Name: improved method for the establishment of an in vitro blood-brain barrier model based on porcine brain endothelial cells
Uploaded: 2017-09-24T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells at JoVE.com

Forfatterne ønsker å erkjenne Elisabeth Helena Bruun, Sarah Christine Christensen og Niels M. Kristiansen for teknisk assistanse, og Lundbeck grunnlaget gi nummer R155-2013-14113.

svin hjernen ble innhentet som biprodukter av danske næringsmiddelindustrien. Danske slakterier er under strengt oppsyn og observasjon av danske Miljøverndepartementet og mat.
 rotter brukes for isolering av astrocyttene ble avlet og gruppe plassert i lokale dyr anlegget ved en omgivelsestemperatur på 22 ° C - 23 ° C og en 12/12 h mørke/lys syklus under inspeksjon av veterinær og ifølge dansk regler for lab dyr. Rotter var euthanized før de ble ofret i samsvar med internasjonale retn...

Rensing og spredning av pBEC
Under den rensing prosedyren er avgjørende skritt rask og effektiv fjerning av meninges og separasjon av hvite og grå materie, som er viktig for rensing avkastning og renhet og for riktig etableringen av modellen. Presentert i vitro BBB modellen med pBECs, har vi forbedret og forenklet en rensing prosedyren basert på mekanisk homogenisering av isolerte grå materie, størrelse-selektiv filtrering for isolering av microvessels, fordøyelsen med collagenase ...

Mobilnettet strukturen og funksjonen til blod - hjerne barrieren
På grensesnittet av sirkulasjons og sentrale nervesystemet (CNS) fungerer BBB som viktige forskrifter nettsted for homoeostatic kontroll over CNS-microenvironment som er avgjørende for riktig funksjon og beskyttelse av nervesystemet. Stedet for BBB er endotelceller foring på blod fartøy lumen. I hjerne blodkar, endotelceller form komplekse intercellulære stramt veikryss og sterkt polarisert uttrykk mønstre av bestemt tilstrømningen og middelklasseinnbyggere transportører sikre svært spesifikke molekylær transport mellom blod og hjernen 1. Strukturelle komponenter i tett krysset komplekser inkluderer proteiner fra occludin og claudin, zonula occludens (ZO) proteiner, cingulin og tilknyttede junctional vedheft molekyler (syltetøy). Claudin 5 er spesielt viktig i paracellular junctional begrensning. Induksjon og vedlikehold av denne karakteristiske BBB endothelial fenotypen involverer dynamisk samspill med omkringliggende celler, inkludert pericytes, astrocyttene, nerveceller og kjelleren membraner, som sammen med hjernen endothelial celler skjemaet i nevrovaskulære enhet (NVU)2,3. Mekanismene som er involvert i disse samhandlingene er ennå ikke fullt ut forstått, men inkluderer utveksling av kjemiske signaler mellom cellene, som tillater modulering av BBB permeabilitet på kort sikt og induserer langsiktige BBB funksjoner4. Astrocyttene spesielt er kjent for å bidra til hjernen endothelial celle fenotypen og er en kilde til regulatoriske forhold som glial-avledet nevrotropisk faktor (påvirke intracellulær leiren)5, grunnleggende fibroblast vekstfaktor6, Hydrocortisone7og transformere vekstfaktor β (TGF-β)8. Effekten av TGF-β, men har vært omdiskutert9.
Fra i Vivo In Vitro BBB
I vivo studier fortsette å gi verdifull informasjon om BBB biologi. Men kan cellen kultur modeller gi ytterligere innsikt og utgjør nyttige verktøy for å forstå detaljert molekylære og funksjonelle aspekter av BBB i både helse og sykdom. Selv om de komplekse interaksjonene mellom celletyper og bestanddeler av BBB er vanskelig å fullt oppnå i vitro modeller, har det vært, siden første rensing av hjernen endotelceller og anvendelse av disse i mono-kulturer 10 , 11 , 12, av rensing prosedyrer og vekst ansettelsesbetingelser BBB celle kultur modeller, som resulterer i større likhet med Gaspar i vivo barrieren. De brukte i vitro BBB modellene er basert på primær celler gnager, svin og bovin opprinnelse og udødeliggjort linjer. Hver modell har forskjellige fordeler og ulemper. For sammenligning og modell valg brukes validering markører som uttrykk for BBB enzymer, transportører, reseptorer og strukturelle proteiner til å opprette oversikter av gjeldende etablerte modeller1.
Formålet med protokollen
En viktig funksjon i BBB er barriere tetthet og høy TEER, men mange av de tilgjengelige modellene reflekterer ikke godt i vivo nivåene. Innlemme utvikling og optimalisering bidrag fra flere laboratorier, er målet med denne protokollen å presentere en metode for å opprette en høy TEER i vitro BBB modell basert på primære pBECs MC med eller uten ACM eller NCC med primær astrocyttene rotte eller svin opprinnelse. Anvendt prosedyrer og etableringen av modellen inkluderer innsats å eliminere skadelige celler og forbedre differensiering av pBECs i en BBB fenotypen. Dette arbeidet har resultert i etableringen av pålitelig, høy TEER modeller med lav paracellular permeabilitet og god funksjonelle uttrykk for viktige stram junctional proteiner, transportører og reseptorer. Men som astrocyttene er en medvirkende faktor til hjernen endothelial celle fenotypen, representerer i tre ulike betingelser kultur tre Norge av hjernen endotelceller. NCC modellen er spesielt nyttig for studier av enkelte spesialiserte mekanismer involvert i stoffet funnet, transport studier og intracellulær menneskehandel, og etterforskning av celle-celle interaksjoner der maksimal uttrykk BBB funksjoner er fordelaktig.
Opprinnelsen og historien til protokollen
Den pBEC modellen beskrevet her er hovedsakelig basert på porcine modell utviklet ved Eisai Laboratories (London) av Dr. Louise Morgan og kolleger, whichis basert på en vellykket tidligere bovin hjernen endothelial celle modell13. Den opprinnelige metoden celle forberedelser var en to-trinns filtrering bruker nylon maskene for å fange microvessels, etterfulgt av et subculturing skritt for å forbedre renhet. I tidligere utvikling av metoden, optimal BBB fenotypen og barriere tetthet ble oppnådd ved vekst i supplert medium, inkludert ACM. Ytterligere modifiseringer å metoden ble gjort av R. Skinner i Prof N. Rothwell lab i Manchester UK14,15. Metoden ble innført av Abbott laboratoriet, KCL London, hvor Patabendige gjorde det betraktelig enklere å forberede ved å unngå bruk av astrocyttene eller ACM og eliminere skadelige celler som pericytes med puromycin. Første avisene bekreftet at MC modellen bevart flere viktige funksjoner av i vivo BBB, inkludert effektive stramt veikryss, membran transportsystemer og reseptor-mediert transcytosis16,17 , 18 , 19 , 20. senere S. komme igjen testet astrocytter co kultur og funnet det forbedret TEER, så dette er den foretrukne varianten som brukes i Abbott lab21. Modellen har nå blitt overført til M. Nielsen lab i Århus, hvor ytterligere modifiseringer ha blitt introdusert (dette protocol), inkludert forenkle grå rolle utvinning, bruker bare ett nett filtrering trinn, og en enkelt filter belegg kombinere kollagen og fibronectin. Bruk fremgangsmåten for isolering av svin astrocyttene (denne protokollen) var basert på protokoller utviklet av T. Moos laboratoriet i Aalborg, beskrevet av Thomsen et al22. TEER og andre egenskaper for modellen generert i London og Århus er lik, som gir tillit til forestillingen om at modellen er lett overføres mellom laboratorier og svarer godt til forsiktig observasjon og rasjonalisere trinn. Faktisk, S. PPLive nå etablert MC-modell i et tropisk land (Malaysia)23, som involverte ytterligere justering for lokal betingelser og vev kilder.
Fordelene over alternativ metoder og nå etablert modeller
PBECs sammenlignet med hjernen endotelceller av storfe og gnager opprinnelse, og gir fordelen av å ha en lavere pris for tap av i vivo BBB fenotypen etter isolasjon24. Videre er pBECs stand til å danne relativt stramt endothelial barrierer, selv når dyrket i MC (800 Ω cm2)16 sammenlignet med vanlig rapporterte nivåene for monolayers av cellelinjer som bEND.5 og bEND.3 (50 Ω cm2) 25 , 26 , 27, ende (300-800 Ω cm2)28,29,30, og cerebEND (500 Ω cm2)29,31,32og primære hjernen endotelceller mus (100-300 Ω cm2)ss = "xref" > 33,34,35,36 og rotten (100-300 Ω cm2)37,38. TEER har imidlertid vist avhengighet på rensing og kultur prosedyrene. I de fleste tilfeller viser tillegg av ACM eller co kultur med astrocyttene unike effekter på endotelceller og en økning i tetthet av endothelial lag1. Likevel med arbeid med å optimalisere culturing forholdene, bare storfe-baserte modeller har vist TEER verdier sammenlignes med svin-baserte modeller (gjennomsnitt 800 Ω cm2 i MC, opp til 2500 Ω cm2 i astrocytter co kultur)13 ,39,40,41,42,43,44,45. Som modeller basert på primære bovin hjernen har endotelceller vist store variasjoner, både mellom og innenfor laboratorier14,45,46,47,48, reproduserbarhet kan være et problem. I pBEC modell rapporterte her, har bidrar laboratoriene oppnådd svært lik TEER og paracellular permeabilitet verdier med lav variasjon, både i og mellom laboratorier. Derfor bør det være mulig for andre laboratorier for å etablere en robust modell med lave variasjon med metoden presenteres her. I tillegg danner stramt endothelial lag, har modeller med pBECs tidligere blitt godkjent av uttrykk for tett krysset proteiner, funksjonelle BBB transportører, reseptorer og enzymer og demonstrerte egnethet for en rekke studier15 , 16 , 17 , 19 , 20 , 22 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 , 59. videre upubliserte transcriptome data på co kulturer av pBECs viser en forventet profil av BBB transportører og reseptorer (upubliserte resultater, Nielsen et al.).
Den svin-baserte BBB modellen har flere fordeler som genom, anatomi, fysiologi, og sykdomsprogresjon av grisen gjenspeile menneskets biologi i større grad enn andre etablerte modeller har60, som er gunstig for den farmasøytisk industri. Som svin hjernen er et vanlig biprodukt av kjøttet industrien, utgjør de en lett tilgjengelig kilde til hjernen endotelceller, minimere antall dyr trengte eksperimenter, og gir en høy rensing avkastning fra én svin hjerne. Selv om rensing og dyrking av primære celler er litt tidkrevende og krever kompetanse for standardisering i å sette opp modellen, generere primære celler mest pålitelige BBB modellene. Udødeliggjort cellelinjer kan ikke være en erstatning, som viktige egenskaper som barriere tetthet, transporter uttrykket profiler og microenvironment regulering ikke reflekterer eksperimentelle resultatene i vivo61, 62. in vitro modeller gir fordelen av live-celle tenkelig med høyere oppløsning, gjør visualisering av intracellulær prosesser mulig ved at en nærhet tilnærming til samplet eller observert cellene, bruker mål med høyere forstørrelse og bedre optisk kvalitet63. Dette er ikke tilfelle for bruk av to-fotonet mikroskopi i levende dyr. Videre gir i vitro modeller muligheten til å transfect celler, slik at visualisering av merket proteiner og undersøkelse av deres handel.
Anvendelser av modellen
Funksjonen til BBB er ikke fast, og kan være dynamisk modulert både fysiologi og patologi. I mange nevrologiske sykdommer, inkludert nevrodegenerative, er provoserende og smittsomme sykdommer, avbrudd og økt permeabilitet av BBB observert64,65,66,67 . For å redusere og forebygge sykdomsprogresjon og påfølgende skade, er identifikasjon og karakterisering av molekylære mekanismer underliggende modulering av BBB av stor betydning. I denne sammenheng, pålitelig i vitro modeller er i høy etterspørsel av legemiddelindustrien, og videre spille viktige roller i å forutsi BBB permeabilitet av narkotika til CNS. Noen i vitro modell som en permeabilitet skjerm skal vise en restriktiv paracellular sti, fysiologisk realistisk celle arkitektur og funksjonelle uttrykk for transporter mekanismer68. Vist i tidligere studier16,17,57og paracellular permeabilitet og uttrykk for TJ og AJ proteiner her, presentert modellen oppfyller alle disse kriteriene og er egnet for en rekke av BBB studier i både normale fysiologi og patologi. Styrke av presentert rensing og dyrking metoden er en kombinasjon av enkelhet og reproduserbarhet og evnen å inkludere astrocytic innflytelse med resulterende robust og pålitelig høy TEER i vitro BBB modell. For dette formål, astrocyttene av svin og rotte opprinnelse har vist seg å øke BBB fenotypen av pBECs i en lignende måte22.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-719F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/Low Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma derived serum (PDS)</td>
			<td>First Link UK Ltd.</td>
			<td>60-00-89</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>10-270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-CPT-cAMP</td>
			<td>Biolog</td>
			<td>C010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RO 20-1724</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B8279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Sulfate</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-518Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20,824,296</td>
			<td>Mix the 70 % solution from the 96 % EtOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse 1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase CLS2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made with Elga System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar Transwell inserts (Cell permeable membrane inserts)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>CLS3401</td>
			<td>12-well plate, 12 mm diameter, 0.4 &#956;m polycarbonate membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml centrifuge tubes</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tubes</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo vials</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>377224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 ml bottle</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>159910/159920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpels</td>
			<td>Swann-Morten</td>
			<td>REF0211</td>
			<td>Type 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue homogenizer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>140 &#956;m filters</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>NY4H04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m filters</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndOhm chamber system</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>ENDOHM-12</td>
			<td>EndOhm chamber for 12mm Culture Cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM2 electrode system</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>300523+STX100C</td>
			<td>TEER measurement system with rigid STX-100C electrode pair</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Long needle</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Attach to a syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tip curved forceps</td>
			<td>KLS Martin</td>
			<td>12-409-12-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Broad tip forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter holder</td>
			<td>MERCK Milipore</td>
			<td>Swinnex-47</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4617509F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SSt20ESI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Occludin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab31721</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-p120 Catenin antibody</td>
			<td>BD Transduction laboratories</td>
			<td>610133</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ZO-1 antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>61-7300</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Claudin 5 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB4502981</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti rabbit IgG conjugated with Alexa Flour 568</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A10042</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti mouse IgG conjugated with Alexa Flour 488</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A21202</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEC100X250UC</td>
			<td>0.15&#181;l/ml final working conc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lucifer Yellow</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0144</td>
			<td>10 &#181;g/ml final working conc</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved method for the establishment of an in vitro blood-brain barrier model based on porcine brain endothelial cells

Målet med denne protokollen presenterer en optimalisert prosedyre for rensing og dyrking av pBECs og i vitro blod - hjerne barrieren (BBB) modeller basert på pBECs i mono-kultur (MC), MC med astrocytter-conditioned medium (ACM), og ikke-kontakt co kultur (NCC) med astrocyttene av svin eller rotte opprinnelse. pBECs ble isolert og kultivert fra fragmenter av kapillærer fra hjernen halvdelene av innenlandske griser 5-6 måneder gammel. Disse fragmentene ble renset ved forsiktig fjerning av meninges, isolasjon og homogenisering av grå materie, filtrering, enzymatisk fordøyelsen og sentrifugering. For å ytterligere eliminere skadelige celler, kapillære fragmenter ble kultivert med puromycin som inneholder mediet. Når 60-95% confluent, pBECs fra kapillær fragmenter ble passaged til gjennomtrengelig membran filter setter inn og etablerte modeller. For å øke barriere tetthet og BBB karakteristiske fenotypen av pBECs, cellene ble behandlet med følgende differensiering faktorer: membran permeant 8-CPT-cAMP (her forkortet cAMP), hydrocortisone og en fosfodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). Prosedyren ble utført over en periode på 9-11 dager, og når etablerende NCC modellen, astrocyttene ble kultivert 2-8 uker i forveien. Overholdelse av beskrevet prosedyrene i protokollen har tillatt etableringen av endothelial lag med svært begrenset paracellular permeabilitet, med NCC modell viser en gjennomsnittet transendothelial motstand (TEER) 1249 ± 80 Ω cm 2, og paracellular permeabilitet (Papp) for Lucifer gule av 0,90 10-6 ± 0,13 10-6 cm sek-1 (mener ± SEM, n = 55). Videre evaluering av denne pBEC fenotypen viste godt uttrykk for tett junctional proteiner claudin 5, ZO-1, occludin og adherens krysset protein p120 catenin. Modellen presentert kan brukes for en rekke studier av BBB i helse og sykdom, og med svært restriktive paracellular permeabilitet, denne modellen er egnet for studier av transport og intracellulær menneskehandel.

Etablering av BBB In Vitro modeller
I metoden presentert, optimalisert ble dyrking av pBECs og etablering av gjennomtrengelig membran sett inn systemet med MC eller uten ACM eller NCC med astrocyttene (figur 1) gjennomført i en periode på 9-11 dager (figur 2). Utvalg av endotelceller, en innledende kultur av renset kapillær fragmenter ble kombinert med puromyci...

Watch this Scientific Journal Video about Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells at JoVE.com

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

Forbedret metoden for etablering av en In Vitro blod - hjerne barrieren modell basert på svin hjernen endotelceller

Målet med protokollen er å presentere en optimalisert prosedyre for etablering av en i vitro blod - hjerne barrieren (BBB) modell basert på primære svin hjernen endotelceller (pBECs). Modellen viser høy reproduserbarhet, høy tetthet, og er egnet for studier av transport og intracellulær menneskehandel i stoffet funnet.

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

The overall goal of this protocol is to purify and isolate primary porcine brain endothelial cells in order to set up a tight in vitro blood-brain barrier model. This method can help answer key questions in the blood-brain barrier field, such as drug delivery, permeability, receptor trafficking, as well as the tightness and polarity of the BB.The main advantage of this model is the high yield of primary brain endothelial cells that can be used to create an in vitro blood-brain barrier model which has high TEER and low permeability. To begin this procedure, place the brains in a sterile flow bench and gently wash them with one liter of PBS in a beaker placed on ice.Next, carefully remove the meninges from each brain using fine-tip forceps. Using a scalpel, scrape off gray matter from the brains one at at time and transfer the isolated material to Petri dishes containing 20 milliliters of DMEM/F-12 placed on ice. For initial fragmentation, run the gray matter material through a 50-milliliter syringe without the needle.Repeat the procedure for all brains and pool the collected gray matter material together. Transfer the isolated gray matter material with DMEM/F-12 medium to the grinder tube of a handheld tissue homogenizer. Homogenize the material by making eight up-and-down strokes with a loose pestle, followed by eight up-and-down strokes with a tight pestle.Next, isolate the capillaries by filtering the homogenate using a 500-milliliter blue cap bottle with filter holder and 140-micron filter mesh. Place the capillary-containing filters in Petri dishes with a digestion solution. Subsequently, incubate the Petri dishes at 37 degrees Celsius for one hour on an orbital shaker at 180 RPM, or stir them gently every 10 minutes.After one hour, wash off the capillaries from the filters with suspension from the Petri dish. Then, split the suspension from the three dishes into two 50-milliliter tubes and stop the digestion by adding 10 milliliters of DMEM/F-12 to each 50-milliliter tube. Centrifuge the cell suspensions at 250 times g, four degrees Celsius for five minutes.Afterward, aspirate the supernatants and resuspend each pellet in 10 milliliters of DMEM/F-12. Then, add a further 20 milliliters of DMEM/F-12 to each tube. To optimize the conditions for the attachment of PBECs, add coating solution to the T-75 flask, resulting in the final concentrations of collagen four at 150 micrograms per milliliter and fibronectin at 50 micrograms per milliliter and by distilled water, making sure that the solution covers the whole surface.Next, thaw the capillaries in a 37-degree Celsius water bath. To remove freezing medium, spin the capillaries down at 250 times g, four degrees Celsius, for seven minutes. After that, carefully aspirate the supernatant and resuspend the pellet in one to two milliliters of the 10-milliliter aliquot.Following that, transfer the capillary suspension to the coated T-75 flask, and gently tilt the flask to ensure equal distribution over the surface. Place the T-75 flask at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide. After overnight incubation, prepare 10 milliliters of PBEC growth medium, supplemented with puromycin at four micrograms per milliliter for one T-75 flask and perform a medium change.Then, prepare the permeable membrane inserts for PBEC seeding by coating them with collagen IV at 500 micrograms per milliliter, and fibronectin at 100 micrograms per milliliter, and by distilled water. Trypsin-ize the cells by adding two milliliters of trypsin-EDTA solution to the T-75 flask, and place it at 37 degrees Celsius, 5%carbon dioxide, for five to seven minutes. To detach the brain endothelial cells, gently tap the side of the T-75 flask with fingertips.Subsequently, transfer the cell solution to a 15-milliliter tube, and spin down the brain endothelial cells by centrifugation at 250 times g, four degrees Celsius, for seven minutes. Afterward, carefully remove the supernatant, and resuspend the pellet in one milliliter of medium. Then, add a further two milliliters of medium to bring the total volume to three milliliters.Count the number of cells manually using a cell-counting chamber or an automatic cell-counting system. For non-contact coculture, transfer inserts to the wells that have astrocytes, which were refreshed with astrocyte growth medium the day before. The next day, replace the medium on the permeable membrane inserts containing PBECs.Then, carefully aspirate the medium from the wells and add 750 microliters of differentiation medium to each well. Following that, carefully aspirate medium from the inserts and add 500 microliters of differentiation medium per insert. Then, add the remaining 750 microliters of differentiation medium to each astrocyte well.After that, incubate the cells with differentiation medium at 37 degrees Celsius, 5%carbon dioxide, until the next day. On the day after stimulating the cells with differentiation medium, prepare the tissue-resistance measurement chamber system for TEER measurements by rinsing the chamber two times with bi-distilled water, one time with 70%ethanol for five minutes and two more times with bi-distilled water. Next, connect the chamber to the system, add four milliliters of DMEM/F-12 to the tissue-resistance measurement chamber, and let it stay at room temperature for approximately 30 minutes.After that, perform TEER measurements by carefully placing the inserts in the tissue-resistance measurement chamber. Here are the phase phase-contrast microscopy images of PBECs, cultures, and astrocytes viewed over five days. Purified capillary fragments on the first day of the initial culture showed presence of both capillaries and contaminating cells, which after medium change on day two and an additional day of growth, showed selection for PBECs, starting their growth from the capillary fragments.Confluent monolayers of PBECs were usually achieved on day four through six, at which time PBECs showed spindle-shaped morphology and were longitudinally-aligned. Rat astrocytes seeded in the bottom wells normally proliferated to confluent layers within five days, and were used for non-contact coculture models after two weeks of growth. Once mastered, this technique can be done in seven hours.After its development, this technique paved the way for researchers to explore drug delivery and receptor trafficking in tight and polarized brain endothelial cells. After watching this video, you should have a good understanding how to create an in vitro blood-brain barrier model that can be used for new studies that cannot carry out in vivo.

Research

JoVE Journal

Medicine

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

MRI-guided Disruption of the Blood-brain Barrier using Transcranial Focused Ultrasound in a Rat Model

MR-veiledet Forstyrrelse av blod-hjerne-barrieren ved hjelp Transkraniell fokusert ultralyd i en rotte Model

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a ...

Rat Model of Blood-brain Barrier Disruption to Allow Targeted Neurovascular Therapeutics

Rotte modell av blod-hjerne barrieren avbrudd i Tillat Målrettet nevrovaskulære Therapeutics

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain ...

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Strekk i Brain mikrovaskulær endotelceller (cend) som en<em&gt; In Vitro</em&gt; Traumatic Brain Injury Modell av blod-hjerne barrieren

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

Sette opp en<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell av Rat blod-hjerne barrieren (BBB): Et fokus på BBB Ugjennomtrengelighet og Receptor-mediert transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Eksitotoksiske Stimulering av Hjerne Microslices som en<em&gt; In vitro</em&gt; Modell av Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Oxygen-Glukose deprivasjon og reoksygenering som en<em&gt; In Vitro</em&gt; Iskemi-reperfusjonskade modell for å studere blod-hjernebarrieren Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

En forbedret fremgangsmåte for Rapid intubering av trakea hos mus

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

An Anesthesia, Surgery, and Harvest Method for the Evaluation of Transpedicular Screws Using an In Vivo Porcine Lumbar Spine Model

An Anesthesia, Surgery, and Harvest Method for the Evaluation of Transpedicular Screws Using an In Vivo Porcine Lumbar Spine Model

En bedøvelses-, kirurgisk og høstmetode for evaluering av transpedikulære skruer ved hjelp av en<em&gt; In vivo</em&gt; Porcine Lumbar Spine Model

Pedicle screw fixation is the gold standard for the treatment of spinal diseases. However, many studies have reported the issue of loosening pedicle ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Fremstilling og<em&gt; In Vitro</em&gt; Karakterisering av magnetisert mir-modifisert endotelceller

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

I Vitro- analyser for å vurdere blod-hjernebarriere Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...