Name: personalized peptide arrays for detection of hla alloantibodies in organ transplantation
Uploaded: 2017-09-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation at JoVE.com

ونحن نشكر الدكتور شون لي ولي شينغ من جامعة ويسترن في كندا على مساعدتهم الطيبة مع بقعة صفيف الإنتاج. ونحن ممتنون للموظفين في "صلب هيستوكومباتيبيليتي" وفي جامعة "شاملة زرع مركز من شمال غرب" لتوفير خدمات عينة. تم دعم هذا العمل جزئيا "المجلس مساعدة من المستشفى التذكاري شمال غربي البلاد"، وصندوقا لبدء تشغيل كلية المقدمة من جامعة نورث وسترن لشئون.

جميع الأساليب الموصوفة هنا أقرها "مجلس جامعة شمال غربي الاستعراض المؤسسي" (بروتوكول الاتحاد الدولي للرجبى #: STU00104680). سير العمل الإجمالي للبروتوكول ويتضح في الشكل 1-
 1-تحليل بيوينفورماتيك للبلدان المانحة والمتلقية هلا متواليات <ol><li>استرداد تسلسل من قاعدة البيانات ...

<ol>
	<li>Bradshaw, R. A., Dunn, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unambiguous+high+resolution+genotyping+of+human+leukocyte+antigens.">Unambiguous high resolution genotyping of human leukocyte antigens.</a> J Immunol Methods. , (2017).</li><li>Robinson, J., Halliwell, J. A., McWilliam, H., Lopez, R., Marsh, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IPD--the+Immuno+Polymorphism+Database.">IPD--the Immuno Polymorphism Database.</a> Nucleic Acids Res. 41, D1234-D1240 (2013).</li><li>Tait, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid+phase+assays+for+HLA+antibody+detection+in+clinical+transplantation.">Solid phase assays for HLA antibody detection in clinical transplantation.</a> Curr Opin Immunol. 21 (5), 573-577 (2009).</li><li>Tait, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+HLA+Antibodies+in+Organ+Transplant+Recipients+-+Triumphs+and+Challenges+of+the+Solid+Phase+Bead+Assay.">Detection of HLA Antibodies in Organ Transplant Recipients - Triumphs and Challenges of the Solid Phase Bead Assay.</a> Front Immunol. 7, 570 (2016).</li><li>Gebel, H. M., Bray, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA+antibody+detection+with+solid+phase+assays:+great+expectations+or+expectations+too+great?.">HLA antibody detection with solid phase assays: great expectations or expectations too great?.</a> Am J Transplant. 14 (9), 1964-1975 (2014).</li><li>Horton, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+map+of+the+extended+human+MHC.">Gene map of the extended human MHC.</a> Nat Rev Genet. 5 (12), 889-899 (2004).</li><li>Duquesnoy, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLAMatchmaker:+a+molecularly+based+algorithm+for+histocompatibility+determination+I.+Description+of+the+algorithm.">HLAMatchmaker: a molecularly based algorithm for histocompatibility determination I. Description of the algorithm.</a> Hum Immunol. 63 (5), 339-352 (2002).</li><li>Duquesnoy, R. J., Marrari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLAMatchmaker-based+definition+of+structural+human+leukocyte+antigen+epitopes+detected+by+alloantibodies.">HLAMatchmaker-based definition of structural human leukocyte antigen epitopes detected by alloantibodies.</a> Curr Opin Organ Transplant. 14 (4), 403-409 (2009).</li><li>Wedel, J., Bruneau, S., Kochupurakkal, N., Boneschansker, L., Briscoe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+allograft+rejection:+a+fresh+look.">Chronic allograft rejection: a fresh look.</a> Curr Opin Organ Transplant. 20 (1), 13-20 (2015).</li><li>Rostaing, L. P., Malvezzi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA-Incompatible+Kidney+Transplantation--Worth+the+Risk?.">HLA-Incompatible Kidney Transplantation--Worth the Risk?.</a> N Engl J Med. 374 (10), 982-984 (2016).</li><li>Gebel, H. M., Bray, R. A., Nickerson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-transplant+assessment+of+donor-reactive,+HLA-specific+antibodies+in+renal+transplantation:+contraindication+vs.+risk.">Pre-transplant assessment of donor-reactive, HLA-specific antibodies in renal transplantation: contraindication vs. risk.</a> Am J Transplant. 3 (12), 1488-1500 (2003).</li><li>Haas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+updated+Banff+schema+for+diagnosis+of+antibody-mediated+rejection+in+renal+allografts.">An updated Banff schema for diagnosis of antibody-mediated rejection in renal allografts.</a> Curr Opin Organ Transplant. 19 (3), 315-322 (2014).</li><li>Cecka, J. M., Reed, E. F., Zachary, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA+high-resolution+typing+for+sensitized+patients:+a+solution+in+search+of+a+problem?.">HLA high-resolution typing for sensitized patients: a solution in search of a problem?.</a> Am J Transplant. 15 (4), 855-856 (2015).</li><li>Tambur, A. R., Claas, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA+epitopes+as+viewed+by+antibodies:+what+is+it+all+about?.">HLA epitopes as viewed by antibodies: what is it all about?.</a> Am J Transplant. 15 (5), 1148-1154 (2015).</li><li>Robinson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IPD+and+IMGT/HLA+database:+allele+variant+databases.">The IPD and IMGT/HLA database: allele variant databases.</a> Nucleic Acids Res. 43, D423-D431 (2015).</li><li>Gabriel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA+typing+by+next-generation+sequencing+-+getting+closer+to+reality.">HLA typing by next-generation sequencing - getting closer to reality.</a> Tissue Antigens. 83 (2), 65-75 (2014).</li><li>Liu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Method+for+Anti-HLA+Antibody+Detection+Using+Personalized+Peptide+Arrays.">A Novel Method for Anti-HLA Antibody Detection Using Personalized Peptide Arrays.</a> Transplant Direct. 2 (11), (2016).</li><li>Frank, R., Overwin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPOT+synthesis.+Epitope+analysis+with+arrays+of+synthetic+peptides+prepared+on+cellulose+membranes.">SPOT synthesis. Epitope analysis with arrays of synthetic peptides prepared on cellulose membranes.</a> Methods Mol Biol. 66, 149-169 (1996).</li><li>Frank, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SPOT-synthesis+technique.+Synthetic+peptide+arrays+on+membrane+supports--principles+and+applications.">The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports--principles and applications.</a> J Immunol Methods. 267 (1), 13-26 (2002).</li><li>Amartely, H., Iosub-Amir, A., Friedler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+protein-protein+interaction+sites+using+peptide+arrays.">Identifying protein-protein interaction sites using peptide arrays.</a> J Vis Exp. (93), (2014).</li><li>Kudithipudi, S., Kusevic, D., Weirich, S., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+analysis+of+protein+lysine+methyltransferases+using+SPOT+peptide+arrays.">Specificity analysis of protein lysine methyltransferases using SPOT peptide arrays.</a> J Vis Exp. (93), e52203 (2014).</li><li>Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+arrays+on+cellulose+support:+SPOT+synthesis,+a+time+and+cost+efficient+method+for+synthesis+of+large+numbers+of+peptides+in+a+parallel+and+addressable+fashion.">Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion.</a> Nat Protoc. 2 (6), 1333-1349 (2007).</li><li>McBride, R., Head, S. R., Ordoukhanian, P., Law, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-Cost+Peptide+Microarrays+for+Mapping+Continuous+Antibody+Epitopes.">Low-Cost Peptide Microarrays for Mapping Continuous Antibody Epitopes.</a> Methods Mol Biol. 1352, 67-83 (2016).</li><li>Li, S. S., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+peptide+array+to+identify+binding+motifs+and+interaction+networks+for+modular+domains.">Using peptide array to identify binding motifs and interaction networks for modular domains.</a> Methods Mol Biol. 570, 67-76 (2009).</li><li>Kaczmarek, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-specific+HLA+alloantibodies:+long-term+impact+on+cardiac+allograft+vasculopathy+and+mortality+after+heart+transplant.">Donor-specific HLA alloantibodies: long-term impact on cardiac allograft vasculopathy and mortality after heart transplant.</a> Exp Clin Transplant. 6 (3), 229-235 (2008).</li><li>Claas, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+relevance+of+circulating+donor-specific+HLA+antibodies.">Clinical relevance of circulating donor-specific HLA antibodies.</a> Curr Opin Organ Transplant. 15 (4), 462-466 (2010).</li><li>Brown, N. K., Kheradmand, T., Wang, J., Marino, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+novel+HLA+alleles:+Utility+of+next-generation+sequencing+methods.">Identification and characterization of novel HLA alleles: Utility of next-generation sequencing methods.</a> Hum Immunol. 77 (4), 313-316 (2016).</li><li>Cino, E. A., Choy, W. Y., Karttunen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+Biases+of+Linear+Motifs.">Conformational Biases of Linear Motifs.</a> Journal of Physical Chemistry B. 117 (50), 15943-15957 (2013).</li><li>Duquesnoy, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+leukocyte+antigen+epitope+antigenicity+and+immunogenicity.">Human leukocyte antigen epitope antigenicity and immunogenicity.</a> Curr Opin Organ Transplant. 19 (4), 428-435 (2014).</li><li>Lavinder, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+the+constituent+human+serum+antibodies+elicited+by+vaccination.">Identification and characterization of the constituent human serum antibodies elicited by vaccination.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (6), 2259-2264 (2014).</li><li>Kloetzel, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+processing+by+the+proteasome.">Antigen processing by the proteasome.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (3), 179-187 (2001).</li><li>Filippone, E. J., Farber, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Humoral+Theory+of+Transplantation:+Epitope+Analysis+and+the+Pathogenicity+of+HLA+Antibodies.">The Humoral Theory of Transplantation: Epitope Analysis and the Pathogenicity of HLA Antibodies.</a> J Immunol Res. 2016, 5197396 (2016).</li><li>Claas, F. H., Witvliet, M. D., Duquesnoy, R. J., Persijn, G. G., Doxiadis, I. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acceptable+mismatch+program+as+a+fast+tool+for+highly+sensitized+patients+awaiting+a+cadaveric+kidney+transplantation:+short+waiting+time+and+excellent+graft+outcome.">The acceptable mismatch program as a fast tool for highly sensitized patients awaiting a cadaveric kidney transplantation: short waiting time and excellent graft outcome.</a> Transplantation. 78 (2), 190-193 (2004).</li></ol>

تصميم الصفيف بقعة الموصوفة هنا للدراسة التجريبية لخصوصية اللوانتيبودي في زرع ضد المستضدات هلا مانحا الجهاز. على النقيض من مقايسة صاب القائمة المستخدمة على نطاق واسع في العيادة، لديه أسلوب صفيف مستضد ميزة كبيرة في التصميم المرنة التي يمكن أن تستوعب تسلسلات هلا الحقيقية للجهات المانحة ال?...

الجهاز استبدال العلاج التي تتم بشكل روتيني عبر العالم قد أنقذ حياة الملايين. زرع الأعضاء الصلبة يحدث في المرضى حوالي 100 مليون نسمة في الولايات المتحدة سنوياً، بينما عدد أكبر لا تزال في ويتليستس لتلقي الهيئات المانحة بسبب نقص حاد في إمدادات (وفقا للمعلومات المقدمة من الهيئة المشتريات وزرع شبكة-اوبشن/الشبكة: optn.transplant.hrsa.gov). الغاية ينظم زرع الأعضاء بغية الحد من النفايات الجهاز وإنقاذ الأرواح، ولكن الأدوات العلمية المستخدمة لإعلام هذه الأنظمة محدودة الفعالية. على سبيل المثال، وتدرك الأوساط العلمية تماما الدول عالية متعددة الأشكال من جزيئات هلا ودقة الاختبارات الجينية للحمض النووي باستخدام كتابة الاستبانة، وتستند إلى تسلسل كتابة (السبط) قد وضعت في السنوات الأخيرة1، 2. بيد اللوانتيبودي طرق الاختبار لم قادرة على إنتاج تشكيلة واسعة من تسلسلات هلا الفردية كتحقيقات مستضد. يستخدم الاختبار القياسية في الوقت الحاضر فريق ثابت ~ 100 الاليلي المستضدات التي تتألف من المتغيرات الشائعة من هلا، ألف، باء وجيم, DQ, DP والدكتور تسلسل في المجموعات السكانية البشرية3،4،،من56. وكثيراً ما هلا تسلسلات الفعلية للمانحين غير مدرجة في لوحة الاختبار، مما اضطر زرع الأطباء والجراحين للاستدلال مفاعليه مانحة على حدة استناداً إلى أوجه التشابه المشتركة بين تسلسلات الفعلية للجهات المانحة والمقابلة "معايير" في اختبار تعيين7،8. ونتيجة لذلك، وأحيانا تحديا لجعل إجراء تقدير موثوق لمخاطر الرفض استناداً إلى جسم اختبار النتائج9،10،،من1112. ولذلك، جديدة شخصيا تجارب قابلة للتخصيص ل alloantibodies هي تشتد13،14.
ترميز الجينات هلا المستقبلات (MHC) histocompatibility الرئيسية المعقدة التي لها وظيفة رئيسية في الاستجابات المناعية6. هلا الجينات من المعروف أن جينات متعددة الأشكال الأكثر الجينوم البشري6. بسبب التقدم السريع في الحمض النووي تسلسل استراتيجيات للجينات هلا، المتغيرات الجينية الجديدة (أو يشار إليها ببساطة الآليلات) يجري اكتشافها في معدل متفجرة15،16. بحلول عام 2017 في آذار/مارس، أودع في إيمجت/هلا قاعدة البيانات (http://www.ebi.ac.uk/ipd/index.html)، 16,755 الآليلات مصادق عليه من 12,351 التي كانت من فئة أنا وكانت 4,404 من الدرجة الثانية المجموعات. في تناقض صارخ، الآليلات متميزة إلا قليلاً ما يزيد على 100 ممثلة في مقايسة الخرز مستضد واحد قياسي (SAB)، التي تستخدم بشكل روتيني للكشف عن alloantibodies في زرع الأعضاء. الأسلوب صاب مبنية على منصة لوميناكس استخدام التدفق الخلوي. يمكن منذ المقايسة تستخدم مجموعة ثابتة من مولدات المضادات، وبصرف النظر عن التقلبات دفعة لدفعة طفيفة في الإنتاج، وتكون موحدة عبر الأفراد والمختبرات5قوة الاختبار antiserum. ولكن هذا الاختبار غير قادر على التقاط جميع اللوانتيبوديس وضعت على وجه التحديد ضد الآليلات المانحين، لا سيما عند تسلسل الجهات المانحة التي غائبة من الديوان تعيين. على الرغم من أن إنتاج مخصصة المستضدات الجهات المانحة استناداً إلى تسلسل صحيح المرغوب فيه، لا تزال هناك تحديات التقنية في ترشيد الإنتاج اللازمة وإجراءات الاختبار.
نحن مؤخرا وصف منهجية بديلة في إجراء دراسة جدوى لزرع الكلي مواضيع17. الأسلوب تستخدم مولدات الببتيد في صيغة صفيف لسبر ما قبل وما بعد زرع الأمصال لكل موضوع على حدة. كل مجموعة كانت مخصصة تم إنشاؤها باستخدام بقعة التوليف أسلوب18،19،20،21،22،23 التي تنتج المستضدات الببتيد، كل 15 الأحماض الأمينية في الطول، وتستند كلياً إلى هلا الآليلات الهيئة المعنية للمانحين أ، ب، ج، DQA1، DQB1 و DRB1. ويدار على غشاء السليولوز باستخدام معيار معتدلاً-الكيمياء22 توليف بقعة ويمكن أن تنتج مئات الببتيدات مخصصة بالتوازي مع19،نظام روبوتية مؤتمتة بالكامل21. يمكن أن تحمل الصفيف غشاء جولات متعددة من تجريد ودورات ريبروبينج. لدينا دراسة استعادية17، نحن الكشف عن التغييرات في أنماط مستضد مع أنتيسيرا زرع المخزن التي تم جمعها في سلسلة زمنية (أي، قبل وبعد زرع الأعضاء). هنا يصف لنا البروتوكول التقنية لسير العمل بما في ذلك تصميم مصفوفة، والصناعات التحويلية، antiserum السبر ونتيجة التحليل. الأسلوب المقصود للكشف عن alloantibodies ضد [ابيتوبس] خطية محددة على هلا الجزيئات زرع المانحين.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="577">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Peptide array</td>
			<td style="width:141px;">INTAVIS Bioanalytical Instruments</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Ethanol</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">E7023</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Ponceau S solution</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">P7170</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Non-fat milk</td>
			<td style="width:141px;">Bio Rad Laboratories</td>
			<td style="width:115px;">1706404</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">TBST</td>
			<td style="width:141px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:115px;">10711454001</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Goat anti-human IgG&#8211;HRP&#160;</td>
			<td style="width:141px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:115px;">A18811</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Clarity Western ECL Substrate</td>
			<td style="width:141px;">Bio Rad Laboratories</td>
			<td style="width:115px;">1705061</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Restore Western Blot Stripping Buffer</td>
			<td style="width:141px;">Thermo Scientifics</td>
			<td style="width:115px;">21059</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">ChemiDoc gel imaging system</td>
			<td style="width:141px;">Bio Rad Laboratories</td>
			<td style="width:115px;">1708265&#160;</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

personalized peptide arrays for detection of hla alloantibodies in organ transplantation

في زرع الأعضاء، وظيفة وطول العمر للفساد خطيرة تعتمد على نجاح السيطرة على مفاعليه الرفض المناعية ضد مستضدات الكريات البيض البشرية (HLA). تستند المبادئ التوجيهية histocompatibility الاختبارات المعملية هلا مكافحة الحصانة، التي تقدم أما كالموجودة مسبقاً أو إنشاء حيثياته هلا الأجسام المضادة التي تشكل حاجزاً يحول دون زرع رئيسية. الاختبارات الحالية مبنية على منصة واحدة-مستضد خرز (SAB) باستخدام مجموعة ثابتة من المستضدات هلا المؤتلف المختارة ~ 100 للتحقيق الأمصال زرع. ومع ذلك، توجد في البشر مجموعة أكبر بكثير من أنواع هلا، مع لا اثنين من الأفراد عدا التوائم الذين يمكن أن تتقاسم نفس تركيبة من تسلسلات هلا. بينما التكنولوجيات المتقدمة لكتابة هلا ومباشرة يسلسل دقة التقاط أي عدم التطابق في تسلسل الحمض النووي بين المانحين وهلا المستلم، مقايسة صاب، نظراً لتنوع محدود في تسلسل التمثيل، غير قادر على الكشف عن الذات اللوانتيبوديس على وجه التحديد ضد عدم التطابق هلا الجهات المانحة. سعينا لتطوير طريقة تكميلية باستخدام تقنية مختلفة لكشف وتوصيف الأجسام المضادة هلا المضادة المانحين على أساس شخصي. أداة الفحص مجموعة ببتيد مخصصة من المانحين المستمدة من هلا تسلسلات لسبر سيرا بعد زرع جهاز المستلم لتقييم المخاطر لرفض جسم بوساطة. في صفيف مفرد لزوج مانح ومتلق واحد، ما يصل إلى 600 من الببتيدات فريدة من نوعها يتم على أساس تسلسل البروتين هلا الجهة المانحة، الببتيد كل حمل واحد على الأقل للمخلفات غير متطابقة في تسلسل الأحماض أمينية 15. في تجاربنا التجريبية لمقارنة أنماط مستضد للأمصال ما قبل وما بعد زرع الأعضاء على هذه المصفوفات، كنا قادرين على كشف الإشارات المضادة-هلا مع القرار أيضا تسمح لنا بتحديد [ابيتوبس] محصنة ضد المتورطين. وهذه شخصية صفائف مستضد تتيح كشف عالية الدقة الخاصة بالمانحين هلا [ابيتوبس] في زرع الأعضاء.

في الدراسة الأصلية استخدام صفيف فحص أسلوب17، نحن المسجلين مجموع المواضيع زرع الكلي 5. حصلنا على هلا كتابة نتائج أعمالنا الأتراب والجهات المانحة ذات الصلة. تاريخهم الطبي والتتر الاليلي جسم من الاختبارات صاب كانت متاحة لنا أيضا. في هذه الدراسة التجريبية لهؤلاء...

Watch this Scientific Journal Video about Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation at JoVE.com

Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation

عدم التطابق في الكريات البيض البشرية مستضد (هلا) تسلسل بين الهيئة المانحة والمتلقية أزواج هي السبب الرئيسي للرفض بوساطة الأضداد في زرع الأعضاء. نقدم هنا استخدام صفائف مستضد مخصصة تستند إلى هلا تسلسلات فرادى المانحين للتحقيق المضادة المانحين هلا اللوانتيبوديس في الجهاز المتلقين.

تخصيص صفائف الببتيد للكشف عن Alloantibodies هلا في زرع الأعضاء

In organ transplantation, the function and longevity of the graft critically rely on the success of controlling immunological rejection reactivity against ...

The overall goal of this custom array method for alloantibody detection is to delineate humane leukocyte antigen or HLA epitopes in organ transplantation. This method can help answer key questions in the organ transplantation field about the specific immune epitopes involved in transplant rejection. The main advantage of this technique is that it's fully customizable, allowing incorporation of personalized antigen sets that can reflect individual organ donors'HLA sequences.The technique has the potential to detect specific HLA epitopes for alloantibodies. To retrieve sequences from the International Immunogenetics Project human leukocyte antigen project database, in the ambiguous allele combinations page, open the database allele query form and input the subject's first allele name into the search for box. Click Search for Alleles Now and locate the matching allele name displayed on the screen.Click Allele and copy and paste the protein sequence into a text document under an allele name header line to arrange the allele name in sequence in a FASTA format. When all of the sequences have been identified, copy and paste the sequences from the FASTA format into the enter your input sequences box on the Cluster Omega website and click submit your job using the standard parameter settings. Then click submit.An alignment of the sequences will be displayed. To mark the donor-specific mismatches, copy and paste the alignment text into a new text document and use a distinguishing font color to mark each mismatched donor-specific residue within the aligned sequences that belong uniquely to the donor. Underline all of the letters in the donor sequences that extend 14 residues up and downstream of the marked donor-specific mismatches and use the underlined sequences as templates to sequentially derive short 15 amino acid sequences in a series that overlap by four residues between any two immediately adjacent sequences in the series.Copy and paste these 15 amino acid sequences into a spreadsheet in a column format accompanied by notation columns that include the corresponding names of the donor alleles. To design a custom array layout, generate a spreadsheet of peptide sequences with corresponding allele callings with 20 rows and 30 columns. Then input the sequences into each of the array cells and use the spot synthesizer to run an automated peptide array synthesis.When designing an array, it is critical to use individual donors'HLA sequences as a template for deriving the antigen set. When the arrays have been synthesized, block the membranes with 20 milliliters of 5%nonfat milk dissolved in Tris-buffered saline with 0.1%tween 20 or TBST for the appropriate incubation period with rocking. Next, wash the membrane three times with 20 milliliters of fresh TBST for five minutes per wash followed by incubation with 20 microliters of crude-recipient serum in 2.5%milk in TBST for two to three hours at room temperature.At the end of the incubation, wash the membrane three times for 10 minutes per wash and incubate the membranes with goat anti-human horse radish peroxidase conjugated IgG secondary antibody for two hours. Remove the unbound secondary antibody with three 10-minute washes in TBST and develop the membranes in five milliliters of freshly-prepared luminol solution plus five milliliters of peroxide solution. After one minute, visualize the enhanced chemiluminescence signals on a suitable imager.After saving the developed images, incubate the membranes with 20 milliliters of commercial stripping buffer at 37 degrees Celsius for 20 minutes followed by three 10-minute washes in TBST. Then block, re-probe, and visualize the membranes as just demonstrated with a serum sample from the same patient obtained at a different time point. To manually annotate the positive antigen peptides, locate the spots with positive antibody signals in the saved developed image files and determine each of their grid positions.Then retrieve the peptide sequences from the master worksheet to identify any potentially shared epitope sequences based on their overlapping segments of reactive peptides. To structurally model antigen epitopes, obtain prototype HLA crystal structures from the protein data bank and display the prototype HLA structure in Pymol. Highlight the reactive peptide sequences to map the discovered anti-donor epitopes to the 3D structures of the prototype HLA.Then click Display and Background and select White, saving the data as a PNG file. After sequencing multiple alignments of this representative donor patient's alleles as just demonstrated, an alignment file was obtained for each of the alleles. The template sequences of the donor that were sufficiently long enough to cover all of the mismatched residues were then identified and underlined and three series of 15-mer peptides were derived for the first allele.After all of the donor's alleles were analyzed, a total of 202 peptides were loaded into an array for the specific probing of the donor's post-transplant serum. Comparing the results with those obtained from a subsequent re-probing of the donor's pre-transplant serum revealed the antibody signals associated with the post-transplant specimen of which several donor-specific residues mismatched from the recipient appeared to be involved in inciting antibody reactivity. When the antibody reactive epitopes on HLA-DQA1 and DQB1 were modeled to a co-crystal heterodimer structure, a prominent segment of the structure known as the beta one strand was identified as a hotspot that had a much higher chance of being targeted by alloantibodies among the transplant subjects in a representative five-case cohort.Once mastered, the technique can be completed in seven to eight hours if it is performed properly. After its development, the technique paved the way for researchers in the field of transplant rejection to explore the personalized detection of donor-specific alloantibodies.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

الآلي الصوتية الاستغناء عن التخفيف المسلسل من الببتيد ناهضات في الفعالية تحديد فحوصات

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

سهل التلاعب بأبنية في الهلاميات المائية المستندة إلى البروتين لتطبيقات ثقافة الخلية

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

تحليل هيستون الأجسام المضادة خصوصية مع ميكروأرس الببتيد

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

الكهروكيميائية "الكشف من الديوتريوم الحركية النظائر تأثير النقل الإلكترون خارج الخلية" في أونيدينسيس شيوانيلا السيد-1

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM ...

Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

عزل الحويصلات خارج الخلية الأنسجة من الكبد

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

"مقايسة الانقسام الببتيد فلوروجينيك" على الشاشة "النشاط بروتيوليتيك": تطبيقات للفيروس التاجي المسبّب لارتفاع البروتين التنشيط

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

الكشف عن مواقع اكتشاف البروتين من قبل إثراء الببتيد وقياس الطيف الكتلي

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

دراسة عن الأيض من المبيدات الحشرية النظامية الستة في ثقافة تعليق الخلية المنشأة حديثا المستمدة من الشاي(كاميليا سينينسيس L.) يترك

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

فحص مثبطات كيناز في ميكروصفائف البروتين البشري المجمعة ذاتيا

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Transplantation of Neonatal Mouse Cardiac Macrophages into Adult Mice

زرع الضامة القلبية للفأر الوليدي في الفئران البالغة

In an injured neonatal myocardium, macrophages facilitate cardiomyocyte proliferation and angiogenesis and promote heart regeneration. The present study ...