Name: targeting cysteine thiols for in vitro site-specific glycosylation of recombinant proteins
Uploaded: 2017-10-04T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי מדעי הטבע, הנדסה מחקר המועצה של קנדה (05239 כדי נשדר), קרן קנדי קרן מחקרים חדשנות/אונטריו (כדי נשדר), קרן סרטן הערמונית להילחם - טילוס נסיעה עבור אבא (כדי נשדר), אונטריו מלגות לתואר שני (כדי Y.J.C. ונ. ס).

1. תגובת שרשרת פולימראזית (PCR)-מתווכת מוטגנזה כהכנה לסיפוח Cys לתוך וקטור ביטוי חיידקי pET-28a.
<ol><li>לקבוע את הריכוז של הווקטור pET-28a (כלומר כפול נטושים DNA) באמצעות מקדם הכחדה אולטרה סגול (UV) (μg/mL) 0.020 ס מ -1 ב 260 ננומטר.</li>
	<li>לסנתז זוג תחל מוטגניות משלימים עבור כל מוטציה Cys כזה כי אני) יש מיני...

גליקוזילציה חלבון הוא שינוי post-translational איפה סוכרים covalently מחוברים polypeptides בעיקר דרך קישורים לרשתות בצד חומצת אמינו. כ 50% של יונקים חלבונים הם glycosylated 54, שבו החלבונים glycosylated יכול לאחר מכן יש מגוון רחב של אפקטים מתוך שינוי זיקה מחייבת למערכות ביולוגיות, המשפיעים על חלבון קיפול, שינ?...

לאחסן המופעלים סידן (Ca2 +) כניסה (SOCE) הוא מסלול מרכזי שבו תאים חיסוניים לקחת את2 + Ca מן המרחב חוץ-תאית לתוך ציטוזול. בלימפוציטים מסוג T, T cell קולטנים הממוקמים על קרום פלזמה (PM) לאגד אנטיגנים אשר להפעיל חלבון טירוזין kinases (נבדקה 1,2,3). מפל זרחון שמוביל ההפעלה של phospholipase-γ (PLCγ) אשר לאחר מכן שמתווכת של הידרוליזה של הממברנה phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (פיפ2) לתוך diacylglycerol, אינוזיטול 1,4,5-טריפוספט (IP3 ). IP3 הוא שליח diffusible קטן אשר נקשר לקולטנים IP3 (IP3R) על תוך-פלזמית (ER) ובכך לפתוח ערוץ קולטן זה ואישורים Ca2 + לזרום במורד מעבר הצבע ריכוז מחדר המיון לומן ל ציטוזול (נבדקה ב 4). קולטן למנהיגנו לבין חלבון G בשילוב קולטני טירוזין קינאז במגוון של עופרת סוגים אחרים על טמפרמנט רב ועל אי-טמפרמנט תא ייצור זהה של IP3 והפעלה של IP3ר'.
עקב גבולית קה2 + קיבולת האחסון של חדר המיון, ה-IP3-שחרור בתיווך, שנפתח על ידי עלייה Ca cytosolic2 + היא רק ארעי; עם זאת, זו דלדול ER luminal Ca2 + עמוקות אפקטים אינטראקציה סטרומה מולקולה-1 (STIM1), סוג-אני transmembrane (TM) חלבון נמצאו בעיקר על6,7 5,ממברנה ER. STIM1 מכיל מונחה לומן Ca2 + חישה תחום מורכב, זוג EF-יד ו α-מוטיב סטרילי (EFSAM). שלושה תחומים של סליל מפותל cytosolic מונחה מופרדים EFSAM על-ידי קבוצת המחשבים TM יחיד (נבדקה ב 8). בעת מיון luminal Ca2 + התרוקנות, עובר EFSAM 7,oligomerization מצמידים הקשורה9 הגורמת rearrangements מבנית של TM ואת סליל מפותל תחומים 10. שינויים מבניים אלה מסתיימים השמנה של STIM1 ב ER-PM צמתי 11,12,13,14 דרך אינטראקציות עם PM phosphoinositides 15, 16 Orai1 subunits 17,18. Orai1 חלבונים הם subunits PM אשר להרכיב לטופס Ca2 + ערוצי 19,20,21,22. האינטראקציות STIM1-Orai1 ובצמתים ER-PM להקל על פתוח Ca2 + שחרור מופעל Ca2 + (CRAC) ערוץ קונפורמציה המאפשר את התנועה של Ca2 + לתוך ציטוזול מ ריכוזים גבוהים של מרחב חוץ-תאית. בתאי מערכת החיסון, מתמשכת cytosolic Ca2 + שינויי הגובה באמצעות ערוצים CRAC זירוז של Ca2 +- קלמודולין/calcineurin תלויים dephosphorylation של הגורם הגרעיני של תאי-T מופעל, אשר לאחר מכן נכנס לגרעין, מתחיל תעתיק ויסות גנים קידום T-cell הפעלה 1,3. התהליך של CRAC הפעלת הערוץ על ידי 23,STIM124 באמצעות אגוניסט-induced ER luminal Ca2 + הידלדלות שכבת שתיווצר מתמשכת cytosolic Ca2 + גובה קולקטיבי הנקרא SOCE 25. התפקיד החיוני של SOCE של תאי T-מתבטא על ידי מחקרים מדגימים כי מוטציות heritable הן STIM1 והן Orai1 יכול לגרום כשל חיסוני משולבים severe תסמונות 3,19,26, 27. EFSAM יוזם SOCE לאחר חישה Ca ER-luminal2 + דלדול דרך האובדן של Ca2 + תיאום הקנוני EF-היד, המוביל בסופו של דבר האגודה עצמית מצמידים הקשורה 7, 28,29.
גליקוזילציה הוא מצורף קוולנטיות עיבוד של פחמימה # מיון הפחמימות מבנים, הידוע גם בשם glycans, דרך השלבים השונים biosynthetic הוחלף נגזר ER, גולג'י (נבדקה ב 30,32,33). ישנם שני סוגי גליקוזילציה ב פרוקריוטים השולט: N-המקושר ו- O-מקושרים, בהתאם חומצת אמינו ספציפית אטום גישור ניגודים. ב- N- גליקוזילציה, glycans מחוברים את אמיד שרשרת הצד של Asn, ברוב המקרים, שלב החניכה מתרחשת בחדר המיון כמו מפוליפפטיד שרשרת נע לתוך לומן 34. הצעד הראשון גליקוזילציה - Nהוא ההעברה של מבנה ליבה 14-סוכר המורכב גלוקוז (Glc), מנוז (אדם) ו- N- acetylglucosamine (GlcNAc) (קרי Glc3איש9GlcNAc2) ממיון ממברנה השומנים על ידי 35,oligosaccharyltransferase36. צעדים נוספים, כגון מחשוף או העברה של גלוקוז משקעים, הן מזורז בחדר המיון glycosidases ספציפיות, glycosyltransferases. כמה חלבונים להשאיר בחדר המיון ולהעביר גולג'י יכול להיות עוד יותר מעובד 37. O- גליקוזילציה מתייחס התוספת של glycans, בדרך כלל אל קבוצת הידרוקסיל שרשרת הצד של שאריות Ser או חמישי, ומתרחשת שינוי זה לחלוטין ב 33,הגולגי34. ישנם מספר מבנים - glycan Oאשר יכול להיות מורכב של N- acetylglucosamine, fucose, גלקטוז, חומצה sialic עם כל חד-סוכר נוסף ברצף 33.
אמנם אין רצף מסוים זוהה תנאי הכרחי עבור סוגים רבים של O- גליקוזילציה, רצף קונצנזוס נפוצות נמצא קשור N-מקושרים השינוי: Asn-X-Ser/חמישי/Cys, שבו X יכול להיות כל חומצת אמינו רק Pro 33. STIM1 EFSAM מכיל את שני האתרים האלה - גליקוזילציה קונצנזוס N: Asn131-Trp132-Thr133 ו- Asn171-Thr172-Thr173. ואכן, מחקרים קודמים הראו כי EFSAM יכול להיות N- glycosylated בתרבית של תאים ב- Asn131 ו- Asn171 38,39,40,41. עם זאת, מחקרים קודמים ההשלכות של N- גליקוזילציה על SOCE היו incongruent, רומז מדוכא, potentiated או אין השפעה על ידי שינוי זה post-translational על SOCE ההפעלה 38,= "xref" >40,,3941. לפיכך, מחקר על ההשלכות biophysical, ביוכימי, מבניים הבסיסית של EFSAM N- גליקוזילציה חיוני כדי לגלות את ההשפעות הרגולציה של שינוי זה. עקב הדרישה לקבלת רמות גבוהות של חלבונים הומוגנית בניסויים אלה במבחנה , הוחל בגישה סלקטיבית באתר לצרף covalently גלוקוז moieties EFSAM. מעניין, Asn131 ו- Asn171 גליקוזילציה גרם לשינויים מבניים להתכנס בתוך תוכו EFSAM ולשפר את המאפיינים biophysical אשר לקדם בתיווך STIM1 SOCE 42.
הקובץ המצורף כימי של קבוצות glycosyl כדי Cys תיולים כבר ומבוססת על ידי עבודה הזרע אשר שהראו את התועלת של גישה זו ללא אנזים להבנת השפעת גליקוזילציה בייעודי לאתר על תפקוד החלבון 43 , 44. לאחרונה, ובעניין STIM1, משקעי Asn131 ו- Asn171 היו מוטציה כדי Cys ושימש glucose-5-(methanethiosulfonate) [glucose-5-(MTS)] כדי covalently לקישור גלוקוז חופשי תיולים 42. כאן, אנו מתארים גישה זו, אשר לא רק משתמשת מוטגנזה מכוונת לשלב באתר ספציפי Cys שאריות ולשנותן, אלא חל גם פתרון ספקטרוסקופיה תהודה מגנטית גרעינית (NMR) להעריך במהירות יעילות שינויים מבניים לפליטת כתוצאה גליקוזילציה. ראוי לציין, מתודולוגיה כללית זו ניתנת להתאמה בקלות לחקור את ההשפעות של או O- או N- גליקוזילציה של כל recombinantly מיוצר חלבון.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phusion DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>Use in step 1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Generuler 1kb DNA Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FERSM1163</td>
			<td>Use in step 1.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnI Restriction Enzyme</td>
			<td>New England Biolabs, Inc.</td>
			<td>R0176</td>
			<td>Use in step 1.8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Presto Mini Plasmid Kit</td>
			<td>GeneAid, Inc.</td>
			<td>PDH300</td>
			<td>Use in step 1.16.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 DE3 codon (+) E. coli</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>230280</td>
			<td>Use in step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH5a E. coli</td>
			<td>Invitrogen, Inc.</td>
			<td>18265017</td>
			<td>Use in step 1.9.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 mm Syringe Filter</td>
			<td>Millipore, Inc.</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td>Use in step 2.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisPur Ni2+-NTA Agarose Resin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88221</td>
			<td>Use in step 3.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,500 Da MWCO Dialysis Tubing</td>
			<td>BioDesign, Inc.</td>
			<td>D306</td>
			<td>Use in step 3.8, 3.16, 4.2, 4.5 and 4.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Thrombin</td>
			<td>BioPharm Laboratories, Inc.</td>
			<td>SKU91-055</td>
			<td>Use in step 3.9.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL HiTrap Q FF Anion Exchange Column</td>
			<td>GE Healthcare, Inc.</td>
			<td>17-5156-01</td>
			<td>Use in step 3.11.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-5-MTS</td>
			<td>Toronto Research Chemicals, Inc.</td>
			<td>G441000</td>
			<td>Use in step 4.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 20 Ultrafiltration Centrifugal Concentrators</td>
			<td>Sartorius, Inc.</td>
			<td>VS2001</td>
			<td>Use in step 3.11, 4.2, 4.5 and 4.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Unstained Broad Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26630</td>
			<td>Use in step 3.7, 3.10 and 3.15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Q FF Anion Exchange Column</td>
			<td>GE Healthcare, Inc.</td>
			<td>17-5053-01</td>
			<td>Use in step 3.12.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Pure Fast Protein Liquid Chromatrography System</td>
			<td>GE Healthcare, Inc.</td>
			<td>29018224</td>
			<td>Use in step 3.14.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>600 MHz Varian Inova NMR Spectrometer</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Use in step 5.2 and 5.5.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeting cysteine thiols for in vitro site-specific glycosylation of recombinant proteins

האינטראקציה סטרומה מולקולה-1 (STIM1) הוא סוג-אני טראנסממברנלי הממוקם על רשתית תוך-פלזמית (ER), ממברנות פלזמה (PM). ER-תושב STIM1 מווסת את הפעילות של ערוצי PM Orai1 בתהליך המכונה תאחסן המופעלים סידן (Ca2 +) זהו המנהל Ca2 + איתות התהליך שמניע את התגובה החיסונית. STIM1 עובר post-translational N- גליקוזילציה בשני אתרים Asn luminal בתוך Ca2 + חישה תחום של המולקולה. עם זאת, הביוכימי, biophysical, מבנה השפעות ביולוגיות של N- glycosylated STIM1 היו ממעטים להבין עד לאחרונה עקב חוסר יכולת להשיג בקלות רמות גבוהות של חלבון - glycosylated Nהומוגנית. כאן, אנו מתארים מימוש במבחנה כימית גישה שמתחבר גלוקוז moieties לאתרים חלבון ספציפי, החלים על הבנת ההשפעות הבסיסית של N- גליקוזילציה על מבנה החלבון ואת מנגנון. באמצעות פתרון תהודה מגנטית גרעינית ספקטרוסקופיה לנו להעריך הן יעילות של השינוי, כמו גם את ההשלכות מבנית של הקובץ המצורף גלוקוז עם דוגמה אחת. גישה זו ניתן להתאים בקלות ללמוד את החלבונים glycosylated הרבות המצויים בטבע.

הצעד הראשון של גישה זו מחייבת מוטגנזה מכוונת של שאריות גליקוזילציה המועמד אל שאריות Cys אשר ניתן לשינוי באמצעות EFSAM של גלוקוז-5-MTS. יש ללא שאריות Cys אנדוגני, אז אין שיקולים מיוחדים צריכים להיעשות לפני מוטגנזה מכוונת. עם זאת, שאריות Cys יליד חייב להיות מוטציה כדי משקעים שאינם לש...

Watch this Scientific Journal Video about Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins at JoVE.com

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

מכוונת ציסטאין תיולים במבחנה גליקוזילציה בייעודי לאתר של חומרים

ניתוחים הביוכימי ומבניים של חלבונים glycosylated דורשים כמויות גדולות יחסית של דגימות הומוגנית. כאן, אנו מציגים שיטה כימית יעילה עבור גליקוזילציה בייעודי לאתר של חומרים מטוהרים של חיידקים על ידי מיקוד תיולים Cys תגובתי.

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident ...

The overall goal of this procedure is to incorporate cysteine residues in proteins by site directed mutagenesis at natively glycosylated sites and employ in-vitro glucose attachment and assessment approaches to evaluate the efficiency and structural effects of glycosylation. This method can help answer key questions in the Structural Biology field such as, what are the structural consequences of protein glycosylation and how do these modifications affect the underlying mechanisms of function? The main advantages of this technique are that it is easily adaptable to study or handling glycosylation.It is highly efficient and both structure perturbations and efficiency can be rapidly assessed. The implications of this technique extend towards the therapy of diseases because altered glycosylation patterns have been associated with several cancers and neurodegenerative disorders. Though this method can provide insight into the effects of natively glycosylated proteins, it could also provide much needed information on how to alter glycosylation patterns may contribute to this range of diseases.To introduce a single cysteine mutation in the expression vector, prepare two individual PCR reaction tubes. In the first tube, add the forward mutagenic primer and in the second tube, add the reverse mutagenic primer. Add a final concentration of 1X PCR buffer to both the tubes.Then, set up a five cycle program for the two separate PCR reaction tubes. Add an extension time of seven and a half minutes at 72 degrees Celsius at the end of the fifth cycle. After the five cycles are completed, mix the two separate PCR reactions in a single tube, centrifuge the tube for about three seconds, and repeat an additional 20 cycles following the same PCR conditions.Next, run 15 microliters of the sample on a 1%DNA agarose gel at 120 Volts for 40 minutes. Then, immerse the gel in water containing 0.5 milligrams per milliliter ethidium bromide and shake it at room temperature for 30 minutes. Then, confirm the amplification of the template under UV light at 302 nanometers wavelength.After that, add 0.5 microliters of DPN1 restriction enzyme to the remaining 25 microliters of PCR reaction mix. Incubate the mix for two and a half hours at 37 degrees Celsius to digest the methylated template DNA. Then, add approximately five to 10 microliters of the digested mixture to 100 microliters of heat shock competent E.coli cells and incubate on ice for 60 minutes.Then, heat shock the cell-DNA mixture at 42 degrees Celsius for 45 seconds on a dry heat block. Then, immediately incubate the mixture on ice for three minutes. Next, add 900 microliters of LB broth to the cells and transfer the suspension into a sterile 14 milliliter round bottomed tube.Incubate at 37 degrees Celsius with constant shaking at 190 rpm for 90 minutes. Then, spread the centrifuged cell pellet on antibiotic supplemented agar plates. Incubate the plates at 37 degrees Celsius for 16 hours.The following day, aseptically inoculate a single colony from the plate into five milliliters of antibiotic supplemented LB medium. Then, grow the culture overnight at 37 degrees Celsius with constant shaking. Transform the cysteine residue mutated plasmid into E.coli cells via heat shock treatment, followed by growing the culture overnight in antibiotic supplemented LB medium.The next day, directly spread 150 microliters of cell suspension on kanamycin supplemented LB agar plates, and keep the plates for overnight incubation at 37 degrees Celsius. The following day, aseptically transfer a single colony in 20 milliliters of LB medium in an Erlenmeyer flask, and leave for overnight incubation at 37 degrees Celsius. The next day, transfer the overnight culture to a 50 milliliter conical tube.Then, pellet the cells by centrifuging the overnight liquid culture at 2, 400 times G for 15 minutes. Next, add 10 milliliters of M9 minimal medium to the cell pellet and then suspend the cellular mixture in one liter of M9 medium containing kanamycin. Keep growing the M9 liquid culture at 37 degrees Celsius with constant shaking at approximately 190 rpm until the optical density at 600 nanometers reaches approximately 0.6 to 0.8.Then, add 200 micromolar of IPTG to the M9 culture for inducing protein expression and leave the culture to grow overnight. The following day, pellet the bacterial cells from the overnight culture by centrifuging at approximately 10, 000 times G at four degrees Celsius for 30 minutes. Using a 10 milliliter motorized transfer pipette, homogenize the frozen bacterial cell pellet in approximately 40 milliliters of homogenization buffer.Then, incubate the homogenate in a hybridization oven for 90 minutes with constant rotation. Centrifuge the mixture at approximately 15, 000 times G at eight degrees Celsius for 40 minutes to separate the soluble protein fraction from the insoluble pellet. Then, add 50%volume by volume nickel nitrilotriacetic acid agarose bead slurry to the supernatant and incubate by inversion in the hybridization oven for 90 minutes at room temperature.Next, use a gravity flow protein purification column to collect the agarose beads with hexahistidine tagged protein attached to the nickel. Finally, wash the collected agarose beads three times. Elute the proteins in a series of two milliliter fractions.Next, confirm purified hexahistidine tagged protein in the eluted fractions by running a Coomassie blue stained SDS-PAGE gel. Pool the eluted protein fractions into a dialysis membrane with a 3, 500 daltons molecular weight cutoff and incubate in refolding buffer at four degrees Celsius overnight with magnetic stirring. Then, add approximately one unit of thrombin per milligram of protein to the pooled protein in the dialysis membrane and again incubate for one day at four degrees Celsius.The next day, remove the protein from the dialysis bag and concentrate it approximately tenfold using an ultrafiltration centrifugal concentrator with a 10, 000 daltons molecular weight cutoff. Subsequently, re-dilute the protein concentrate approximately 20-fold in sodium chloride-free refolding buffer. To purify the protein, load it on a prepacked anion-exchange column equilibrated with the same sodium chloride-free buffer.Begin eluting the proteins in a zero to 60%gradient of one molar sodium chloride containing refolding buffer. Transfer the pooled protein fractions into a dialysis bag. Conduct a dialysis step at four degrees Celsius overnight to exchange the protein into the experimental refolding buffer with the optimal molar concentration of sodium chloride.First, dialyze 1.5 milliliters of approximately 60 micromolar protein into one liter of modification buffer for glycosylation of protein. After 24 hours, at four degrees Celsius, transfer the modified protein into a microcentrifuge tube and add DMSO solubilized glucose-5-MTS to a final concentration of two millimolar. Gently tap the microcentrifuge tube every 10 minutes while incubating the sample in the dark for an hour in ambient temperature.After incubation, perform dialysis at four degrees Celsius to re-exchange the protein into the final experimental buffer. Measure the accurate mass of the protein using electrospray ionization mass spectrometry. Finally, use solution NMR to calculate the modification efficiency and identify the structural changes of glycosylated cys residues in the protein.A successful mutational PCR amplified template DNA is shown in this representative 1%DNA agarose gel. DNA ladder and an equivalent amount of template DNA that has not been amplified by PCR are used as controls in the gel. The topmost band with high intensity ethidium bromide staining shows the amplified template of the desired size.Next, the protein was purified using an anion-exchange column. The chromatogram shows an elution profile observed at 280 nanometers in blue exhibiting three peaks eluting against a sodium chloride gradient indicated in red with increasing concentration until 0.6 molar. The bottom panel shows a Coomassie blue stained SDS-PAGE gel of the protein fractions.Glycosylation of the cysteine residues was determined by electrospray ionization mass spectrometry. The chromatogram shows the masses of the unmodified and modified protein before and after glycosylation of the cysteine residue. For confirmation, solution NMR was performed showing the HSQC spectral overlay of the residue specific amide chemical shifts, indicating both modifications and structural perturbations of glycosylated protein.When it's mastered, all stages from mutagenesis to NMR assesment can be completed in approximately 12 days, excluding the wait time for primer synthesis, DNA sequencing, and mass spectroscopy services. While attempting this procedure, it's important to remember to assess the structural and biophysical effects of the cysteine mutations in the absence of the thiol modification as base line control measurements. Following this procedure, other methods such as stability, secondary structure, ion binding, protein-protein interaction assessments, can be performed to reveal how the biophysical properties of underlying protein functions are affected by glycosylation.After its development, this technique paved the way for researchers in the field of calcium signaling to individually and cumulatively assess the roles of asparagine 131 and asparagine 171 and glycosylation in stromal interaction molecule one calcium signaling associated with store operated calcium entry.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

דור של Arenavirus רקומביננטי לפיתוח חיסון בתאי Vero-FDA

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

ביטוי של חלבונים רקומביננטי hemagglutinin וNeuraminidase פונקציונליים מוירוס רומן H7N9 שפעת שימוש במערכת ביטוי baculovirus

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

ניטור העצרת של מופרש בקטריאלי ארסי פקטור שימוש Crosslinking אתר ספציפי

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Intranasal המינהל של החיסונים שפעת רקומביננטי במודלי כימרי עכבר ללמוד חסינות רירית

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

הערכת היעילות והרעילות של RNAs מיקוד ייצור HIV-1 לשימוש ב ג&#39;ין או טיפול תרופתי

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

מדידה<em&gt; במבחנה</em&gt; פעילות האינטגרציה של HIV-1 Preintegration מכלולים

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

Murine לימפוציטים תיוג ידי<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-נוגדן קולטן מיקוד עבור<em&gt; In vivo</em&gt; סחר Cell על ידי PET / CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

שיטות ויטרו להשוואת יעד מחייב CDC אינדוקציה בין נוגדנים טיפוליים: יישומים ניתוח Biosimilarity

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by ...

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

יצירת וקטורים ההרפס העופות רקומביננטי עם CRISPR/Cas9 ג'ין עריכה

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian ...

Separation of Rat Epidermis and Dermis with Thermolysin to Detect Site-Specific Inflammatory mRNA and Protein

הפרדת אפידרמיס ראט ודרמיס עם תרמוליסין לזיהוי mRNA וחלבון דלקתיים ספציפיים לאתר

Easy-to-use and inexpensive techniques are needed to determine the site-specific production of inflammatory mediators and neurotrophins during skin ...