Name: desensitization and recovery of crayfish photoreceptors upon delivery of a light stimulus
Uploaded: 2019-11-09T12:00:00
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Este trabalho foi apoiado pela subvenção DGAPA-UNAM IN224616-RN224616. Os autores querem agradecer à Sra. Josefina Bolado, Chefe do Departamento de Tradução de Artigos Científicos, da División de Investigación da Facultad de Medicina, UNAM, por editar a versão em inglês deste manuscrito.

NOTA: Os experimentos cumprem as Leis de Proteção animal do México.
1. Configuração experimental
<ol><li>Conexões gerais<ol>
<li>Conecte o amplificador a um computador adequado através de um conversor analógico e use um osciloscópio para monitorar o experimento (Figura 1).</li>
		<li>Conecte o photostimulator ao A/D convertido.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Câmara de gravação<ol>
<li>Coloque a câmara de gravação em cima de uma mesa anti-vibração e loca...

<ol>
	<li>Barriga-Montoya, C., G&#243;mez-Lagunas, F., Fuentes-Pardo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pigment+dispersing+hormone+on+the+electrical+activity+of+crayfish+visual+photoreceptors+during+the+24-h+cycle.">Effect of pigment dispersing hormone on the electrical activity of crayfish visual photoreceptors during the 24-h cycle.</a> Comp. Biochem. Physiol. A Comp. Physiol. 157 (4), 338-345 (2010).</li><li>Barriga-Montoya, C., de la O-Mart&#237;nez, A., Fuentes-Pardo, B., G&#243;mez-Lagunas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desensitization+and+recovery+of+crayfish+photoreceptors.+Dependency+on+circadian+time,+and+pigment-dispersing+hormone.">Desensitization and recovery of crayfish photoreceptors. Dependency on circadian time, and pigment-dispersing hormone.</a> Comp. Biochem. Physiol. A Comp. Physiol. 203, 297-303 (2017).</li><li>Wickenden, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+electrophysiological+techniques.">Overview of electrophysiological techniques.</a> Curr. protoc. pharmacol. 11, 1-17 (2014).</li><li>Brette, R., Destexhe, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+recording.">Intracellular recording.</a> Handbook of Neural Activity Measurement. , 44-91 (2012).</li><li>Cummins, D., Goldsmith, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+identification+of+the+violet+receptor+in+the+crayfish+eye.">Cellular identification of the violet receptor in the crayfish eye.</a> J. Comp. Physiol. 142 (2), 199-202 (1981).</li><li>Eguchi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhabdom+structure+and+receptor+potentials+in+single+crayfish+retinular+cells.">Rhabdom structure and receptor potentials in single crayfish retinular cells.</a> J. Cell and Comp. Physiol. 66, 411-430 (1965).</li><li>Nosaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+study+of+color+encoding+in+the+compound+eye+of+crayfish,+Procambarus+clarkii.">Electrophysiological study of color encoding in the compound eye of crayfish, Procambarus clarkii.</a> Z. vergl. Physiologie. 64 (3), 318-323 (1969).</li><li>Miller, C. S., Glantz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+adaptation+modulates+a+potassium+conductance+in+retinular+cells+of+the+crayfish.">Visual adaptation modulates a potassium conductance in retinular cells of the crayfish.</a> Vis Neurosci. 17 (3), 353-368 (2000).</li><li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches.">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).</li><li>Lishko, P., Clapham, D. E., Navarro, B., Kirichok, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+patch-clamp.">Sperm patch-clamp.</a> Methods Enzymol. 525, 59-79 (2013).</li><li>Finkel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axoclamp-2A+microelectrode+clamp+theory+and+operation.">Axoclamp-2A microelectrode clamp theory and operation.</a> Axon Instruments, Inc. , (1990).</li><li>Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-channel recording. , (2013).</li><li>Van Harreveld, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physiological+solution+for+freshwater+crustacea.">A physiological solution for freshwater crustacea.</a> Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 34 (4), 428-432 (1936).</li><li>Oesterle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> pipette cookbook. , 97 (2008).</li><li>Fuentes-Pardo, B., Ramos-Carvajal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phase+response+curve+of+electroretinographic+circadian+rhythm+of+crayfish.">The phase response curve of electroretinographic circadian rhythm of crayfish.</a> Comp. Biochem. Physiol. A Comp. Physiol. 74 (3), 711-714 (1983).</li><li>Pace-Schott, E. F., Hobson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurobiology+of+sleep:+genetics,+cellular+physiology+and+subcortical+networks.">The neurobiology of sleep: genetics, cellular physiology and subcortical networks.</a> Nat. Rev. Neurosci. 3 (8), 591-605 (2002).</li><li>Pittendrigh, C. S., Aschoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+mechanism+of+the+entrainment+of+a+circadian+rhythm+by+light+cycles.">On the mechanism of the entrainment of a circadian rhythm by light cycles.</a> Circadian Clocks. , 277-297 (1965).</li><li>Pittendrigh, C. S., Aschoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+systems:+entrainment.">Circadian systems: entrainment.</a> Handbook Behavioral Neurobiology Biological Rhythms. , 94-124 (1981).</li><li>Vitaterna, M. H., Takahashi, J. S., Turek, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+circadian+rhythms.">Overview of circadian rhythms.</a> Alcohol Res. Health. 25 (2), 85-93 (2001).</li><li>Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ion channels of excitable membranes. 507, (2001).</li><li>Dircksen, H., Strauss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+clocks+in+crustaceans:+identified+neuronal+and+cellular+systems.">Circadian clocks in crustaceans: identified neuronal and cellular systems.</a> Front Biosci. 15, 1040-1074 (2010).</li><li>Terakita, A., Hariyama, T., Tsukahara, Y., Katsukura, Y., Tashiro, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+GTP-binding+protein+Gq+with+photoactivated+rhodopsin+in+the+photoreceptor+membranes+of+crayfish.">Interaction of GTP-binding protein Gq with photoactivated rhodopsin in the photoreceptor membranes of crayfish.</a> FEBS Lett. 330, 197-200 (1993).</li><li>Terakita, A., Takahama, H., Hariyama, T., Suzuki, T., Tsukahara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+regulated+localization+of+the+beta-subunit+of+Gq-type+G-protein+in+the+crayfish+photoreceptors.">Light regulated localization of the beta-subunit of Gq-type G-protein in the crayfish photoreceptors.</a> J Comp Physiol A. 183 (4), 411-417 (1998).</li><li>Terakita, A., Takahama, H., Tamotsu, S., Suzuki, T., Hariyama, T., Tsukahara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-modulated+subcellular+localization+of+the+alpha-subunit+of+GTP-binding+protein+Gq+in+crayfish+photoreceptors.">Light-modulated subcellular localization of the alpha-subunit of GTP-binding protein Gq in crayfish photoreceptors.</a> Vis Neurosci. 13 (3), 539-547 (1996).</li></ol>

O lagostim provou ser um excelente modelo devido à sua capacidade de sobreviver em condições não naturais. Há fácil acesso a análises eletrofisiológicas in vivo e in vitro. Além disso, os crustáceos são um grupo favorável à pesquisa neurobiológica no campo da cronobiologia comparativa21.
Neste artigo, o estudo da dessensibilização e recuperação da corrente de transdução ativada pela luz das células fotorreceptoras de lagostins é m...

A fim de ser percebido como um estímulo visual, a luz atingindo os olhos deve ser transduzida em um sinal elétrico. Assim, em todos os organismos visuais, a luz desencadeia uma corrente íon-transducção, que por sua vez produz uma mudança no potencial de membrana das células fotorreceptoras, o chamado potencial receptor. Devido a isso, a sensibilidade à luz do olho depende principalmente do estado da condutância ativada pela luz, que pode estar disponível para ser ativada ou insensível.
Em fotorreceptores de lagostins, a luz desencadeia uma corrente lenta, transitória e iônica1. Após a iluminação, a corrente de transdução surge após um atraso ou latência antes de atingir o seu máximo; depois disso, decai, como os canais de transdução cair em um estado insensível em que eles não respondem a mais estímulo luz2. Ou seja, a luz, além de ativar a corrente de transdução responsável pela visão, também induz um decrement transitório da sensibilidade das células fotorreceptoras. A dessensibilização pode representar um mecanismo de proteção geral contra a superexposição a um estímulo adequado. A sensibilidade do olho à luz é recuperada à medida que a condução da transdução se recupera da dessensibilização.
A gravação intracelular é uma técnica útil para medir a atividade elétrica das células excitáveis3,4,5,6,7,8. Embora a gravação intracelular tenha se tornado menos frequente com o advento da técnica de braçadeira9,ainda é uma abordagem conveniente quando as células são difíceis de isolar, ou apresentam uma geometria que dificulta a formação das focas giga de fixação de remendos(ou seja,focas ou contatos apertados entre o eletrodo de remendo e membranas com resistência elétrica da ordem de 109ohms). Exemplos desteúltimo são espermatozóides10 e as células fotorreceptoras aqui estudadas. Em nossa experiência, os fotorreceptores Procambarus clarkii são difíceis de isolar e manter na cultura primária; além disso, são hastes finas que tornam difícil a formação giga-seal. Em gravações intracelulares, um eletrodo afiado é avançado em uma célula que é mantida no lugar pelo tecido circundante. O eletrodo é picado pelos circuitos de comutação de alta velocidade do amplificador, de modo que a corrente é amostrada entre pulsos de tensão. Este modo é conhecido como clampedede descontínuo de eletrodo único (modo dSEVC)11. A alta resistência (pequena abertura) do eletrodo dificulta a troca difusão entre a célula e as soluções de pipetas, produzindo uma perturbação mínima do ambiente intracelular3. Uma desvantagem potencial desta técnica é que a inserção de eletrodos pode produzir uma corrente de vazamento não seletiva; portanto, deve ser tomado cuidado para evitar o registro de células onde o tamanho da corrente de vazamento pode interferir com as medições pretendidas4,12.
Aqui, usamos eyestalks lagostins isolados para avaliar a dessensibilização e recuperação da condução de íons ativados pela luz apartir da realização de gravações elétricas intracelulares de células fotorreceptoras condições de braçadeira de tensão.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:644px;" width="644">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Axoclamp2A&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Axon Instruments Inc</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:180px;">Amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Digidata 1200 Interface</td>
			<td style="width:129px;">Axon Instruments Inc</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Digitizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Oscilloscope TDS430A</td>
			<td style="width:129px;">Tektronix</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Analogic Oscilloscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Photostimulator PS33 Plus</td>
			<td style="width:129px;">Grass</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Lamp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Puller PC-100</td>
			<td style="width:129px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Micropipette Puller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Puller P-97</td>
			<td style="width:129px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Micropipette Puller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass Capillary Tube Kimax-51</td>
			<td style="width:129px;">Kimble Products</td>
			<td style="width:119px;">34502</td>
			<td>0.8, 1.10, 100 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HS-2 Headstage</td>
			<td style="width:129px;">Axon Instruments Inc</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Headstage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micromanipulator MX-4</td>
			<td>Narishige</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Mechanical Micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stereoscopic Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">pClamp</td>
			<td>Axon Instruments Inc</td>
			<td></td>
			<td style="width:180px;">Data acquisition software for digidata 1200 interface</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Clampfit</td>
			<td>Axon Instruments Inc</td>
			<td></td>
			<td style="width:180px;">Analysis software linked to pClamp</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Origin</td>
			<td>OriginLab Corp.</td>
			<td></td>
			<td style="width:180px;">Data analysis and graphing software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td>&#62;99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P-9333</td>
			<td>Minimum 99%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Magnesium Sulfate</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M7506</td>
			<td>Minimum 99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C5080</td>
			<td>Minimum 99.0%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hepes</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H7523</td>
			<td>&#62;99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S8045</td>
			<td>98.00%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium hypochlorite solution</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">425044</td>
			<td style="width:180px;">Available chlorine, 10-15%&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

desensitization and recovery of crayfish photoreceptors upon delivery of a light stimulus

Um método para estudar a dessensibilização e recuperação de fotorreceptores de lagostins é apresentado. Realizamos gravações elétricas intracelulares de células fotorreceptoras em eyestalks isolados usando a configuração de tensão-clamp comutada por eletrodo. Primeiro, com uma lâmina de barbear fizemos uma abertura na córnea dorsal para ter acesso à retina. Depois disso, inserimos um eletrodo de vidro através da abertura, e penetramos uma célula conforme relatado pelo registro de um potencial negativo. O potencial da membrana foi apertado no potencial de descanso do fotorreceptor e um luz-pulso foi aplicado para ativar correntes. Finalmente, o protocolo de dois flashs leves foi empregado para medir a dessensibilização e recuperação atuais. O primeiro flash de luz desencadeia, após um período de atraso, a corrente iônica de transdução, que depois de atingir uma amplitude máxima decai em direção a um estado dessensibilizado; o segundo flash, aplicado em intervalos de tempo variados, avalia o estado da condutância ativada pela luz. Para caracterizar a corrente provocada pela luz, três parâmetros foram medidos: 1) latência (o tempo decorrido entre a entrega de flash de luz e o momento em que a corrente atinge 10% de seu valor máximo); 2) pico de corrente; e 3) tempo de dessensibilização constante (tempo exponencial constante da fase atual de decadência). Todos os parâmetros são afetados pelo primeiro pulso.
Para quantificar a recuperação da dessensibilização, a razão p2/p1 foi empregada versus o tempo entre os pulsos. p1 é a corrente de pico evocada pelo primeiro pulso de luz, e p2 é a corrente de pico evocada pelo segundo pulso. Esses dados foram ajustados a uma soma de funções exponenciais. Finalmente, essas medidas foram realizadas em função do tempo circadiano.

Primeiro, um potencial receptor representativo de células fotorreceptoras de lagostins é obtido (Figura 4). Posteriormente, um flash de luz de teste foi aplicado para desencadear a corrente de transdução de luz (Figura 5). A corrente de transdução cationic1 ativa após um atraso, atingindo um máximo e, posteriormente, lentamente cai em um estado absorvente insensível do qual se recupera lentamente....

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Desensitization and Recovery of Crayfish Photoreceptors Upon Delivery of a Light Stimulus

Um protocolo para o estudo da dessensibilização e recuperação da sensibilidade de fotorreceptores de lagostins em função do tempo circadiano é apresentado.

Dessensibilização e recuperação de fotorreceptores de lagostins após a entrega de um estímulo leve

A method to study desensitization and recovery of crayfish photoreceptors is presented. We performed intracellular electrical recordings of photoreceptor ...

O objetivo geral deste procedimento é estudar a dessensibilização e a recuperação da sensibilidade dos fotorreceptores de lagostim em função do tempo circadiano, utilizando gravações elétricas intercelulares de células fotorreceptoras em estoques oculares isolados, empregando a configuração de grampo de tensão de eletrodo único descontínua. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da neurobiologia, como a dependência do tempo circadiano de tantas propriedades eletro-fisiológicas de fotorreceptores na inativação e recuperação. A principal vantagem dessa técnica, é que permite a medição da atividade elétrica dos fotorreceptores.Apesar da dificuldade de isolar as células e sem perturbar o meio intracelular. Demonstrando esse procedimento serão as médicas Carolina Barriga-Montoya e Araceli de la O-Maritnez, colegas de trabalho do nosso laboratório. Para preparar o eletrodo intracelular, puxe o tubo capilar de vidro com um puxador de micropipette para obter uma ponta fina com uma pequena abertura.Em seguida, encha o vidro capilar puxado com solução de cloreto de potássio de 2,7 molar por capilaridade e, em seguida, encha metade da pipeta com uma agulha de injeção fina. Se necessário, toque na pipeta de eletrodo para eliminar bolhas de ar. Depois disso, coloque o eletrodo em seu suporte.Conecte o suporte ao estágio da cabeça do amplificador com o amplificador. Na sequência, posicione o estágio da cabeça do suporte do eletrodo com um micromanipulador 3D estável. Abaixe o eletrodo até que a solução de banho cubra sua ponta.Selecione o modo ponte do amplificador e meça a resistência ao eletrodo. Certifique-se de que a resistência é de cerca de 50 megaohms. Anular a corrente de deslocamento e compensar os transitórios capacitivos usando o botão de posição de retenção no grampo de tensão de seção do amplificador e o botão de neutralização da capacitância na seção Microelectrode 1 do amplificador.Para construir o sistema de super fusão, despeje a solução de banho em um recipiente adequado e conecte-a a um conjunto de tubos de irrigação, conectando assim a câmara de gravação. Use um sistema de superfusão movido pela gravidade. Regular a vazão para 0,5 mililitros por segundo.Conecte a câmara a um dispositivo de sucção. Regular o sistema de sucção da solução com uma bomba de vácuo de tal forma que o volume total da câmara de gravação não varie. Para isolar o estoque ocular de um lagostim adulto, desprezá-lo da base com uma tesoura fina.Faça uma abertura de um milímetro quadrado na córnea dorsal usando uma lâmina de barbear para acessar a retina. Em seguida, coloque o estoque ocular no centro da câmara de gravação com a abertura para a retina voltada para cima. Mantenha o estoque de olhos na escuridão por 20 minutos.Coloque o microeletrodo paralelo ao eixo longitudinal dos estoques oculares de tal forma que a microeletrídria esteja centrada no acesso à retina. Use um microscópio estereoscópico para colocar os dispositivos na configuração correta. Em seguida, monitore a diferença de tensão entre os eletrodos de referência e gravação selecionando o modo ponte do amplificador.Abaixe o eletrodo no banho e coloque-o sobre a retina. Remova o microscópio e posicione a lâmpada fototimuladora paralela ao eixo longitudinal dos estoques oculares. Em seguida, abaixe lentamente o microeletrodo até que uma queda repentina de tensão seja detectada.Posteriormente, entregue um flash de luz de teste para registrar o potencial do receptor do fotorreceptor. Para obter gravações adequadas de correntes provocadas pela luz, é fundamental fazer um bom prejuízo de uma célula fotorreceptora saudável. Neste procedimento, fixar a tensão no potencial de membrana de repouso medido da célula, selecionando a amplitude de retenção no software de aquisição de dados.Em seguida, selecione o modo DSEVC do amplificador. Na seção de modo do amplificador, selecione o botão SEVC e mude a alavanca para o Disconte. Posição sevc.Defina a taxa de comutação para 500 a 1.000 hertz, conforme determinado pela velocidade do eletrodo. Depois disso, entregue um flash de luz e observe o fluxo de íons evocado. Em seguida, entregue um par de pulsos de luz e aplique o segundo flash após um intervalo de tempo desejado.Digitalize as correntes em amostragem de 10 kilohertz com o software de aquisição de dados e salve os dados para análise off-line. Mostrado aqui é um protocolo de dois pulsos. Estímulos leves foram aplicados a zero milissegundos e 700 milissegundos.Este número mostra a recuperação da dessensibilização. Aqui está a recuperação da latência, aqui está o pico de recuperação atual, e aqui está o tempo de dessensibilização constante de recuperação tau. Os experimentos foram realizados a zero horas de circadiano.Este número mostra a recuperação da dessensibilização em função do tempo circadiano. Esta é a recuperação do iP, esta é a recuperação de L, e esta é a recuperação de tau, e este gráfico mostra as constantes de tempo ponderadas. Os processos bifásicos são marcados com uma flecha.Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em duas horas, se for feita corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de mirar em um baixo ruído e baixa corrente de vazamento, deficiência fotorreceptora. Após esse procedimento, outros métodos, como ensaios farmacológicos, podem ser feitos para responder a perguntas adicionais, como o envolvimento de determinados canais, receptores ou vias de sinalização.Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da neurobiologia explorarem a dependência do tempo circadiano das propriedades eletrofisiológicas das células fotorreceptoras. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como estudar a dessensibilização e recuperação da corrente de transdução ativada pela luz usando a técnica de gravação intracelular.

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SCIENTISTS IN ACTION

Recording Behavioral Responses to Reflection in Crayfish

Gravação de respostas comportamentais à Reflexão em Crayfish

Social behavior depends on sensory input from the visual, mechanical and olfactory systems.  One important issue concerns the relative roles of each ...

Neurociência

Physiological Recordings of High and Low Output NMJs on the Crayfish Leg Extensor Muscle

Gravações fisiológicos de NMJs Output High and Low no músculo extensor Crayfish Leg

We explain in detail how to expose and conduct electrophysiological recordings of synaptic responses for high (phasic) and low (tonic) output motor ...

Muscle Receptor Organs in the Crayfish Abdomen: A Student Laboratory Exercise in Proprioception

Muscular órgãos receptores no abdômen Crayfish: Um Exercício em Laboratório Student Propriocepção

The primary purpose of this experiment is to demonstrate primary sensory neurons conveying information of joint movements and positions as proprioceptive ...

Physiological Experimentation with the Crayfish Hindgut: A Student Laboratory Exercise

Experimentação fisiológicas com o intestino posterior Crayfish: Um Exercício Laboratório de Student

The purpose of the report is to describe dissection techniques for preparing the crayfish hindgut and to demonstrate how to make physiological recordings ...

Behavioral Determination of Stimulus Pair Discrimination of Auditory Acoustic and Electrical Stimuli Using a Classical Conditioning and Heart-rate Approach

Determinação do Comportamento da Discriminação do estímulo acústico Par de estímulos auditivos e elétrica usando um condicionamento clássico e da freqüência cardíaca abordagem

Acute animal preparations have been used in research prospectively investigating electrode designs and stimulation techniques for integration into neural ...

Extinction Training During the Reconsolidation Window Prevents Recovery of Fear

Formação extinção durante a janela de reconsolidação impede a recuperação do Medo

Fear is maladaptive when it persists long after circumstances have become safe. It is therefore crucial to develop an approach that persistently prevents ...

The Swimmeret System of Crayfish: A Practical Guide for the Dissection of the Nerve Cord and Extracellular Recordings of the Motor Pattern

O Sistema Swimmeret de lagosta: Um Guia Prático para a dissecção da medula nervosa e extracelulares Recordings do padrão motor

Here we demonstrate the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. The preparation comprises the last two thoracic ganglia (T4, T5) and the chain of ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Método eletrofisiológico para respostas gravação intracelular de tensão<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorreceptores e Interneurônios à luz Estímulos<em&gt; In Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Analisando Synaptic Modulação da<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Fotorreceptores após exposição à luz prolongada

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...