Commercial anti-CaV1.2 antibodies exist such as Alomone Labs Rb anti-CaV1.2 (ACC-003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-RFP</td>
			<td>Rockland Inc.</td>
			<td>200-301-379</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 donket anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen (Thermo Scientific)</td>
			<td>A31573</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen (Thermo Scientific)</td>
			<td>A11031</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Prevents microbial growth for long term storage of samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C40</td>
			<td>Photoswitching buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2133</td>
			<td>Photoswitching buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td>Photoswitching buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta-Mercaptoethylamin hydrochloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP2664100</td>
			<td>Photoswitching buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63689</td>
			<td>Photoswitching buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S271-3</td>
			<td>Photoswitching buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D14-212</td>
			<td>Photoswitching buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Depression slides</td>
			<td>Neolab</td>
			<td>1 &#8211; 6293</td>
			<td>To mount samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twinsil</td>
			<td>Picodent</td>
			<td>13001000</td>
			<td>To seal coverglass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sec61&#946;-mCherry plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>49155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SR GSD 3D microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Washing block solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20 % SEAblock in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody incubation solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.5 % Triton-X100, 20 % SEAblock, in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody incubation solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1:1000 in PBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ground state depletion super-resolution imaging in mammalian cells

Gli avanzamenti nella biologia delle cellule e microscopia fluorescente sono intimamente correlati, con l'avanzata capacità di visualizzare eventi cellulari causando spesso drammatici salti nella nostra comprensione di come le cellule funzione. Lo sviluppo e la disponibilità della microscopia di Super-risoluzione ha notevolmente ampliato i limiti di risoluzione ottica da ~ 250-20 nm. I biologi non sono più limitati a descrivere le interazioni molecolari in termini di colocalizzazione all'interno di una zona di diffrazione limitata, piuttosto è ora possibile visualizzare le interazioni dinamiche delle singole molecole. Qui, descriviamo un protocollo per la visualizzazione e la quantificazione delle proteine cellulari da microscopia di svuotamento di stato fondamentale per l'imaging cellulare fisso. Forniamo esempi da due proteine di membrana diversi, un elemento del Traslocone il reticolo endoplasmatico, sec61β e un membrana plasmatica localizzato tensione-gated L-tipo Ca2 + canale (CaV1.2). Vengono descritti il microscopio specifici parametri, metodi di fissazione, foto-commutazione formulazione di buffer e insidie e sfide di elaborazione delle immagini.

Come documentato nell'introduzione, ci sono molti microscopia di Super-risoluzione diverse modalità di formazione immagine. Questo protocollo, si concentra su formazione immagine di Super-risoluzione GSD. Immagini rappresentative e mappe di localizzazione sono mostrate in Figura 2 e Figura 3.
La figura 2 Mostra delle cellule COS-7 transfet...

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Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Questo articolo descrive un protocollo per l'individuazione di uno o più del plasma e/o proteine di membrana intracellulare mediante microscopia ad alta super-risoluzione stato fondamentale lo svuotamento (GSD) in cellule di mammifero. Andremo a discutere i vantaggi e le considerazioni di utilizzare tali approcci per la visualizzazione e la quantificazione delle proteine cellulari.

Stato fondamentale lo svuotamento super-resolution Imaging in cellule di mammifero

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Research

JoVE Journal

Biology

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

A lungo termine Imaging cellule di mammifero utilizzando Wide-Field Microscopia

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