Name: visualizing multiciliated cells in the zebrafish through a combined protocol of whole mount fluorescent in situ hybridization and immunofluorescence
Uploaded: 2017-11-18T13:00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence at JoVE.c

この作品は一部インスタントスキルし国立科学財団大学院研究フェローシップ号助成金 R01DK100237 によって支えられました。DGE-1313583 に A.N.M.また、大学の科学夏学部研究フェローシップ ・ プログラム調印への支援に感謝します。自分専用のケア私たちのゼブラフィッシュのノートルダム大学でゼブラフィッシュ研究センターに感謝したいと思います。また、生物科学専攻だけでなく、彼らのサポートと貴重な洞察力のすべての研究室のメンバーに感謝したいと思います。

次のプロトコルは、ゼブラフィッシュ大人維持し、ノートルダム大学でゼブラフィッシュ研究センターの世話を使用します。ゼブラフィッシュ大人と胚を操作するためのすべてのメソッドは、機関動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。
1. 胚の固定
<ol><li>上記の方法39,40を用いたゼブラフィッシュ胚を収集します。24 で hpf、胚の E3 に非特定プロテアーゼ混合溶液 (50 mg/mL) の 500 μ L 皿加温室温 (RT) で追加。</li>
	<li>胚の絨毛膜分割し始め、一旦胚皿からすべての液体を削除します。</li>
	<li>E3 の約 20 mL を追加、皿、E3 を軽く旋回液体廃棄物の容器に液体をデカントによって新鮮な E3 に胚を 2-3 回を洗います。</li>
	<li>修正する前に胚を安楽死、E3 に 0.2% tricaine 2 mL を追加します。</li>
	<li>プラスチック製の Pasteur のピペットを使用して 5 mL バイアルに胚を転送します。胚は、バイアルの底に落ち着いて後にピペットを使用して tricaine/E3 ソリューションのほとんどを削除します。</li>
	<li>撹拌せず常温では、2-4 時間 4% パラホルムアルデヒド (PFA) の 5 mL で 24 hpf 胚を固定します。 注意: PFA は有毒であると研究者は実験用の上着や手袋、眼の保護を着ている間、PFA ソリューションは化学のボンネットの下処理必要があります。PFA 顆粒から PFA 定着剤の準備は、グラニュー PFA が静電気によって分散する傾向がある例外的な注意を払って行わなければなりません。 注: 胚は 4 %pfa が 4 ° C で一晩で修正できます。準備 4% グラニュー PFA を完全に解消するソリューションを継続的に攪拌しながら沸騰させるリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 1 を加熱することによって PFA。一度ソリューションが RT、PFA は真空ろ過、0.45 μ m の使い捨てシステムを通すことで滅菌フィルター 4% に戻ってダウン冷却し、-20 ° C で保存用 15 mL や 50 mL の部分に避けよう</li>
	<li>削除、4 %pfa と 1 X リン酸バッファーで 2 回洗浄胚 0.1% 生理食塩水トゥイーン 20 (pbst;) 室温洗って新鮮な 100% の右追加 5 mL で 100% メタノール (メタノール) 5 mL を 1 回胚胚にメタノールし、-20 ° c 少なくとも 20 分間加温します。 注: 胚は 100% に格納できる胚の準備の準備ができるまでの-20 ° C でメタノール。</li>
</ol>2. 胚の準備および交配
<ol><li>50 %5 mL で 1 回の洗濯で胚を水分補給 1 のメタノールを 5 mL 30% の胚を洗浄することにより RT 続行水分補給で 5 分間 x PBST 1 のメタノール室温 5 分 x PBST 1 の 5 mL で胚を洗う x PBST で各 5 分の 2 回。RT。</li>
	<li>1 の縮尺プロテイナーゼ K 溶液 5 mL (pK) (10 mg/mL) にそれらを孵化によって胚を permeabilize ルートで 2 分間 x PBST 注: 古い胚 pK 濃度濃度 5 mg/mL とインキュベーション時間 2 分未満しかし、上記の 2 分が 24 未満の胚の示唆されたより長く培養できます hpf。</li>
	<li>室温 2 回 pbst; 4 %5 mL に胚を修正する 1 つの x の 5 mL pK ソリューションと即座に洗浄を削除、少なくとも 20 分間常温 PFA。 注: 胚は 4 %pfa が 4 ° C で一晩で修正できます。</li>
	<li>削除 PFA と洗浄を 2 度 1 の 5 mL 室温 x PBST</li>
	<li>1 の 5 mL の胚を転送平らな底遠心チューブに x PBST それぞれの胚とその後交配ソリューション間の相互作用を容易にする RT で遠心ラックに上向きに置かれました。</li>
	<li>新鮮な Hyb + RT。 追加 1.5 mL でハイブリダイゼーション溶液 (Hyb +) 1.5 mL で 2 回胚を洗って、4-6 h のハイブリダイゼーション オーブンで 70 ° C で胚を孵化させなさい。</li>
	<li>プローブ ソリューションのボリュームの Hyb + 1.5 mL に置き換えます (10 μ L RNA プローブ/500 μ L Hyb +) 胚を完全にカバーするために十分な。 注: は、アンチセンス RNA プローブ以前を使用して説明の方法39を合成します。</li>
	<li>振盪せずに遠心ラックに配置されている個々 のチューブ直立 70 ° C でハイブリダイゼーション オーブンで一晩プローブを交配させます。</li>
</ol>3. ホット洗浄およびブロック
注: ホット洗浄は、胚の適切なソリューションを置くと、ハイブリダイゼーション オーブン 70 ° C で培養によって実行されます。70 ° C で洗浄ソリューションを維持、ハイブリダイゼーション オーブンに各ソリューションの 50 mL チューブに配置場合プローブ/Hyb + 混合物を追加。
<ol><li>プローブを削除します。50% ホルムアミド/2 x 20-30 分のクエン酸塩ナトリウム (SSC) バッファーの 1.5 mL で 70 ° C で 2 回胚を洗います。 注: プローブ Hyb + で-20 ° C で保存して再使用できる後日。</li>
	<li>70 ° c 2 の 1.5 mL で胚を一度洗って 15 分の x SSC は、20-30 分の 0.2 X SSC の 1.5 mL で 70 ° C で 2 回胚を洗います。1.5 ml のブロッキング試薬の置換 0.2 x SSC と 4 ° C で一晩インキュベート 注: それは一晩ではなく 4 h の RT でブロッキング試薬をインキュベートする可能です。</li>
</ol>4. 抗体の孵化とマレイン酸バッファー洗浄
注意: 胚の周囲の光から保護します。
<ol><li>ブロッキング試薬に置き換えて抗 DIG-ポッド縮尺の比率でブロッキング試薬 0.2 mL、3 h の箔や室温に別の遮光カバーの下でインキュベート 注: また、抗体の 4 ° C での一晩インキュベートすることができます。</li>
	<li>3 h 後 2-4 倍した加温胚は一晩で 1.5 mL の新鮮なマレイン酸バッファー 4 ° C の各 10-15 分のマレイン酸バッファーの 1.5 mL で胚を洗ってください。 注: マレイン酸バッファーで一晩インキュベートする必要はありませんが、行うので減少プローブ背景。</li>
</ol>5. プローブの検出およびペルオキシダーゼの除去
注意: 胚の周囲の光から保護します。
<ol><li>マレイン酸バッファーを削除し、1.5 mL の 1x PBS で置き換えます。蛍光染色液室温 60 分 1.5 mL で 5 分間各 0.2 mL に加温した胚 Cy3 の 1x PBS で 2 回胚を洗う 注: 異なるプローブのインキュベーション時間が異なる場合があります。</li>
	<li>RT で 10 分の 1 × PBS で次の % メタノールの 1.5 mL で一度胚を洗う: 30%、50% メタノール メタノール、75% メタノールと 100% メタノール。</li>
	<li>1.5 ml の MeOH 中 RT。 洗浄で 30 分間 1% H2O2の胚を RT で 10 分の 1 × PBS で次の MeOH ソリューションの 1.5 mL で一度胚孵化させなさい: 75% メタノール、50% メタノール、および 30% メタノール。1.5 mL の 1x PBS で常温 5 分のため 2 回胚を洗浄します。 注: 胚に格納できる PBS 一晩 4 ° C で</li>
</ol>6. 蛍光抗体法
注意: 胚の周囲の光から保護します。
<ol><li>室温 7 分洗う ddH2O 5 分の 1.5 mL で一度胚した洗浄で 1.5 に一度胚のためあらかじめ冷やしたアセトン (-20 ° C で保管) の 1.5 mL で胚した洗浄で ddH2O 5 分の 1.5 mL で胚を洗う1 mL 1 %dmso (PBDT) ルートで 5 分間 x PBST</li>
	<li>2 時間常温ロッカーの PBDT + 10% 牛胎児血清 (FBS) の 1.5 mL で胚を孵化させなさい。</li>
	<li>一次抗体、抗アセチル化チューブリン (マウスから生産)、アンチ-γ-チューブリン (ウサギから生産)、PBDT + 1 %1: 400 で一緒に希釈した 1.5 mL で取り外して交換する PBDT + FB 政府短期証券。4 ° C で一晩胚を孵化します。 注: インキュベーション時間は一次抗体によって異なる場合があります。さまざまな時間間隔のテスト表示を最適化する必要があります。</li>
</ol>7. 二次抗体
注意: 胚の周囲の光から保護します。
<ol><li>過剰を削除する胚からの抗体を非連結、FBS + ロッカーに RT で 1 分の 0.1 M の NaCl を PBDT + 1% の 1.5 mL で洗います。</li>
	<li>胚を洗う PBDT + 1% の 1.5 mL で 5 回 FBS + 室温ロッカーに各 30 分の 0.1 M の NaCl を洗う胚 PBDT + 1% の 1.5 mL で 30 分常温ロッカーの FBS。</li>
	<li>一晩で 200 μ L 二次抗体の 4 ° C の胚をインキュベート アレクサ 488 ヤギ抗マウス igg 抗体と Alexa 647 ヤギ抗ウサギ IgG、1: 500 で PBDT で一緒に希釈しました。</li>
</ol>8. DAPI 染色
注意: 胚の周囲の光から保護します。
<ol><li>胚をすぐに洗って RT で PBDT の 1.5 mL で 2 回。DAPI の 1.5 mL で PBDT を置き換える、pbst; X 1 で 1:15000 を希釈し、15 分常温ロッカーを孵化させなさい。</li>
	<li>PDBT + 1% の 1.5 mL で胚を洗う FBS + 0.1 M 塩化ナトリウム 3 回 RT 15-20 分間。マウントし、イメージの準備ができるまで、4 ° C で PBDT の 1.5 mL で胚を格納します。</li>
</ol>9. マウントおよびゼブラフィッシュ Pronephros イメージング
<ol><li>小さな容量の約 10 μ L、PBDT のガラス スライドのレイアウト胚横。</li>
	<li>頭を削除する微細鉗子のペアと卵黄球の一部の目の後ろに胚を絞る。</li>
	<li>ゆっくりとこすり胚の体から残りの卵黄のボールに微細鉗子を使用します。薄い組織でスライドから分離卵黄、余分な液体を削除します。</li>
	<li>胚の残りの尾にメディアのマウントを一滴を追加し、尾を横に置いたように配置します。サンプルでは、平らにするカバー スライド ボックスに配置し尻尾の上に coverslip を配置します。</li>
	<li>次のチャネルを使用して共焦点顕微鏡の 60 倍の倍率で腎臓繊毛をイメージ: 青の DAPI (408.0 でセットをレーザー nm)、緑の FITC (488.0 でセットをレーザー nm)、赤色素 Cy3 標識 (561.0 でセットをレーザー nm) と白の Alexa 680 (637.0 でセットをレーザー nm)。</li>
</ol>

<ol>
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A., Jette, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+apoptosis+in+zebrafish+embryos+by+whole-mount+immunofluorescence+to+detect+activated+caspase+3.">Analysis of apoptosis in zebrafish embryos by whole-mount immunofluorescence to detect activated caspase 3.</a> J Vis Exp. (82), e51060 (2013).</li><li>Schumacher, J. A., Zhao, E. J., Kofron, M. J., Sumanas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+fluorescent+in+situ+hybridization+using+chromogenic+substrates+in+zebrafish.">Two-color fluorescent in situ hybridization using chromogenic substrates in zebrafish.</a> Bio Techniques. 57, 254-256 (2014).</li><li>Julich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beamter/deltaC+and+the+role+of+Notch+ligands+in+the+zebrafish+somite+segmentation,+hindbrain+neurogenesis+and+hypochord+differentiation.">beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation.</a> Dev Biol. 286, 391-404 (2005).</li><li>Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+high-resolution+detection+of+multiple+transcripts+combined+with+localization+of+proteins+in+whole-mount+embryos.">Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos.</a> BMC Biology. 12, (2014).</li><li>Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flat+Mount+Preparation+for+Observation+and+Analysis+of+Zebrafish+Embryo+Specimens+Stained+by+Whole+Mount+In+situ+Hybridization.">Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization.</a> J Vis Exp. (89), e51604 (2014).</li><li>Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Manual+Small+Molecule+Screen+Approaching+High-throughput+Using+Zebrafish+Embryos.">A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos.</a> J Vis Exp. (93), e52063 (2014).</li></ol>

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上記の詳細なプロトコルは、 odf3bトラン スクリプトと α-チューブリン 24 hpf ゼブラフィッシュ胚における pronephros の MCCs のラベルに最適です。最良の結果は、新鮮な固定および準備された胚を使用することをお勧めします。固定と 1 週間以上-20 ° C でメタノールまたは Hyb + のいずれかで保存されている胚は、胚をストレージに保持する時間の増加を汚す不要なバック グラウンドの確率が使用できます。
変更とトラブルシューティングのこの技術の特定のマーカー、その他のアンチセンスの riboprobes やその他の抗体などの他のスイーツのこのメソッドに合わせて必要です。全台紙の in situハイブリダイゼーション過程でステップのパラメーターを調整するための多くの方法がされている31,34,36,38、私たちのグループで以前記載されています。 39。同様に、各蛋白質抗体染色時間の面でいくつかのトラブルシューティングが必要になります、希釈、各一次抗体の孵化時間のおおよその範囲が文書化された結果28,の評価によって算出された最高35。 24 歳未満の胚の hpf、pK の治療は 2 分より短くなるはずどこ 24 より古い胚 2 分より長いため pk hpf を扱う必要があります。また、胚 24 より古い hpf は pK 治療前に、色素の漂白する必要があります。
蛍光染色液で染色後、メタノールや過酸化水素洗浄のシリーズを実行することによって、任意の残りの汚れ、抗体およびペルオキシダーゼを削除するが重要です。PBS 洗浄直後は胚から過剰なメタノールを削除に不可欠です。重要なは、IF 抗体を前に、我々 はアセトンと脱イオン水洗浄胚互いおよび/または遠沈管に付着しにくいことを発見しました。私たちの経験、特定のトランスクリプション要因および他の遺伝子のための抗体効率的に働くことがありますけれども西部のしみ、ゼブラフィッシュのよく動作しません。ただし、α-チューブリンと β-カテニンなどの非常に節約された、豊富な蛋白質は場合16,37のゼブラフィッシュでうまく動作しないでください。
魚、まだのゼブラフィッシュ特異抗体を持っていない遺伝子の RNA 転写産物を視覚化することが可能です。このプロトコルによって示されるように場合魚を組み合わせることによって、RNA 転写産物やタンパク質の共局在は見られる生体内で(図 2) できます。プロトコルの柔軟な性質により、様々 な RNA 転写産物と多数の組織および時間ポイントにおけるタンパク質の可視化のための迅速なトラブルシューティングできます。ゼブラフィッシュ胚のすでに尊敬の特性と組み合わせることで、魚 + 場合のこのプロトコルは発達経路制御する遺伝子および重要なタンパク質発現を探検する別のツールを提供します。

過去数十年にわたってゼブラフィッシュ (動脈分布) は、発生生物学を研究するプライム モデル生物として浮上しています。胚は母親以外の開発と光学的透過的です。また、目、腎臓、脳などの重要な器官の形成はちょうど 24 時間後受精 (hpf) によって形成された構造を持つ急速に発生します。重要なは、ゼブラフィッシュのゲノムが哺乳類1,2,3保存性が高い。さらに、ゼブラフィッシュと哺乳類の臓器と同様の解剖学と生理学があります。ゼブラフィッシュ胚の腎臓、または pronephros、初期のなかでもと脊椎動物のネフロン4,の保存された上皮細胞集団の運命決定の間に遺伝子の機能を調べるためのモデル システムの値を示してください。5,6,7,8,9,10します同様に、ゼブラフィッシュ胚の MCCs11,12,13,14,15,の個体発生を調べることでますます重要になっている。16,17。
その名の通り、MCCs は上皮細胞の頂端表面17に位置する繊毛の束によって特徴付けられます。ゼブラフィッシュ、MCCs 液流機能、24 hpf11,12,13,14、 、pronephros の各ネフロンの中間を通してファッションのような「霜降り」に分散しています。15,16,17. ひと腎臓の病気症例18,19,20,21MCCs、脳など他の哺乳類の組織で普及している彼らは、ほんの一握りで指摘されているが、気管22,23,24、実験的なデザインの課題を提起します。ゼブラフィッシュを含む様々 な脊椎動物モデルでエレガントな研究は、クライアント開発12,17,25 阻害剤としてシグナル伝達経路の切り込みと MCC 運命の保存された経路を示しています。、26,27。したがって、ゼブラフィッシュ pronephros クライアント開発生体内で11,12,13,14,の遺伝子のメカニズムを勉強する簡単にアクセスできるモデルについて説明します15,16,17。
透明性とゼブラフィッシュ胚の遺伝的操作を容易、初期胚1,2 の開発、組織の成長、細胞の運命を制御する遺伝学的および分子経路を検討するとき非常に貴重な特性であると証明します。 ,3。タンパク質と遺伝子の転写産物の in situハイブリダイゼーションなど全体の場合のマウントを視覚化する、されているに適用しゼブラフィッシュ16,28,29のために最適化された、このような伝統的な手法として 30,31,32,33,34,35,36,37,38。魚の場合は人気のあるプロトコルを組み合わせて、ラベル、MCCs体内の16,28,37,38を分析することが可能です。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>non-specific protease mixture solution</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11459643001, pronase from Streptomyces griseus</td>
			<td>Dilute in E3 without methylene blue to make 50mg/mL stock solution; store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute 50X E3 (250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water) in distilled water; add 1 x 10-5 M methylene blue (sigma M9140) to inhibit contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>A5040-250G</td>
			<td>To make a 0.2% stock solution, dissolve 1 g of tricaine powder in 10 mL Tris, pH 9.5 and distilled water up to 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>embryo dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL glass vials</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>225012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable plastic Pasteur pippettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde (PFA) solution</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>19210</td>
			<td>Dissolve 4% PFA in 1X PBS and bring to a boil under a fume hood. Cool and aliquot, then store at -20&#176;C. Do not refreeze once thawed for use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB11072</td>
			<td>Dilute in distilled water to make a 1X stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20 stock</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB02038</td>
			<td>Make a 0.1% Tween-20 stock by diluting in distilled water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20 (PBST)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td>0.1% Tween-20 in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol (MeOH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>34860-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proteinase K</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3115879001</td>
			<td>Dissolve in distilled water to make a 10 mg/mL stock; aliquot and store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flat bottom microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-300; 87003-298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formamide</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB00600</td>
			<td>store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hybridization solution (HYB+)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/mL yeast torula RNA, 50 &#956;g/&#956;L heparin; store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hybridization oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-247-10Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X saline-sodium citrate (SSC) buffer solution</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB13156</td>
			<td>dilute in distilled water to make 2X and 0.2X stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blocking reagent solution</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11096176001</td>
			<td>dilute in maleic acid buffer to make a 10% stock solution; store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>maleic acid buffer solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0375 and S7653</td>
			<td>150mM maleic acid, 100mM NaCl (pH 7.5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11207739910</td>
			<td>store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 fluorescent staining solution</td>
			<td>PerkinElmer, Inc.</td>
			<td>NEL744001KT, TSA Plus Cyanin3 system</td>
			<td>store at 4&#176;C; prepare staining solution fresh by making a 1:50 dilution of TSA reagent (dissolved in 60 uL of DMSO) in the kit buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide (H2O2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1009-500mL</td>
			<td>store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>molecular grade distilled water (ddH2O)</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>25-055-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetone</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB00636-01000</td>
			<td>store an aliquot at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB00435-01000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10438-034</td>
			<td>aliquot and store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monoclonal anti-acetylated tubulin clone 6-11B-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6793</td>
			<td>aliquot and store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#947;-tubulin anitbody produced in rabbit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5192</td>
			<td>aliquot and store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>odf3b cDNA clone MGC:63985</td>
			<td>OpenBiosystems</td>
			<td>IMAGE:6792478</td>
			<td>store bacterial glycerol stock at -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCL</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB01915-05000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa flour 647 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21245</td>
			<td>store at 4&#176;C; protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor 488 goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11029</td>
			<td>store at 4&#176;C; protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D1306</td>
			<td>aliquot and store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass slide</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>4445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass coverslip</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>12-540A</td>
			<td>18 x 18 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-1050</td>
			<td>Dumont Tweezers Pattern #55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mounting media</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>18606, Aqua-Poly/Mount</td>
			<td>store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>confocal microscope and associated software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We use a Nikon C2plus Confocal Microscope with NIS-elements AR software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rocker</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1660710EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing multiciliated cells in the zebrafish through a combined protocol of whole mount fluorescent in situ hybridization and immunofluorescence

近年、ゼブラフィッシュ胚は胚子宮 exと光透過性などの特徴により発生生物学を研究する人気モデルとして登場しました。特に、ゼブラフィッシュ胚研究 multiciliated 細胞 (MCC) の開発と同様に、脊椎動物の腎臓器官形成に重要な生物になりました。ゼブラフィッシュ胚性腎センターを視覚化するには、我々 は蛍光その場全体マウント交配 (魚) の複合的なプロトコルを開発しているし、全体高分解能イメージングを可能にする蛍光抗体法 (IF) をマウントします。本稿では、共同様々 な系統の因子の発現を通じて発達プログラムの制御を理解するツールとして RNA 転写産物やタンパク質をローカライズするための手法について説明します。

野生型ゼブラフィッシュ胚が 24 で固定した hpf と前述のようにすぐに準備します。図 1は、選択したイラスト段階に沿って実験ワークフローを示しています。1-8 の手順に従ってワークフローにはサンプル調達、固定、およびアンチセンス riboprobes 続いて興味のラベル蛋白への蛍光抗体法と内因性のトラン スクリプトにラベルを付ける固定組織の操作のプロセスが含まれます。ワークフローのステップ 9 は、取り付けとイメージング ゼブラフィッシュ胚性幹の可視化を最適化するために特別に設計された技術を指します。ステップ 9 に付随する図面では、スライド ガラス上の組織を配置するための操作方法を示しています。このステップでスライド ガラスと coverslip の間に配置される横尾を残して胚の頭と卵黄のボールは削除されます。卵黄のボール自動蛍光を発するし、実装プロセスを妨害、pronephros の MCC 住民の最高のイメージング卵黄のボールとヘッドの取り外しが示唆されました。
図 2を示しています 60 倍の倍率で同じ野生型胚と同じ倍率でデジタル ズームは、共焦点顕微鏡を用いた代表的な像を提供しています。下の 2 つのパネルはこれらの画像データの複合のオーバーレイ、上部パネルは、個々 のチャンネルのイメージを提供します。(左列のイメージ) の白いボックスは、デジタル ズーム (右列の画像) のフォーカスとなっている区域をについて説明します。デジタル ズームの最後のパネルで強調表示, 核を DAPI でラベル付けしたそして Mcc は、 odf3b γ-チューブリン抗体を示す基底の体、α-チューブリンを示します繊毛を認識するように設計されたアンチセンス riboprobe に基づいて検出されました。複合のオーバーレイのデジタル ズーム、黄色の破線の円は、 odf3bの成績証明書、複数の基底ボディと繊毛の所持のため検出されたクライアント センターの境界を示します。単一の体温と単一の繊毛を有するの表現型に基づく黄色点線の円が付いた、隣接のモノラル繊毛細胞が確認されました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56261/56261fig1.jpg"> 図 1: 実験フローチャートのスケマティック。これは雪が冷たいインキュベーションをことを示しますの重要な段階のイラストが伴う実験ワークフローのフローチャートに示します、3 本の曲線を表す熱、および時計は長いインキュベーション時間を表します。プロトコルで説明したように、長い時間の期間にわたっていくつかの手順を実行できますが、6 日間 (プロセスの各ステージの右上隅に番号を参照)、最低でワークフローを実行できます。実装プロセスの詳細な描写は、スライド ガラスと coverslip の最終的なマウントされた胚の尾を示す、描画されます。黒破線のボックスは、60 倍の倍率で撮影である区域をについて説明します。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56261/56261fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56261/56261fig2.jpg"> 図 2: ゼブラフィッシュ pronephros の MCCs を可視化結果を代表します。イメージの最大投影倍率と同じ胚の 60 倍の倍率で共にデジタル ズーム X 60 24 hpf 野生型ゼブラフィッシュ胚の。白いボックスは、ズームの焦点領域を示します。DAPI (核)、 odf3b (MCCs)、γ-チューブリン (基底ボディ)、α-チューブリン (繊毛) の個々 の汚れは貼付し、下の二つのパネルにマージされます。デジタル ズームで我々 は次のようにセルの位置の近似を提供: 黄色破線の円によってクライアント センターを囲まれ、黄色点線の丸モノ繊毛細胞の概要を説明します。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56261/56261fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence at JoVE.c

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

繊毛の開発は適切な器官形成に不可欠です。このプロトコルでは、ラベルを付けると、ゼブラフィッシュの繊毛細胞を可視化する最適化されたメソッドについて説明します。

全体のマウント蛍光In Situハイブリダイゼーション、免疫組織の結合されたプロトコルを介してゼブラフィッシュにおける Multiciliated の細胞を可視化します。

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

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Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

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