Name: quantification of monocyte transmigration and foam cell formation from individuals with chronic inflammatory conditions
Uploaded: 2017-10-17T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Monocyte Transmigration and Foam Cell Formation from Individuals with Chronic Inflammatory Conditions at JoVE.com

המחברים בתודה להכיר את עבודתו של פרופסור ויליאם מולר, ד ר קלייר Westhorpe שלהם תפקיד מפתח בפיתוח של חזרות קודמות של מודל זה. המחברים גם רוצה להודות AMREP Flow Cytometry הליבה עבור המיון של מונוציט קבוצות משנה ויחידת אלפרד חולים זיהומיות מחלות קליני מחקר אחיות לגיוס של HIV + בודדים על מחקרים. המחברים בתודה בתרומתן לעבודה זו של ויקטוריה תפעוליים תשתיות תמיכה התוכנית התקבל על ידי המכון ברנט. TAA נתמכת RMIT אוניברסיטת סגן-הנשיא של הבתר-דוקטורים. עבודה זו נתמכה על ידי גרנט פרוייקט NHMRC 1108792 על פועלם לקידום AJ AH. TK נתמך על-ידי NIH מעניקה NIH K08AI08272, גרנט NIH/NCATS # UL1TR000124.

הערה: כל הניסויים באמצעות דגימות ביולוגיות האדם בוצעו באישור אתיקה אלפרד חולים אנושיים ועדת האתיקה, מלבורן. כל הניסויים בוצעו ב- Class II אבטחה ארונות, אלא אם כן צוין. &#34; Prewarmed &#34; מתייחס ריאגנטים התחמם עד 37 מעלות צלזיוס waterbath.
 1. הכנה של סוג I סיבי קולגן ג'לים: יום 1 <ol><li>הכנת polymerize...

<ol>
	<li>Napoli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+streak+formation+occurs+in+human+fetal+aortas+and+is+greatly+enhanced+by+maternal+hypercholesterolemia.+Intimal+accumulation+of+low+density+lipoprotein+and+its+oxidation+precede+monocyte+recruitment+into+early+atherosclerotic+lesions.">Fatty streak formation occurs in human fetal aortas and is greatly enhanced by maternal hypercholesterolemia. Intimal accumulation of low density lipoprotein and its oxidation precede monocyte recruitment into early atherosclerotic lesions.</a> J Clin Invest. 100 (11), 2680-2690 (1997).</li><li>Woollard, K. J., Geissmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytes+in+atherosclerosis:+subsets+and+functions.">Monocytes in atherosclerosis: subsets and functions.</a> Nat Rev Cardiol. 7 (2), 77-86 (2010).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foamy+Monocytes+Form+Early+and+Contribute+to+Nascent+Atherosclerosis+in+Mice+With+Hypercholesterolemia.">Foamy Monocytes Form Early and Contribute to Nascent Atherosclerosis in Mice With Hypercholesterolemia.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (8), 1787-1797 (2015).</li><li>Jackson, W. D., Weinrich, T. W., Woollard, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Very-low+and+low-density+lipoproteins+induce+neutral+lipid+accumulation+and+impair+migration+in+monocyte+subsets.">Very-low and low-density lipoproteins induce neutral lipid accumulation and impair migration in monocyte subsets.</a> Scientific Reports. 6, 20038 (2016).</li><li>Angelovich, T. A., Hearps, A. C., Jaworowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation-induced+foam+cell+formation+in+chronic+inflammatory+disease.">Inflammation-induced foam cell formation in chronic inflammatory disease.</a> Immunol. Cell. Biol. 93 (8), 683-693 (2015).</li><li>Llodr&#225;, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emigration+of+monocyte-derived+cells+from+atherosclerotic+lesions+characterizes+regressive,+but+not+progressive,+plaques.">Emigration of monocyte-derived cells from atherosclerotic lesions characterizes regressive, but not progressive, plaques.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (32), 11779-11784 (2004).</li><li>Getz, G. S., Reardon, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+of+Atherosclerosis.">Animal Models of Atherosclerosis.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 32 (5), 1104-1115 (2012).</li><li>Meir, K. S., Leitersdorf, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerosis+in+the+Apolipoprotein+E-Deficient+Mouse.+A+Decade+of+Progress.">Atherosclerosis in the Apolipoprotein E-Deficient Mouse. A Decade of Progress.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24 (6), 1006-1014 (2004).</li><li>Hilgendorf, I., Swirski, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+a+difference:+Monocyte+Heterogeneity+in+Cardiovascular+Disease.">Making a difference: Monocyte Heterogeneity in Cardiovascular Disease.</a> Curr. Atheroscler. Rep. 14 (5), 450-459 (2012).</li><li>Rogacev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lower+Apo+A-I+and+Lower+HDL-C+Levels+Are+Associated+With+Higher+Intermediate+CD14++CD16++Monocyte+Counts+That+Predict+Cardiovascular+Events+in+Chronic+Kidney+Disease.">Lower Apo A-I and Lower HDL-C Levels Are Associated With Higher Intermediate CD14++CD16+ Monocyte Counts That Predict Cardiovascular Events in Chronic Kidney Disease.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 34 (9), 2120-2127 (2014).</li><li>Rogacev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD14++CD16++Monocytes+Independently+Predict+Cardiovascular+Events:+A+Cohort+Study+of+951+Patients+Referred+for+Elective+Coronary+Angiography.">CD14++CD16+ Monocytes Independently Predict Cardiovascular Events: A Cohort Study of 951 Patients Referred for Elective Coronary Angiography.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 60 (16), 1512-1520 (2012).</li><li>Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Cell+Migration+and+Invasion+Assays.">In vitro Cell Migration and Invasion Assays.</a> J. Vis. Exp. (88), e51046 (2014).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Chemotactic+Effect+Of+Mixtures+Of+Antibody+And+Antigen+On+Polymorphonuclear+Leucocytes.">The Chemotactic Effect Of Mixtures Of Antibody And Antigen On Polymorphonuclear Leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115 (3), 453-466 (1962).</li><li>Westhorpe, C. L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+activation+promotes+foam+cell+formation+by+monocytes+following+transendothelial+migration+in+an+in+vitro+model.">Endothelial cell activation promotes foam cell formation by monocytes following transendothelial migration in an in vitro model.</a> Exp. Mol. Pathol. 93, 220-226 (2012).</li><li>Quinn, M. T., Parthasarathy, S., Fong, L. G., Steinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidatively+modified+low+density+lipoproteins:+a+potential+role+in+recruitment+and+retention+of+monocyte/macrophages+during+atherogenesis.">Oxidatively modified low density lipoproteins: a potential role in recruitment and retention of monocyte/macrophages during atherogenesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 84 (9), 2995-2998 (1987).</li><li>Henriksen, T., Mahoney, E. M., Steinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+macrophage+degradation+of+biologically+modified+low+density+lipoprotein.">Enhanced macrophage degradation of biologically modified low density lipoprotein.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 3 (2), 149-159 (1983).</li><li>Parthasarathy, S., Raghavamenon, A., Garelnabi, M. O., Santanam, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidized+Low-Density+Lipoprotein.">Oxidized Low-Density Lipoprotein.</a> Methods Mol. Biol. 610, 403-417 (2010).</li><li>Muller, W. A., Weigl, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte-selective+transendothelial+migration:+dissection+of+the+binding+and+transmigration+phases+by+an+in+vitro+assay.">Monocyte-selective transendothelial migration: dissection of the binding and transmigration phases by an in vitro assay.</a> J. Exp. Med. 176 (3), 819-828 (1992).</li><li>Maisa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytes+from+HIV-infected+individuals+show+impaired+cholesterol+efflux+and+increased+foam+cell+formation+after+transendothelial+migration.">Monocytes from HIV-infected individuals show impaired cholesterol efflux and increased foam cell formation after transendothelial migration.</a> AIDS. 29 (12), 1445-1457 (2015).</li><li>Angelovich, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+foam+cell+formation+is+enhanced+in+monocytes+from+older+individuals+by+both+extrinsic+and+intrinsic+mechanisms.">Ex vivo foam cell formation is enhanced in monocytes from older individuals by both extrinsic and intrinsic mechanisms.</a> Exp. Gerontol. 80, 17-26 (2016).</li><li>Westhorpe, C. L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+HIV-1+infection+in+vitro+on+transendothelial+migration+by+monocytes+and+monocyte-derived+macrophages.">Effects of HIV-1 infection in vitro on transendothelial migration by monocytes and monocyte-derived macrophages.</a> J. Leukoc. Biol. 85 (6), 1027-1035 (2009).</li><li>Furie, M. B., Cramer, E. B., Naprstek, B. L., Silverstein, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+endothelial+cell+monolayers+that+restrict+the+transendothelial+passage+of+macromolecules+and+electrical+current.">Cultured endothelial cell monolayers that restrict the transendothelial passage of macromolecules and electrical current.</a> J. Cell Biol. 98 (3), 1033-1041 (1984).</li><li>M&#252;ller, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+Endothelial+Markers+PECAM-1,+vWf,+and+CD34+in+Vivo+and+in+Vitro.">Expression of the Endothelial Markers PECAM-1, vWf, and CD34 in Vivo and in Vitro.</a> Exp. Mol. Pathol. 72 (3), 221-229 (2002).</li><li>Kelesidis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictors+of+impaired+HDL+function+in+HIV-1+infected+compared+to+uninfected+individuals.">Predictors of impaired HDL function in HIV-1 infected compared to uninfected individuals.</a> J. Acquir. Immune Defic. Syndr. , (2017).</li><li>Rogacev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+heterogeneity+in+obesity+and+subclinical+atherosclerosis.">Monocyte heterogeneity in obesity and subclinical atherosclerosis.</a> European Heart Journal. 31 (3), 369-376 (2010).</li><li>Gacka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinflammatory+and+atherogenic+activity+of+monocytes+in+Type+2+diabetes.">Proinflammatory and atherogenic activity of monocytes in Type 2 diabetes.</a> J. Diabetes Complications. 24 (1), 1-8 (2010).</li><li>Rogacev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD14++CD16++monocytes+and+cardiovascular+outcome+in+patients+with+chronic+kidney+disease.">CD14++CD16+ monocytes and cardiovascular outcome in patients with chronic kidney disease.</a> Eur. Heart J. 32 (1), 84-92 (2011).</li></ol>

הפרוטוקול המתואר כאן מציע שיטה רב-תכליתי פיזיולוגית רלוונטי להערכת את atherogenicity של ומונוציטים מן האנושי גדודים קליניים, על ידי שילוב של גלגול מונוציט והן קצף כדוריות. מודל זה מציע יתרונות על פני שיטות אלטרנטיביות להק תא קצף הוא לוקח בחשבון את השפעת מונוציט גלגול על היווצרות תאי קצף ומאפשר א...

מונוציט גלגול היא צעד מכריע בהתפתחות טרשת עורקים פלאק שעלולות להוביל פקקת, שבץ מוחי, אוטם שריר הלב. שלטי טרשת עורקים להתפתח פסי שומן, בדרך כלל נוכח באתרים של זרימת הדם מתנדנדות נמוך בינוני עורקים גדולים, שבו הופקדו השומנים תורמת הפעלה אנדותל, מקומי דלקת1. ומונוציטים מגויסים כדי תאי אנדותל פסי שומן באמצעות מונוציט chemotactic חלבונים (כגון CCL2), transmigrate לתוך אינטימה2. בעקבות גלגול, ומונוציטים עלולה להיווצר מקרופאגים atherogenic, עמוסי השומנים הנקרא תאי קצף בשל ספיגת השומנים, בסינתזה השומנים, למטה-ויסות כולסטרול בזרימת או שילוב של הגורמים לעיל. ומונוציטים עשויים לצבור שומנים במחזור ויש גם הפנוטיפ 'רכה', יכול להיות נטייה תאי קצף תא היווצרות3,4. תאי קצף התכונות המגדירות של פסי שומן ושלטים טרשת עורקים בשלב מוקדם, שלהם גיבוש מושפעת השומנים וגם מתווכים דלקתיים5. לחלופין, ומונוציטים יש את היכולת להפוך transmigrate של העורק לתוך מחזור הדם6, ובכך להסיר את השומנים מן אינטימה להתנהג כדי לשמור על הבריאות של העורק.
קביעת של הנטייה של monocytes כדי transmigrate על פני אנדותל העורקים ואת תאי קצף טופס של אינטימה, או להיפוך transmigrate ולסחוב השומנים מחוץ הפלקיו, היא דרישה מפתח להבנת התפקיד של הפעלת מונוציט בהגדלת הסיכון טרשת עורקים. דגמי העכבר CADs כגון טרשת עורקים חשובים שחקרתי בזמן אמת אין ויוו מידע על התפתחות רובד שומני פס/טרשת עורקים. עם זאת, מודלים אלה מחייבים שינוי גנטי של רמת הכולסטרול טבעית עיבוד היכולות של חיות אלו בדרך כלל בשילוב עם שינויים דרסטיים דיאטה (כגון דגם דיאטה ספקיות-/-מערבי-type)7,8, ובכך, גרימת הצטברות-פיזיולוגיים של מחזורי השומנים רמות שהתפתחות לוח הכונן. מודלים אלה תהיה מוגבלת רלוונטיות התנאים דלקתית כרונית אנושיים כגון הידבקות ב- HIV אשר אינם משויכים מוגבר במחזור כולסטרול או רמות ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDL). יתר על כן, הבדלים בביולוגיה מונוציט בין בני אדם ועכברים לבצע בדיקה של אימונולוגי שאלות הנוגעות הרלוונטיות של subpopulations של ומונוציטים (כגון ומונוציטים ביניים (CD14++CD16+))9 קשה. זה חשוב כאשר לומדים את מנגנוני נהיגה למחלות לב וכלי דם כמו ספירת ביניים מונוציט באופן עצמאי לחזות אירועי לב וכלי דם10,11. בזמן מבחני קיימים למדוד באופן רציף או מונוציט גלגול או קצף כדוריות בבידוד, אין assay במבחנה אומתה לכימות תנועת שני היבטים של atherogenesis מוקדם באמצעות אותם התאים של גדודים קליניים. Transwell מודלים לנצל ששונה בוידן דו תאיים מערכת לפיה תאים מוטענים לתוך התא העליון, transmigrate דרך מחסום פלסטיק נקבובי או טפט תא לתא התחתון המכיל בדרך כלל מדיה עם chemoattractant12 , 13. תוך שימוש נרחב לניתוח ליקוציט גלגול, מודלים אלה בדרך כלל לא לשלב שכבה המייצג של אינטימה, וכתוצאה מכך שמדמו תאים נודדים לתוך פתרון, ולא מאפשרים לשקילת קצף תא היווצרות או גלגול לאחור של אותם התאים. לעומת זאת, מודלים של היווצרות תאי קצף לא בחשבון שינויים transmigratory-induced ומונוציטים או אפקטים של הפעלת אנדותל אשר ידוע לתרום קצף היווצרות התא14. יתר על כן, מערכות אלו זירוז קצף כדוריות של מקרופאגים דבקה צלחות התרבות התא על ידי הוספת קולח ריכוזי אקסוגני מחמצנים ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (oxLDL)15,16משרן מפתח להק תא קצף. LDL בשימוש במודלים אלה היא לעתים קרובות תחמוצת על-ידי תהליכים שאינם פיזיולוגית-רלוונטיות כגון טיפול4 CuSO17, לכן, לחקור את חשיבות פיזיולוגית של מחקרים באמצעות מודלים אלה.
כאן נתאר וזמינותו של זה מכמת מונוציט גלגול, היווצרות תאי קצף לאותם התאים אשר אינה דורשת התוספת של oxLDL אקסוגני, לכן כדאי דגמי את התפקיד של monocytes במבנה התא קצף. מודל זה פותחה במקור על ידי פרופסור ויליאם מולר (אוניברסיטת נורת'ווסטרן, שיקגו)18, יש נוספת מעודן במעבדה שלנו להעריך שמחוץ atherogenicity של monocytes מבודד תחת שאינו מפעיל מאנשים עם מצבים דלקתיים כבסיס המלווה מחלות כמו איידס זיהום19 , כמו גם הזדקנות20, כי התנאים קשורה לסיכון מוגבר של טרשת עורקים. מודל זה מספק גם פלטפורמה עבור מענה לשאלות ביולוגי בסיסי לגבי נטיה של קבוצות משנה מונוציט שונים לטופס קצף תאים20, ההשפעה של הפעלת אנדותל על ידי ציטוקינים כגון TNF-קצף כדוריות14 , ואת המאפיינים הנדידה של monocytes כגון עומק ומהירות מהאוכלוסיות ג'לים19. יתר על כן, גלגול מונוציט תא היווצרות קצף ניתן לכמת באמצעות מיקרוסקופ רגיל, לחיות תא הדמיה, flow cytometry והדמיה cytometry זרימה, לכן, לספק שיטה רב תכליתי כדי להעריך את התפקיד של monocytes ב- atherogenesis.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1187">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Gel preparation reagents</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465-500G</td>
			<td>0.1 M NaOH diluted in H20</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">10X M199</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">M0650</td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">AcCOOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>695092-100ML</td>
			<td>20 mM Acetic acid diluted in H20</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cultrex Bovine Collagen I</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3442-050-01</td>
			<td>Type I Fibrous Collagen</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Name</td>
			<td style="width:128px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:595px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">M199</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11150-059</td>
			<td style="width:595px;">M199 media containing Earle&#39;s salts, L-glutamine and 2.2 g/L Sodium Bicarbonate. 
			Media supplemented with 100 &#181;g/mL L-glutamine&#160; and 100 U/mL penicillin/streptomycin&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">M20</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:595px;">Supplemented M199 containing 20% heat-inactivated pooled or donor serum. 
			Individual lipid species such as LDL can be added to M199.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">HUVEC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:595px;">Primary human umbilical cord endothelial cells (HUVEC) can be isolated from umbilical cords donated with informed consent and ethics approval. Isolated HUVEC may also be purchased commercially.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Human coronary artery endothelial cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:595px;">Primary human coronary artery endothelial cells can be isolated from arteries donated with informed consent and ethics approval. Isolated cells may also be purchased commercially.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA</td>
			<td>BDH Merck</td>
			<td>10093.5V</td>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) - 0.5 M, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889-500G</td>
			<td>Ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EGTA) - 1 mM, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.05% trypsin EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>0.05% trypsin/0.53 EDTA (1X)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>L-glutamine (200 mM)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/streptomycin&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Penicillin/streptomycin (10,000 units/mL Penicillin and 10,000 &#181;g/mL Streptomycin)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">New born calf serum</td>
			<td style="width:128px;">Gibco</td>
			<td style="width:111px;">16010-142</td>
			<td style="width:595px;">New born calf serum: New Zealand origin</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fibronectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1056-1MG</td>
			<td>Fibronectin - 50 &#181;g/mL aliquots prepared and stored</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">PBS (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14200-075</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (10X): Dilute to 1X with sterile H20</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.1% TNF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC3015</td>
			<td>Recombinant human TNF - Reconstituted in H20 and stored in 10 &#181;g/mL aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Low-density lipoprotein</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>LP2-2MG</td>
			<td>Low-density lipoprotein (LDL)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Name</td>
			<td style="width:128px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:595px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Microscopy</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">1 or 2% formaldehyde</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>4018</td>
			<td>1 or 2% formaldehyde diluted with sterile H20</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">50% and 78% methanol</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>318-2.5L GL</td>
			<td>50% or 78% v/v methanol, diluted with H20</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Oil Red O stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O0625-25G</td>
			<td>Dilute to 2 mg/mL in 22% 1M NaOH and 78% (v/v) methanol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope slides</td>
			<td>Mikro-Glass</td>
			<td>S41104AMK</td>
			<td style="width:595px;">Twin frosted 45 degree ground edge microscope slides (25 X 76 mm)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cover slips</td>
			<td>Menzel-Gl&#228;ser</td>
			<td>MENCS224015GP</td>
			<td>22 x 40 mm #1.5 size glass cover slips</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Double-sided tape</td>
			<td>3M Scotch</td>
			<td>4011</td>
			<td>Super strength exterior mounting tape (25.4 mm x 1.51 m)</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Giemsa stain</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1.09204.0500</td>
			<td>Giemsa&#39;s azur eosin methylene blue solution (dilute stock 1:10 in H20)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Hole punch</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:595px;">Hand-held single hole punch (6.35 mm punch)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Name</td>
			<td style="width:128px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:595px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Flow cytometry</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase D</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11088858001</td>
			<td>Collagenase D diluted in M199 media to 1 mg/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">35 &#181;m nylon mesh capped polystyrene FACS tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352235</td>
			<td>35 &#181;m nylon mesh capped polystyrene FACS tubes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L34959</td>
			<td>Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">FACS wash</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare by mixing 1 X PBS-, 2 mM EDTA and 1% New born calf serum</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Name</td>
			<td style="width:128px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:595px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Plasticware</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96 well plate</td>
			<td>Nunclon</td>
			<td>167008</td>
			<td>Delta surface flat-bottomed 96 well plate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10 cm Petri Dish</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td>Sterile 10 cm Petri dish</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 125.150</td>
			<td>Eppendorf tubes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Transfer pipette</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>222-20S</td>
			<td>Sterile transfer pipette (1 mL, large bulb)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of monocyte transmigration and foam cell formation from individuals with chronic inflammatory conditions

לב כלילית (CAD) הוא גורם התחלואה והתמותה ברחבי העולם. טרשת עורקים, מוביל לגרום של CAD, הוא שיזם גלגול של מולדת ומונוציטים המערכת החיסונית לאתרים דלקתיות של הפקיד השומנים הנקרא פסי שומן, אשר נמצאים בתוך דפנות העורקים של מדיום כדי עורקים גדולים. תכונת פתוגניים המפתח של נגעים בשלב כזה מוקדם של טרשת עורקים היא ההבשלה של monocytes אשר נודדים אל העורקים כדי ליצור תאי קצף או עמוסי השומנים מקרופאגים. ראיות רבות תומך את ההשערה כי הסיכון של טרשת עורקים מוגברת על ידי התנאים דלקתית כרונית המלווה מחלות כגון דלקת מפרקים שגרונית, HIV, כמו גם הזדקנות כללית, וכי הסיכון הזה הוא ניבא על ידי מונוציט הפעלה. בעוד העכבר מודלים מספקים פלטפורמה טובה לחקור את התפקיד של monocytes atherogenesis ויוו, הן דורשות שינוי גנטי של כולסטרול טבעי מטבוליזם ושינוי דרסטי של העכבר הרגיל דיאטות, מוגבלת התאמה חקר השפעות atherogenic של מחלות comorbid אנושי. זה הניע אותנו לפתח מודל אנושי במבחנה כדי למדוד את הפוטנציאל atherogenic של monocytes מבודד מאנשים עם מצבי מחלה מוגדרת. כיום, אנושיים במבחנה מודלים המגבילים בכך שהם מוערכים מונוציט גלגול קצף תא היווצרות בבידוד. כאן נתאר פרוטוקול שבו ומונוציטים מבודד דם החולה transmigrate על פני תאי אנדותל אדם לתוך מטריצה קולגן מסוג 1, ואת הנטייה שלהם להבשיל לתאי קצף ב נוכחות או היעדרות של השומנים אקסוגני נמדד. הפרוטוקול אומתה על השימוש האנושי ומונוציטים מטוהרים אנשים עם הידבקות ב- HIV ויחידים HIV uninfected קשישים. מודל זה הוא תכליתי ומאפשר מונוציט גלגול קצף תא היווצרות להעריך באמצעות מיקרוסקופ או או cytometry זרימה, כמו גם מאפשר את ההערכה של גורמים atherogenic, המצויים בסרום או פלסמה.

לכימות מונוציט גלגול
ומונוציטים נוספים למודל כמתואר באיור1, ג'לים שישה מוכנים עבור כל תנאי. ומונוציטים עבור ג'לים 6 לכל תורם (קרי, 5.0 x 10 ומונוציטים4 לכל ג'ל ג'ל 6 = 3.0 x 10 ומונוציטים5 לכל התורם) הם resuspended ...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Monocyte Transmigration and Foam Cell Formation from Individuals with Chronic Inflammatory Conditions at JoVE.com

Quantification of Monocyte Transmigration and Foam Cell Formation from Individuals with Chronic Inflammatory Conditions

אנו מתארים פרוטוקול למדוד גלגול מאת ומונוציטים מעבר monolayers אנדותל אנושית ועם בגרות עוקבות שלהם לתאי קצף. זה מספק שיטה תכליתי כדי להעריך את מאפייני atherogenic ומונוציטים מבודד מאנשים עם מחלות שונות תנאים וכדי להעריך גורמים בדם אשר עשוי לשפר את הנטייה הזאת.

כימות של גלגול מונוציט ויצירת תאי קצף מאנשים עם מצבים דלקתיים כרוניים

Coronary artery disease (CAD) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Atherosclerosis, a leading cause of CAD, is initiated by the ...

The overall goal of this assay is to quantify the capacity for monocytes from human clinical samples to undergo transendothelial migration and foam cell formation. This method can be used to answer key questions in the cardiovascular field such the atherogenic potential of cells from individuals who are at risk of acute coronary artery disease. The major advantage of this technique is that clinical samples can be measured both from fresh whole blood or stored patient cohorts.Furthermore, foam cell formation can be quantified by both microscopy and flow cytometry. First, prepare the polymerized collagen gels from a fresh collagen suspension. To a five-milliliter polystyrene tube, add sodium hydroxide, then 10 times M199, then acidic acid, and finally, add fibrous collagen.Mix this well by pipetting. Next, aliquot 50 microliters into the internal wells of a sterile flat-bottomed 96-well tissue culture plate. In the outer edges of wells, load 200 microliters of one times Dulbecco PBS to prevent desiccation.After two hours of incubation at 37 degrees Celsius, the collagen will polymerize. Then, overlay the gels with 150 microliters of one times supplemented M199 and incubate them until needed for use five days later. To expand stored human umbilical vein endothelial cells, prepare a 25-square-centimeter culture flask with one milliliter of fibronectin solution and incubate the dish for 10 minutes at room temperature.Meanwhile, thaw the stored cells in a water bath to resuspend them in M20. Once the cells are thawed, aspirate any residual fibronectin solution from the dish and plate the cells. Then, culture to confluence by replacing the media after two to three days.The HUVECs should be confluent on day five of culturing. Detach them by aspirating the culture's supernatant from the flask, and then wash away the serum-containing media using two to three milliliters of one times PBS. Then, add five milliliters of diluted trypsin and incubate the cells briefly at room temperature shaking the cells gently until they appear detached.Then, quickly collect them with five-milliliters of M20 and transfer the suspension to a 10-milliliter tube and centrifuged cells. Now, resuspend the cells in M20 at 200, 000 cells per milliliter. Then, aspirate the M199 from the prepared collagen plate and add 100 microliters of HUVECs to each gel.Continue the culture for three days. On day eight of culturing the HUVECs, activate the monolayers prior to adding the monocytes. After aspirating the overlaying media, add 100 microliters of human TNF-alpha solution to each well.Then, incubate the plate at 37 degrees Celsius for four hours. After the incubation, remove the media and wash the gels twice using 100 microliters of M199 per wash. Now, add 50, 000 freshly isolated monocytes or purified monocyte subsets in 100 microliters of M20 to the HUVEC monolayers.After adding the monocytes, incubate the plate for an hour to allow for forward transmigration of the cells. After an hour, collect the non-transmigrated cells in wash solution. Start by pooling two EGTA washes using 100 microliters per well.Then, spin down the combined wash solutions at 300 G for five minutes at four degrees Celsius. Discard the supernatant, and resuspend the cells in 30 microliters of PBS and count the cells to determine the percentage of forward transmigrated cells. Now, wash plate wells once with M199 and add 100 microliters of fresh M20 to the plate wells and incubate the plate for two days.After two days, repeat the procedure for collecting the non-transmigrated cells in EGTA wash solution in order to collect reverse transmigrated cells and proceed with phenotypic analysis of the cells. To phenotypically characterize the gel-bound cells by FACS analysis, digest the cells by adding 100 microliters of 37-degrees-Celsius collagenese D and incubating for 20 minutes at 37 degrees Celsius. Following the incubation, macerate the gels using a 200-microliter pipette tip and incubate them for a further 20 minutes to fully digest the gels.Once fully digested, filter and pool the digested replicate gels through a 35-micron nylon mesh into a FACS tube on ice. Now, wash the filtered cells once with cold FACS wash solution. Centrifuge the cells and resuspend them in 100 microliters of cold wash solution.Then, perform FACS staining and analysis according to the text protocol. To analyze the cells by microscopy, first stain the cells as described in the text protocol. To detach the stained cells, rim the wells using a 21-gauge needle with the bevel facing outwards.Next, prepare slides to mount the gels. Punch two small holes into a strip of double-sided tape and then fix the tape to the slide and remove the protective coating. Next, add a drop of water to each hole in the tape.Then, using tweezers, gently transfer two gels onto the two holes and cover the tape. Finally, carefully attach a coverslip to the tape and proceed with visualization of the cells. Following transmigration, non-transmigrated cells were counted as described.A total of 15, 000 non-transmigrated cells were recovered, and the percentage of forward transmigration was determined to be 95%Following 48 hours of further incubation, 36, 000 reverse transmigrated cells were recovered which amounted to 12.6%reverse transmigration. Staining the gels with oil red O revealed foam cells pointed out by white arrows and macrophages pointed out with black arrows. These monocytes were treated with oxidized LDL during transmigration, a substance used to induce foam cell formation in conventional foam cell induction models.Aggregate cell count data from 12 donors confirmed that the incubation of monocytes with oxidized LDL induced more foam cell formation than when monocytes are incubated with native LDL or M199 media alone. The transmigrated cells were also analyzed by flow cytometry. After excluding dead cells, doublets and CD45 negative HUVECs, the major population of migrated cells was selected and the mean fluorescence intensity of the receptors of interest was compared with the fluorescence minus one or isotype control data.After watching this video, you should have a good understanding of how to use this assay to quantify monocyte transendothelial migration and foam cell formation from human clinical samples. Don't forget that working with human clinical samples can be extremely hazardous and good laboratory technique must always be used.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

בידודו של האדם וריד טבורי תאים אנדותל והשימוש בהם לחקר גלגול נשמות נויטרופילים בתנאי זרימה

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

אפיון של תגובות דלקתיות במהלך קולוניזציה תוך-אפית עם דלקת ריאות סטרפטוקוקוס

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

הדמיה בזמן אמת של תאי תאי צומת האנדותל במהלך נויטרופילים גלגול תחת פיזיולוגית זרימה

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

בידוד של Exosomes מהפלזמה של HIV-1 אנשים חיוביים

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

דור של תאי דנדריטים אדם נגזר מונוציטים מן הדם מלא

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

אינדוקציה של תגובה דלקתית בתרבויות Hepatocyte הראשי מעכברים

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages

הכמת של פעילות כימוכתית מונוציט בVivo ואפיון מקרופאגים הנגזרים מונוציט

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of ...

Separation of Rat Epidermis and Dermis with Thermolysin to Detect Site-Specific Inflammatory mRNA and Protein

הפרדת אפידרמיס ראט ודרמיס עם תרמוליסין לזיהוי mRNA וחלבון דלקתיים ספציפיים לאתר

Easy-to-use and inexpensive techniques are needed to determine the site-specific production of inflammatory mediators and neurotrophins during skin ...

Isolation of Adipogenic and Fibro-Inflammatory Stromal Cell Subpopulations from Murine Intra-Abdominal Adipose Depots

בידוד תת-אוכלוסיות תאי סטרומה אדיפוגניים ופיברו-דלקתיים ממחסני שומן תוך-בטניים של מורין

The stromal-vascular fraction (SVF) of white adipose tissue (WAT) is remarkably heterogeneous and consists of numerous cell types that contribute ...

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

כימות בזמן אמת של מינים חמצן תגובתי נויטרופילים נגועים מנינגיטי Escherichia קולי

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration ...