Name: improved method for the establishment of an in vitro blood-brain barrier model based on porcine brain endothelial cells
Uploaded: 2017-09-24T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells at JoVE.com

Gli autori vorrebbero riconoscere, Elisabeth Helena Bruun, Sarah Christine Christensen e Niels M. Kristiansen per assistenza tecnica, e la Fondazione di Lundbeck concedere numero R155-2013-14113.

suini cervelli sono stati ottenuti come sottoprodotti dell'industria alimentare danese. Macelli danesi sono sotto stretta sorveglianza e l'osservazione dal Ministero danese dell'ambiente e cibo.
 ratti utilizzati per l'isolamento degli astrociti sono stati allevati e stabulati in gruppo nella struttura animale locale ad una temperatura ambiente di 22 ° C - 23 ° C e su un ciclo di buio/luce 12/12 h sotto controllo del veterinario e secondo danese regolamenti per gli animali da laboratorio. I...

Purificazione e la proliferazione di pBEC
Durante la procedura di purificazione, fasi critiche includono la rimozione rapida ed efficace dei meninges e separazione della sostanza bianca e grigia, che è importante per la resa di purificazione e la purezza e per la corretta creazione del modello. Per il presentato in vitro BBB modello utilizzando pBECs, abbiamo migliorato e semplificato di una procedura di purificazione basata su meccanica omogeneizzazione della materia grigia isolato, fi...

Struttura cellulare e la funzione della barriera sangue - cervello
All'interfaccia del sistema nervoso centrale e circolatorio (CNS), la BBB agisce come un sito di regolamentazione chiave per controllo omeostatico del microambiente CNS, che è essenziale per la funzione adeguata e la protezione del sistema nervoso. Il sito della BBB è le cellule endoteliali che allineano il lume del vaso sanguigno. Nei capillari del cervello, le cellule endoteliali formano complesse giunzioni intercellulari strette e modelli di espressione fortemente polarizzata di particolare afflusso e deflusso trasportatori garantiscono un trasporto molecolare altamente specifico tra il sangue e il cervello 1. I componenti strutturali dei complessi stretta della giunzione includono le proteine dalla famiglia occludin e claudin, zonula occludens (ZO) proteine, cingulin e associati di molecole di adesione giunzionale (marmellate). 5 Claudin è particolarmente importante nella restrizione giunzionale paracellulare. Induzione e il mantenimento di questo caratteristico fenotipo endoteliale BBB coinvolgono interazioni dinamiche con le cellule circostanti, compreso i periciti, astrociti, neuroni e le membrane dello scantinato, che insieme con cervello endothelial cellule forma il neurovascular unità (NVU)2,3. I meccanismi coinvolti in queste interazioni non sono ancora completamente chiari, ma includono scambio di segnali chimici fra le cellule, che consente la modulazione della permeabilità BBB a breve termine e induce a lungo termine BBB caratteristiche4. Astrociti soprattutto sono conosciuti per contribuire al fenotipo endoteliale delle cellule del cervello e sono una fonte di fattori regolatori quali neurotrophic glial-derivato fattore (che interessano cAMP intracellulare)5, fattore di crescita di base del fibroblasto6, idrocortisone7e per la β (TGF-β) di fattore di crescita trasformante8. L'effetto di TGF-β, tuttavia, è stato dibattuto9.
Da In Vivo In Vitro BBB
In vivo gli studi continuano a fornire preziose informazioni sulla biologia BBB. Tuttavia, modelli di coltura cellulare possono fornire ulteriori approfondimenti e costituiscono strumenti utili per comprendere gli aspetti molecolari e funzionali dettagliati della BBB in salute e malattia. Anche se le complesse interazioni tra i tipi di cella e costituenti della BBB sono difficili da raggiungere completamente in modelli in vitro , c'è stato, dal prima purificazione delle cellule endoteliali cerebrali e l'applicazione di questi in mono-culture 10 , 11 , 12, ampio sviluppo delle procedure di purificazione e le condizioni di crescita della BBB cellulari modelli di cultura, con conseguente maggiore somiglianza con la barriera in vivo . I modelli BBB comunemente usate in vitro sono basati su cellule primarie di origine roditore, suina e bovina e su linee cellulari immortalizzate. Ogni modello presenta diversi vantaggi e svantaggi. Per la scelta di modello e confronto, marcatori di convalida come espressione di enzimi BBB, trasportatori, recettori e proteine strutturali vengono utilizzati per creare panoramiche del corrente affermati modelli1.
Obiettivo del protocollo
Una caratteristica importante della BBB è barriera strettezza e alto TEER, ancora un gran numero di modelli disponibili non riflettono bene i livelli in vivo . Integrando il contributo di sviluppo e ottimizzazione da parecchi laboratori, l'obiettivo di questo protocollo è di presente un metodo per stabilire un alto TEER in vitro BBB modello basato su pBECs primario in MC con o senza ACM o in NCC con primario astrociti di ratto o di origine suina. Le procedure applicate e istituzione del modello includono gli sforzi per eliminare le cellule contaminanti e per migliorare la differenziazione delle pBECs in un fenotipo BBB. Questo lavoro ha provocato l'istituzione di modelli TEER ad elevate affidabilità, con permeabilità paracellulare basso e buona espressione funzionale di proteine giunzionali stretti chiave, trasportatori e recettori. Tuttavia, come gli astrociti sono un fattore che contribuisce al fenotipo endoteliale delle cellule del cervello, le tre diverse condizioni di cultura rappresentano tre diversi fenotipi delle cellule endoteliali cerebrali. Il modello di NCC è utile soprattutto per gli studi di alcuni meccanismi specializzati coinvolti nella scoperta della droga, gli studi sui trasporti e traffico intracellulare, oltre che per studio delle interazioni cellula-cellula, dove si trova la massima espressione delle caratteristiche BBB vantaggioso.
Origine e storia del protocollo
Il modello pBEC qui descritto si basa sul modello porcino sviluppato presso i laboratori di Eisai (Londra) da Dr. Louise Morgan e colleghi, che è basato su un successo precedenti cervello bovino delle cellule endoteliali modello13. Il metodo originale di preparazione delle cellule è una filtrazione di due fasi utilizzando nylon mesh per catturare i microvasi, seguiti da una fase subculturing per migliorare la purezza. Nello sviluppo del metodo precedente, tenuta ottimale del fenotipo e barriera BBB sono stati raggiunti dalla crescita in mezzo completato, tra cui ACM. Ulteriori modifiche al metodo sono state fatte da R. Skinner nel laboratorio del Prof N. Rothwell in Manchester Regno Unito14,15. Il metodo fu adottato dal laboratorio Abbott, KCL London, dove Patabendige reso significativamente più semplice preparare evitando l'uso di astrociti o ACM ed eliminando le cellule contaminanti quali periciti con con puromicina. Dai primi documenti ha confermato che il modello MC conservato diverse caratteristiche importanti in vivo BBB, tra cui efficace giunzioni strette, sistemi di trasporto di membrana e recettore transcitosi16,17 , 18 , 19 , 20. più tardi S. Yusof nuovamente testato co-coltura del astrocyte e trovato esso migliorato significativamente TEER, quindi questa è la variante preferita attualmente utilizzata nel laboratorio Abbott21. Il modello è stato correttamente trasferiti la Nielsen M. laboratorio a Aarhus, dove ulteriori modifiche sono state introdotte (questo protocollo), tra cui semplificando grigio importa estrazione, utilizzando solo una maglia filtrazione passaggio e un passaggio di rivestimento singolo filtro combinazione di collagene e fibronectina. La procedura applicata per l'isolamento dei astrocytes porcino (questo protocollo) era basata su protocolli sviluppati dal laboratorio T. Moos a Aalborg, descritto da Thomsen et al.22. Il TEER e altre proprietà del modello generato a Londra e Aarhus sono simili, che presta fiducia alla nozione che il modello viene prontamente trasferito tra i laboratori e risponde bene a un'attenta osservazione e la razionalizzazione dei passaggi del metodo. Infatti, S. Yusof ora ha stabilito il modello MC in un paese tropicale (Malesia)23, che ha coinvolto ulteriore adeguamento per le condizioni locali e fonti di tessuto.
Vantaggi rispetto ai metodi alternativi e attualmente stabilito modelli
Rispetto alle cellule endoteliali cerebrali di origine bovina e del roditore, pBECs forniscono il vantaggio di avere un tasso più basso di perdita del fenotipo in vivo BBB dopo isolamento24. Inoltre, sono in grado di formare barriere endoteliali relativamente strette, anche quando coltivate in MC (800 Ω cm2)16 rispetto ai livelli comunemente segnalati per monostrati di linee cellulari quali bEND.5 e bEND.3 (50 Ω cm2) pBECs 25 , 26 , 27, cEND (300-800 Ω cm2)28,29,30e cerebEND (500 Ω cm2)29,31,32e cerebrali primari cellule endoteliali del mouse (100-300 Ω cm2)SS = "xrif" > 33,34,35,36 e ratto (100-300 Ω cm2)37,38. Tuttavia, il TEER ha mostrato dipendenza sulle procedure di purificazione e di cultura. Nella maggior parte dei casi, l'aggiunta di ACM o di co-coltura con i astrocytes Mostra effetti differenziazione le cellule endoteliali e un aumento nella strettezza del endoteliale strati1. Tuttavia, con gli sforzi per ottimizzare le condizioni di coltura, solo i modelli basati su bovini hanno mostrato valori TEER paragonabili ai modelli basati su porcina (medie di 800 Ω cm2 in MC, fino a 2500 Ω cm2 in co-coltura Astrocita)13 ,39,40,41,42,43,44,45. Come i modelli basati su primario cervello bovino cellule endoteliali hanno dimostrato grandi variazioni, sia tra e all'interno di laboratori14,45,46,47,48, riproducibilità potrebbe essere un problema. Nel modello pBEC segnalato qui, i laboratori che contribuisce hanno raggiunto TEER molto simile e valori di permeabilità paracellulare con bassa variabilità sia tra i laboratori che in. Quindi, dovrebbe essere possibile per altri laboratori di stabilire un modello affidabile con bassa variabilità utilizzando il metodo presentato qui. Oltre a formare strati endoteliali stretti, modelli con pBECs precedentemente sono stati convalidati dall'espressione di proteine di giunzione stretta, funzionale BBB trasportatori, recettori ed enzimi e comprovata idoneità per una gamma di studi15 , 16 , 17 , 19 , 20 , 22 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 , 59. Inoltre, inediti transcriptome dati sulle co-culture di pBECs mostrano un profilo previsto dei trasportatori BBB e recettori (risultati non pubblicati, Nielsen et al.).
Il modello BBB porcina basato presenta un ulteriore vantaggio come il genoma, anatomia, fisiologia, e progressione di malattia del maiale riflettono la biologia umana ad un grado più elevato rispetto ad altri modelli stabiliti dispone di60, che sono favorevoli per il industria farmaceutica. Come suini cervelli sono un comune sottoprodotto dell'industria della carne, essi costituiscono una fonte facilmente accessibile del cervello cellule endoteliali, riducendo al minimo il numero di animali necessari per gli esperimenti e fornendo una resa alta purificazione da un cervello porcino. Sebbene la purificazione e la coltivazione di cellule primarie è un po' laborioso e richiede competenze di normalizzazione nella creazione del modello, cellule primarie generare i modelli BBB più affidabili. Linee cellulari immortalizzate non possono essere un sostituto, come proprietà importanti come tenuta di barriera, profili di espressione del trasportatore e regolamento microambiente non riflettono i risultati sperimentali in vivo61, 62. in vitro modelli offrono il vantaggio di vivere-cella delle immagini con risoluzione superiore, rendendo possibile la visualizzazione di processi intracellulari consentendo un approccio di vicinanza alle cellule campionate o osservati, utilizzando obiettivi con ingrandimento maggiore e migliore qualità ottica63. Questo non è il caso per l'uso di microscopia del due-fotone in animali vivi. Inoltre, in vitro modelli offrono la possibilità a transfect cellule, permettendo la visualizzazione di proteine e di indagine dei loro traffici.
Applicazioni del modello
La funzione della BBB non è fisso e può essere modulata in modo dinamico in fisiologia e la patologia. In molte malattie neurologiche, compreso neurodegenerative, infiammatorie e infettive, rottura e aumento della permeabilità della BBB è osservato64,65,66,67 . Al fine di ridurre e prevenire la progressione della malattia e conseguenti danni, identificazione e caratterizzazione dei meccanismi molecolari che sono alla base della modulazione della BBB sono di grande importanza. In questo contesto, affidabile in vitro modelli sono molto richiesti dall'industria farmaceutica e inoltre svolgono i ruoli importanti nel predire la permeabilità BBB di droghe al sistema nervoso centrale. Qualsiasi modello in vitro che serve come uno schermo di permeabilità dovrebbe visualizzare una via paracellulare restrittive, una cellula fisiologicamente realistica architettura ed espressione funzionale del trasportatore meccanismi68. Dimostrato in precedenti studi16,17,57e di permeabilità paracellulare ed espressione delle proteine TJ e AJ qui, il modello presentato soddisfa tutti questi criteri ed è adatto per una gamma di BBB studi in entrambi normale fisiologia e nella patologia. I punti di forza del metodo di purificazione e coltivazione presentato includono una combinazione di semplicità e riproducibilità e la capacità di includere astrocytic influenza con un robusto e affidabile alto TEER in vitro BBB modello risultante. Per questo scopo, gli astrociti di porcino e ratto origine hanno dimostrato di aumentare il fenotipo BBB di pBECs in un modo simile22.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-719F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/Low Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma derived serum (PDS)</td>
			<td>First Link UK Ltd.</td>
			<td>60-00-89</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>10-270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-CPT-cAMP</td>
			<td>Biolog</td>
			<td>C010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RO 20-1724</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B8279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Sulfate</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-518Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20,824,296</td>
			<td>Mix the 70 % solution from the 96 % EtOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse 1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase CLS2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made with Elga System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar Transwell inserts (Cell permeable membrane inserts)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>CLS3401</td>
			<td>12-well plate, 12 mm diameter, 0.4 &#956;m polycarbonate membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml centrifuge tubes</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tubes</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo vials</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>377224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 ml bottle</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>159910/159920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpels</td>
			<td>Swann-Morten</td>
			<td>REF0211</td>
			<td>Type 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue homogenizer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>140 &#956;m filters</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>NY4H04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m filters</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndOhm chamber system</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>ENDOHM-12</td>
			<td>EndOhm chamber for 12mm Culture Cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM2 electrode system</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>300523+STX100C</td>
			<td>TEER measurement system with rigid STX-100C electrode pair</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Long needle</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Attach to a syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tip curved forceps</td>
			<td>KLS Martin</td>
			<td>12-409-12-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Broad tip forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter holder</td>
			<td>MERCK Milipore</td>
			<td>Swinnex-47</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4617509F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SSt20ESI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Occludin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab31721</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-p120 Catenin antibody</td>
			<td>BD Transduction laboratories</td>
			<td>610133</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ZO-1 antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>61-7300</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Claudin 5 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB4502981</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti rabbit IgG conjugated with Alexa Flour 568</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A10042</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti mouse IgG conjugated with Alexa Flour 488</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A21202</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEC100X250UC</td>
			<td>0.15&#181;l/ml final working conc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lucifer Yellow</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0144</td>
			<td>10 &#181;g/ml final working conc</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved method for the establishment of an in vitro blood-brain barrier model based on porcine brain endothelial cells

L'obiettivo di questo protocollo presenta una procedura ottimizzata per la purificazione e la coltivazione di pBECs e di stabilire in vitro barriera ematomeningea (BBB) modelli basati su pBECs in mono-cultura (MC), MC con medium condizionato di astrociti (ACM), e senza contatto co-coltura (NCC) con i astrocytes di suino o ratto origine. pBECs è stato isolato e coltivato da frammenti di vasi capillari dalle cortecce cerebrali di suini domestici 5-6 mesi di età. Questi frammenti sono stati purificati dal rimozione accurata di meningi, isolamento e omogeneizzazione della materia grigia, filtrazione, digestione enzimatica e centrifugazione. Per ridurre ulteriormente le cellule contaminanti, i frammenti capillari sono stati coltivati con contenenti con puromicina medio. Quando 60-95% confluenti, pBECs crescente dai frammenti capillari sono state attraversate per filtro a membrana permeabile inserisce e stabilita nei modelli. Per aumentare la tenuta di barriera e il fenotipo caratteristico BBB di pBECs, le cellule sono state trattate con i seguenti fattori di differenziazione: membrana permeante 8-CPT-cAMP (cAMP qui abbreviato), idrocortisone e un inibitore della fosfodiesterasi, RO-20-1724 (RO). La procedura è stata effettuata in un periodo di 9-11 giorni, e quando si stabilisce il modello di NCC, gli astrociti sono stati coltivati 2-8 settimane in anticipo. L'aderenza alle procedure descritte nel protocollo ha permesso la creazione di strati endoteliali con permeabilità paracellulare molto limitato, con il servizio NCC Mostra una resistenza elettrica media transendoteliale (TEER) 1249 ± 80 Ω cm di modello 2e permeabilità paracellulare (Papp) per Lucifero giallo di 0,90 10-6 ± 0,13 10-6 cm sec-1 (media ± SEM, n = 55). Ulteriore valutazione di questo fenotipo pBEC ha mostrato buona espressione della stretta proteine giunzionali claudin 5, ZO-1, occludina e adherens giunzione proteina p120 catenina. Il modello presentato può essere utilizzato per una serie di studi della BBB nella salute e nella malattia e, con la permeabilità paracellulare altamente restrittive, questo modello è adatto per studi di trasporto e traffico intracellulare.

Stabilimento di BBB In Vitro modelli
Nel metodo presentato, ottimizzato, la coltivazione di pBECs e l'istituzione del sistema di inserimento membrana permeabile con MC o senza ACM o NCC con i astrocytes (Figura 1) è stati effettuati per un periodo di 9-11 giorni (Figura 2). Per la selezione delle cellule endoteliali, una cultura iniziale di frammenti capillare pu...

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Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

Migliorato il metodo per la creazione di un In Vitro barriera emato - encefalica modello basato sulle cellule endoteliali Porcine cervello

L'obiettivo del protocollo è di presentare una procedura ottimizzata per la creazione di un modello in vitro barriera ematomeningea (BBB) basato sulle cellule endoteliali cerebrali primari porcina (pBECs). Il modello mostra un'elevata riproducibilità, alta tenuta ed è adatto per studi di trasporto e traffico intracellulare nella scoperta della droga.

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

The overall goal of this protocol is to purify and isolate primary porcine brain endothelial cells in order to set up a tight in vitro blood-brain barrier model. This method can help answer key questions in the blood-brain barrier field, such as drug delivery, permeability, receptor trafficking, as well as the tightness and polarity of the BB.The main advantage of this model is the high yield of primary brain endothelial cells that can be used to create an in vitro blood-brain barrier model which has high TEER and low permeability. To begin this procedure, place the brains in a sterile flow bench and gently wash them with one liter of PBS in a beaker placed on ice.Next, carefully remove the meninges from each brain using fine-tip forceps. Using a scalpel, scrape off gray matter from the brains one at at time and transfer the isolated material to Petri dishes containing 20 milliliters of DMEM/F-12 placed on ice. For initial fragmentation, run the gray matter material through a 50-milliliter syringe without the needle.Repeat the procedure for all brains and pool the collected gray matter material together. Transfer the isolated gray matter material with DMEM/F-12 medium to the grinder tube of a handheld tissue homogenizer. Homogenize the material by making eight up-and-down strokes with a loose pestle, followed by eight up-and-down strokes with a tight pestle.Next, isolate the capillaries by filtering the homogenate using a 500-milliliter blue cap bottle with filter holder and 140-micron filter mesh. Place the capillary-containing filters in Petri dishes with a digestion solution. Subsequently, incubate the Petri dishes at 37 degrees Celsius for one hour on an orbital shaker at 180 RPM, or stir them gently every 10 minutes.After one hour, wash off the capillaries from the filters with suspension from the Petri dish. Then, split the suspension from the three dishes into two 50-milliliter tubes and stop the digestion by adding 10 milliliters of DMEM/F-12 to each 50-milliliter tube. Centrifuge the cell suspensions at 250 times g, four degrees Celsius for five minutes.Afterward, aspirate the supernatants and resuspend each pellet in 10 milliliters of DMEM/F-12. Then, add a further 20 milliliters of DMEM/F-12 to each tube. To optimize the conditions for the attachment of PBECs, add coating solution to the T-75 flask, resulting in the final concentrations of collagen four at 150 micrograms per milliliter and fibronectin at 50 micrograms per milliliter and by distilled water, making sure that the solution covers the whole surface.Next, thaw the capillaries in a 37-degree Celsius water bath. To remove freezing medium, spin the capillaries down at 250 times g, four degrees Celsius, for seven minutes. After that, carefully aspirate the supernatant and resuspend the pellet in one to two milliliters of the 10-milliliter aliquot.Following that, transfer the capillary suspension to the coated T-75 flask, and gently tilt the flask to ensure equal distribution over the surface. Place the T-75 flask at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide. After overnight incubation, prepare 10 milliliters of PBEC growth medium, supplemented with puromycin at four micrograms per milliliter for one T-75 flask and perform a medium change.Then, prepare the permeable membrane inserts for PBEC seeding by coating them with collagen IV at 500 micrograms per milliliter, and fibronectin at 100 micrograms per milliliter, and by distilled water. Trypsin-ize the cells by adding two milliliters of trypsin-EDTA solution to the T-75 flask, and place it at 37 degrees Celsius, 5%carbon dioxide, for five to seven minutes. To detach the brain endothelial cells, gently tap the side of the T-75 flask with fingertips.Subsequently, transfer the cell solution to a 15-milliliter tube, and spin down the brain endothelial cells by centrifugation at 250 times g, four degrees Celsius, for seven minutes. Afterward, carefully remove the supernatant, and resuspend the pellet in one milliliter of medium. Then, add a further two milliliters of medium to bring the total volume to three milliliters.Count the number of cells manually using a cell-counting chamber or an automatic cell-counting system. For non-contact coculture, transfer inserts to the wells that have astrocytes, which were refreshed with astrocyte growth medium the day before. The next day, replace the medium on the permeable membrane inserts containing PBECs.Then, carefully aspirate the medium from the wells and add 750 microliters of differentiation medium to each well. Following that, carefully aspirate medium from the inserts and add 500 microliters of differentiation medium per insert. Then, add the remaining 750 microliters of differentiation medium to each astrocyte well.After that, incubate the cells with differentiation medium at 37 degrees Celsius, 5%carbon dioxide, until the next day. On the day after stimulating the cells with differentiation medium, prepare the tissue-resistance measurement chamber system for TEER measurements by rinsing the chamber two times with bi-distilled water, one time with 70%ethanol for five minutes and two more times with bi-distilled water. Next, connect the chamber to the system, add four milliliters of DMEM/F-12 to the tissue-resistance measurement chamber, and let it stay at room temperature for approximately 30 minutes.After that, perform TEER measurements by carefully placing the inserts in the tissue-resistance measurement chamber. Here are the phase phase-contrast microscopy images of PBECs, cultures, and astrocytes viewed over five days. Purified capillary fragments on the first day of the initial culture showed presence of both capillaries and contaminating cells, which after medium change on day two and an additional day of growth, showed selection for PBECs, starting their growth from the capillary fragments.Confluent monolayers of PBECs were usually achieved on day four through six, at which time PBECs showed spindle-shaped morphology and were longitudinally-aligned. Rat astrocytes seeded in the bottom wells normally proliferated to confluent layers within five days, and were used for non-contact coculture models after two weeks of growth. Once mastered, this technique can be done in seven hours.After its development, this technique paved the way for researchers to explore drug delivery and receptor trafficking in tight and polarized brain endothelial cells. After watching this video, you should have a good understanding how to create an in vitro blood-brain barrier model that can be used for new studies that cannot carry out in vivo.

Research

JoVE Journal

Medicine

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MRI-guidato Interruzione della barriera emato-encefalica transcranica con ultrasuoni focalizzati in un modello murino

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Ricerca

Medicina

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Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Stretch in microvascolari cerebrali cellule endoteliali (CEND) come<em&gt; In Vitro</em&gt; Trauma cranico modello della barriera ematoencefalica

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

Istituzione di un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello di Rat barriera emato-encefalica (BBB): A Focus on BBB impermeabilità e Trasporti recettore-mediata

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Eccitotossica stimolazione del cervello Microslices come<em&gt; In vitro</em&gt; Modello di Corsa

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

L&#39;ossigeno-glucosio Deprivazione e riossigenazione come<em&gt; In Vitro</em&gt; Ischemia-riperfusione Injury modello per lo studio barriera sanguigna del cervello Erettile

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

Un metodo migliore per Rapid intubazione della trachea nei topi

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

An Anesthesia, Surgery, and Harvest Method for the Evaluation of Transpedicular Screws Using an In Vivo Porcine Lumbar Spine Model

An Anesthesia, Surgery, and Harvest Method for the Evaluation of Transpedicular Screws Using an In Vivo Porcine Lumbar Spine Model

Anestesia, chirurgia e metodo di raccolta per la valutazione delle viti transpedicolari utilizzando un<em&gt; In Vivo</em&gt; Modello della colonna vertebrale della deriva

Pedicle screw fixation is the gold standard for the treatment of spinal diseases. However, many studies have reported the issue of loosening pedicle ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

preparazione e<em&gt; In Vitro</em&gt; Caratterizzazione di magnetizzato miR-modificato cellule endoteliali

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

In vitro dosaggi per valutare la formazione e la rottura del vaso come la barriera emato-cerebrale

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...