Name: microrna based liquid biopsy: the experience of the plasma mirna signature classifier (msc) for lung cancer screening
Uploaded: 2017-10-26T13:00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier MSC for Lung Cancer Screening at JoVE.com

Авторы благодарят Paola Suatoni, Елена пульсоксиметры, Каролина Ninni, Annamaria Calanca, и Кьяра Банфи для обработки добровольцев в испытаниях и административной помощи; и Клаудио Jacomelli и Клаудио Citterio для управления данными. Работа была поддержана итальянской ассоциации по исследованию рака [следователь грантов № 15928 вверх, 14318 GS и 12162 (специальная программа «Инновационные инструменты для оценки риска рака и ранней диагностики», 5 x 1000)]; Итальянское Министерство здравоохранения [Грант № RF-2010]; Грант UO1 CA166905 Национальный институт рака (США). МБ была поддержана Fondazione Pezcoller стипендий.

протокол был одобрен Комитет по этике исследований нашего института.
 1. проб плазмы <ol><li>собирать 10 мл цельной крови образец Vacutainer пробирки с ЭДТА 2 K спрей покрытием и хранить при комнатной температуре. 
	Примечание: Для сведения к минимуму гемолиза, отдельные плазмы в течение 2 ч. Не храните цельной крови при низкой температуре (т.е., 4 ° C) во избежание теплового шока и мобильных лизиса, которые приводят к неспецифическим Мирна выпуска.</li>
	<li>В течение 1 ч, отделить плазмы первый шаг центрифугирования в 1258 x g и 4 ° C на 10 мин.</li>
	<li>Передачи супернатанта плазмы в 15 мл трубку, тщательно избегая контакта с лимфоцитарный кольцо.</li>
	<li>Центрифуга плазмы во второй раз в 1258 x g и 4 ° C на 10 мин.</li>
	<li>Аликвота 1 мл плазмы в 1,5 мл криопробирки, избегая сбор фракция плазмы на базе трубки.</li>
	<li>Хранить все аликвоты на &#8722; 80 ° C, за исключением одного, для оценки гемолиза. Молекулярный анализ должны быть выполнены в течение 5 недель.</li>
</ol> 2. Оценка гемолиза спектрофотометрические измерения <ol><li>сразу же после разделения шаг плазмы, в кювет для спектрофотометрия, сделать 1:10 разбавления образца плазмы в ПБС (например, 100 мкл плазмы в 900 мкл 1 X PBS) и смеси для гомогенизации it. 
	Примечание: Образец плазмы не должны быть заморожены, прежде чем спектрофотометрические измерения, как замораживание оттаивание образца (и, в частности в lipemic образцах), могли бы стать, Флоккулянты которые мешают спектрофотометрический анализ.</li>
	<li>Читать поглощения на 375 Нм, 414 Нм, 541 Нм и 576 Нм, используя Спектрофотометр UV-Vis, коррекция базовой линии поселились на 750 нм и длиной пути 10 мм. выполнить пустой измерения с использованием 1 мл ПБС.</li>
	<li>Расчет соотношения между поглощения в 414 Нм и 375 Нм; если выше 1.4, рассмотрим пример Опаковые и повторить снятие крови (QC1 в таблице 1).</li>
</ol> 3. Общая добыча РНК плазмы <ol><li>подготовить раствор 1-Thioglycerol/гомогенизации (OMG) с 20 мкл 1-Thioglycerol мл раствора гомогенизации. Поскольку 1-Thioglycerol вязкой, тщательно Пипетка для точного измерения. Холод OMG решение на льду или в 2-10 ° C перед использованием it. 
	Примечание: Рабочий раствор стабилен при температуре 2-10 ° C на 1 месяц.</li>
	<li>Приостановить лиофилизированные DNase я, добавив 275 мкл свободной от нуклеиназы воды в пробирку и осторожно перемешать (делать не вихрь). Как наглядное пособие, добавить 5 мкл синего красителя для воссоздания DNase I и распределять решение в одноразовых аликвоты в свободной от нуклеиназы трубы. Сохранять восстановленный DNase I на-30 ° C до -10 ° с.</li>
	<li>Начиная с 200 мкл плазмы, 200 мкл раствора охлажденные OMG.</li>
	<li>Водоворот 15-30 s для обеспечения полной гомогенизации. Если происходит вспенивание, пусть образец поселиться на льду</li>
	<li>Добавить 200 мкл буфера Lysis и 25 мкл протеиназы K гомогенизированных образцов и вихревые для 20 s.</li>
	<li>Инкубировать образцы для 15 мин в thermomixer разогретую на 37 ° C.</li>
	<li>Загрузка картриджа для каждого образца на палубе лоток документа и место штопфер в надлежащее положение.</li>
	<li>Передачи lysate соответствующей позиции инструмента картриджа в.</li>
	<li>Добавить 5 мкл DNase I решения в надлежащее положение картриджа в.</li>
	<li>Добавить 60 мкл нуклеиназы свободной воды на базе каждой трубы элюции.</li>
	<li>Выберите &#34; RSC Мирна ткани &#34; метод и начать автоматизированной очистки запуска. Общая образцов РНК может храниться в &#8722; 80 ° C.</li>
</ol> 4. На основе Taq RT <ol><li>использовать пул грунтовка RT Taq с адаптивной интерес для преобразования РНК в cDNA с Taq микроРНК вспять транскрипции Кит.</li>
	<li>Подготовить 12 мкл RT реакция смеси на льду в 1,5 мл трубки microcentrifuge согласно инструкциям, комплект, используя 6 мкл пользовательские бассейн грунтовка RT Taq.</li>
	<li>Добавить 3 мкл всего РНК окончательный объем 15 мкл и инкубировать во льду на 5 мин</li>
	<li>Загрузить реакции RT на термо велосипедист настроена следующим образом: 16 ° C в течение 30 мин, 42 ° C в течение 30 мин, 85 ° C за 5 мин и провести на 4 ° C. 
	Примечание: CDNA можно хранить при от -15 до-20 ° C для по крайней мере одной недели.</li>
</ol> 5. Предварительное усиление <ol><li>Mix 2,5 мкл каждого продукта RT с 12,5 мкл Taq Мастер микс 2 x, 3,75 мкл Custom Taq бассейн и 6,25 мкл нуклеиназы свободной воды, суммарный объем 25 мкл.</li>
	<li>Выполнять предварительное усиление реакции с помощью термо велосипедист согласно следующей тепловой профиля: 95 ° C в течение 10 мин, 55 ° C на 2 мин., 72 ° C на 2 мин, 12 циклов 95 ° c 15 s и 60 ° C в течение 4 мин , затем, удерживая на 99,9 ° C в течение 10 минут и 4 ° C.</li>
	<li>Разбавить продукт, добавив 175 мкл 0.1 X TE, рН 8.0. 
	Примечание: Разбавленного продукта может быть магазина в от -15 до-20 ° C для по крайней мере одной недели.</li>
</ol> 6. Реакции RT-ПЦР на пользовательских Taq массив микроРНК карты <ol><li>использования 384-ну microfluidicCustom Taq массив микроРНК карты для измерения плазменных уровней 24 конкретных интерферирующим (пятнистый в двух экземплярах) на 8 образцов одновременно. MiRBase ID (v21) для 24 интерферирующим являются: имеет мир-101-3 p, имеет мир 106А - 5p, имеет мир-126-3 p, p имеет мир 133а - 3p, имеет мир-140-3, имеет мир-140-5 p, имеет мир-142-3 p, имеет мир-145-5 p, имеет мир 148Б - 3p, имеет мир 15b - 5p, имеет мир-16-5 p, имеет мир-17-5 p, имеет мир-197-3 p, имеет мир 19б - 3p, имеет мир-21-5 p, имеет мир-221-3 p, имеет мир-28-3 p, имеет мир 30б - 5p, имеет мир - 30c - 5p, имеет мир 320a, имеет мир 451а, имеет мир-486-5 p, имеет мир-660-5 p и имеет мир 92a - 3p.</li>
	<li>Смесь 1.13 мкл разбавленного образца предусилитель с 56,25 мкл 2 X Taq универсальный Мастер микс и 55.69 мкл нуклеиназы свободной воды в 0,5 мл.</li>
	<li>Загрузки до 8 микс реакции ПЦР на пользовательских Taq массив микроРНК карты.</li>
	<li>Центрифуга на 311 x g на 2 мин</li>
	<li>Уплотнение пользовательские карты с массива карты sealer.</li>
	<li>Запуска в реальном времени реакции, с помощью системы PCR реального времени изменения Велоспорт параметров, как следует: 94.5 ° C в течение 10 мин, 40 циклов 97 ° c за 30 s и 59.7 ° C 60 s.</li>
</ol> 7. Экстраполяция данных и коэффициентов поколения <ol><li>использования программного обеспечения для получения необработанных значений Ct, установив Автоматическое вычитание базовой линии для удаления фона сигналов и фиксированный порог 0,15 для всех проб и образцов. Удалить пятна с бедных амплификации кривых и/или плохой пассивного ведения сигналов.</li>
	<li>Экспорт необработанных значений Ct в &#34; .xls &#34; формат и использовать Ct означает значение двух дубликатов для дальнейшего анализа.</li>
	<li>Коррелят интерферирующим &#39; уровни выражения для исторического измерения на образцах клинического исследования (Таблица 2). Если по крайней мере 50% проб на каждой карточке пользовательские сделал microfluidic Пирсон &#39; s корреляции &#60; 97,5, повторите карты (QC2 в таблице 1).</li>
	<li>Расчет &#8722; ΔCts между всеми адаптивной, эквивалентно log2 значения коэффициентов Мирна.</li>
</ol> 8. Оценка гемолиза похожие микроРНК подпись <ol><li>создать связанные с гемолизом Мирна подпись, используя следующие коэффициенты Мирна с соответствующими обрезков (log2 значения) для коротких хранения проб плазмы (1-5 недель в &#8722; 80 ° C): Мир-126/451 &#60; &#8722; 0,07, 15В/451 &#60; &#8722; 3.67, 221/451 &#60; &#8722; 3.18, 30б/451 &#60; &#8722; 1.1, 126/486-5p &#60; &#8722; 0,33, 15В/486-5 p &#60; &#8722; 3.86, 221/486-5 p &#60; &#8722; 3.17, 30б/486-5 p &#60; &#8722; 1.42, 126/92a &#60; 1.8, 15В/92a &#60; &#8722; 1.8, 221/92a &#60; &#8722; 1.04, 30б/92a &#60; 0,87, 126/16 &#60; &#8722; 2.85, 15В/16 &#60; &#8722; 6.33, 221/16 &#60; &#8722; 5.9, 30б/16 &#60; &#8722; 3.68.</li>
	<li>Классифицируются как опаковые образцы, где по крайней мере 50% соотношения (8 из 16) превышают соответствующие отсечения (QC3 в таблице 1).</li>
</ol> 9. Определение уровня риска: высокий, средний и низкий <ol><li>определить четыре подписи соотношений Мирна, составляющих MSC, как на рисунке 3: риск заболеваний (РР), риск заболевания (RAD), агрессивное присутствие болезнь (PD) и наличие агрессивной болезни (PAD).</li>
	<li>Для каждой подписи, определить соотношение превышает соответствующие порогового значения для коротких хранения проб плазмы (1-5 недель в &#8722; 80 ° C). Это число превышает показатели необходимо учитывать позитивные 9 из 27 RD и PD и 14 из 28 RAD и PAD ( рис A).</li>
	<li>Атрибут для каждого образца соответствующего уровня риска MSC следующим: низкий риск, если RD neg &#8745; PD neg &#8745; RAD neg &#8745; PAD neg; промежуточных риск если RD pos &#8746; PD pos &#8745; RAD NEG &#8745; PAD neg; или высокий риск если RAD pos &#8746; PAD pos ( рис. 3 B).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Statistics,+2017.">Cancer Statistics, 2017.</a> CA Cancer J Clin. 67 (1), 7-30 (2017).</li><li>Malvezzi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+cancer+mortality+predictions+for+the+year+2017,+with+focus+on+lung+cancer.">European cancer mortality predictions for the year 2017, with focus on lung cancer.</a> Ann Oncol. , 10 (2017).</li><li>Miller, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+treatment+and+survivorship+statistics,+2016.">Cancer treatment and survivorship statistics, 2016.</a> CA Cancer J Clin. 66 (4), 271-289 (2016).</li><li>Kanne, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+lung+cancer:+what+have+we+learned.">Screening for lung cancer: what have we learned.</a> AJR Am. J Roentgenol. 202 (3), 530-535 (2014).</li><li>Aberle, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+lung-cancer+mortality+with+low-dose+computed+tomographic+screening.">Reduced lung-cancer mortality with low-dose computed tomographic screening.</a> N Engl J Med. 365 (5), 395-409 (2011).</li><li>Wender, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=American+Cancer+Society+lung+cancer+screening+guidelines.">American Cancer Society lung cancer screening guidelines.</a> CA Cancer J Clin. 63 (2), 107-117 (2013).</li><li>Molina-Vila, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+Biopsy+in+Non-Small+Cell+Lung+Cancer.">Liquid Biopsy in Non-Small Cell Lung Cancer.</a> Front Med (Lausanne). , 69 (2016).</li><li>Sozzi, G., Boeri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+biomarkers+for+lung+cancer+screening.">Potential biomarkers for lung cancer screening.</a> Transl Lung Cancer Res. 3 (3), 139-148 (2014).</li><li>Shepherd, F. A., Douillard, J. Y., Blumenschein, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunotherapy+for+non-small+cell+lung+cancer:+novel+approaches+to+improve+patient+outcome.">Immunotherapy for non-small cell lung cancer: novel approaches to improve patient outcome.</a> J Thorac Oncol. 6 (10), 1763-1773 (2011).</li><li>Ajona, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+complement+activation+product+c4d+as+a+diagnostic+and+prognostic+biomarker+for+lung+cancer.">Investigation of complement activation product c4d as a diagnostic and prognostic biomarker for lung cancer.</a> J Natl Cancer Inst. 105 (18), 1385-1393 (2013).</li><li>Boyle, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+validation+of+an+autoantibody+test+for+lung+cancer.">Clinical validation of an autoantibody test for lung cancer.</a> Ann Oncol. 22 (2), 383-389 (2011).</li><li>Hayes, J., Peruzzi, P. P., Lawler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+cancer:+biomarkers,+functions+and+therapy.">MicroRNAs in cancer: biomarkers, functions and therapy.</a> Trends Mol Med. , (2014).</li><li>Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+and+consequences+of+microRNA+dysregulation+in+cancer.">Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer.</a> Nat Rev Genet. 10 (10), 704-714 (2009).</li><li>Iorio, M. V., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+dysregulation+in+cancer:+diagnostics,+monitoring+and+therapeutics.+A+comprehensive+review.">MicroRNA dysregulation in cancer: diagnostics, monitoring and therapeutics. A comprehensive review.</a> EMBO Mol Med. 4 (3), 143-159 (2012).</li><li>Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+relevance+of+circulating+cell-free+microRNAs+in+cancer.">Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer.</a> Nat Rev Clin Oncol. 11 (3), 145-156 (2014).</li><li>Mitchell, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+as+stable+blood-based+markers+for+cancer+detection.">Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (30), 10513-10518 (2008).</li><li>Hanke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+methodology+to+study+urine+microRNA+as+tumor+marker:+microRNA-126+and+microRNA-182+are+related+to+urinary+bladder+cancer.">A robust methodology to study urine microRNA as tumor marker: microRNA-126 and microRNA-182 are related to urinary bladder cancer.</a> Urol Oncol. 28 (6), 655-661 (2010).</li><li>Park, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+microRNA:+discovery,+characterization,+and+clinical+utility+for+oral+cancer+detection.">Salivary microRNA: discovery, characterization, and clinical utility for oral cancer detection.</a> Clin Cancer Res. 15 (17), 5473-5477 (2009).</li><li>Boeri, M., Pastorino, U., Sozzi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+microRNAs+in+lung+cancer:+microRNA+signatures+in+cancer+prognosis.">Role of microRNAs in lung cancer: microRNA signatures in cancer prognosis.</a> Cancer J. 18 (3), 268-274 (2012).</li><li>Castoldi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+array+for+microRNA+expression+profiling+(miChip)+based+on+locked+nucleic+acids+(LNA).">A sensitive array for microRNA expression profiling (miChip) based on locked nucleic acids (LNA).</a> RNA. 12 (5), 913-920 (2006).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantification+of+microRNAs+by+stem-loop+RT-PCR.">Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 33 (20), 179 (2005).</li><li>Schulte, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+sequencing+reveals+differential+expression+of+microRNAs+in+favorable+versus+unfavorable+neuroblastoma.">Deep sequencing reveals differential expression of microRNAs in favorable versus unfavorable neuroblastoma.</a> Nucleic Acids Res. 38 (17), 5919-5928 (2010).</li><li>Tiberio, P., Callari, M., Angeloni, V., Daidone, M. G., Appierto, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+using+circulating+miRNAs+as+cancer+biomarkers.">Challenges in using circulating miRNAs as cancer biomarkers.</a> Biomed Res Int. , 731479 (2015).</li><li>Boeri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+of+microRNA-based+molecular+diagnostics+to+reduce+false-positive+lung+cancer+imaging.">Recent advances of microRNA-based molecular diagnostics to reduce false-positive lung cancer imaging.</a> Expert Rev Mol Diagn. 15 (6), 801-813 (2015).</li><li>Benes, V., Castoldi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profiling+of+microRNA+using+real-time+quantitative+PCR,+how+to+use+it+and+what+is+available.">Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR, how to use it and what is available.</a> Methods. 50 (4), 244-249 (2010).</li><li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+quantitative+miRNA+expression+platforms+in+the+microRNA+quality+control+(miRQC)+study.">Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study.</a> Nat Methods. 11 (8), 809-815 (2014).</li><li>Pastorino, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+lung-cancer+detection+with+spiral+CT+and+positron+emission+tomography+in+heavy+smokers:+2-year+results.">Early lung-cancer detection with spiral CT and positron emission tomography in heavy smokers: 2-year results.</a> Lancet. 362 (9384), 593-597 (2003).</li><li>Boeri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+signatures+in+tissues+and+plasma+predict+development+and+prognosis+of+computed+tomography+detected+lung+cancer.">MicroRNA signatures in tissues and plasma predict development and prognosis of computed tomography detected lung cancer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (9), 3713-3718 (2011).</li><li>Sozzi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Utility+of+a+Plasma-Based+miRNA+Signature+Classifier+Within+Computed+Tomography+Lung+Cancer+Screening:+A+Correlative+MILD+Trial+Study.">Clinical Utility of a Plasma-Based miRNA Signature Classifier Within Computed Tomography Lung Cancer Screening: A Correlative MILD Trial Study.</a> J Clin Oncol. 32 (8), 768-773 (2014).</li><li>Pritchard, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+cell+origin+of+circulating+microRNAs:+a+cautionary+note+for+cancer+biomarker+studies.">Blood cell origin of circulating microRNAs: a cautionary note for cancer biomarker studies.</a> Cancer Prev Res (Phila). 5 (3), 492-497 (2012).</li><li>Kirschner, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemolysis+during+sample+preparation+alters+microRNA+content+of+plasma.">Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma.</a> PLoS One. 6 (9), 24145 (2011).</li><li>Kirschner, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+Hemolysis+on+Cell-Free+microRNA+Biomarkers.">The Impact of Hemolysis on Cell-Free microRNA Biomarkers.</a> Front Genet. 4 (94), (2013).</li><li>Fortunato, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+circulating+microRNAs+in+plasma+of+lung+cancer+patients.">Assessment of circulating microRNAs in plasma of lung cancer patients.</a> Molecules. 19 (3), 3038-3054 (2014).</li><li>Appierto, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lipemia-independent+NanoDrop((R))-based+score+to+identify+hemolysis+in+plasma+and+serum+samples.">A lipemia-independent NanoDrop((R))-based score to identify hemolysis in plasma and serum samples.</a> Bioanalysis. 6 (9), 1215-1226 (2014).</li><li>Kim, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+components+affect+accuracy+of+circulating+cancer-related+microRNA+quantitation.">Plasma components affect accuracy of circulating cancer-related microRNA quantitation.</a> J Mol Diagn. 14 (1), 71-80 (2012).</li><li>Kulstein, G., Marienfeld, R., Miltner, E., Wiegand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+of+DNA+and+miRNA+co-extraction+for+miRNA-based+identification+of+human+body+fluids+and+tissues.">Automation of DNA and miRNA co-extraction for miRNA-based identification of human body fluids and tissues.</a> Electrophoresis. 37 (21), 2742-2750 (2016).</li><li>Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+Normalization+Strategies+for+MicroRNA+Quantification.">Data Normalization Strategies for MicroRNA Quantification.</a> Clin Chem. 61 (11), 1333-1342 (2015).</li><li>Schlosser, K., McIntyre, L. A., White, R. J., Stewart, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Customized+Internal+Reference+Controls+for+Improved+Assessment+of+Circulating+MicroRNAs+in+Disease.">Customized Internal Reference Controls for Improved Assessment of Circulating MicroRNAs in Disease.</a> PLoS ONE. 10 (5), 0127443 (2015).</li><li>Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+circulating+microRNA+biomarkers+in+plasma+and+serum+using+quantitative+reverse+transcription-PCR+(qRT-PCR).">Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR).</a> Methods. 50 (4), 298-301 (2010).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+the+MicroRNA+spectrum+between+serum+and+plasma.">Comparing the MicroRNA spectrum between serum and plasma.</a> PLoS One. 7 (7), 41561 (2012).</li><li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+universal+method+for+microRNA+RT-qPCR+data+normalization.">A novel and universal method for microRNA RT-qPCR data normalization.</a> Genome Biol. 10 (6), 64 (2009).</li><li>Montani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-Test:+A+Blood+Test+for+Lung+Cancer+Early+Detection.">miR-Test: A Blood Test for Lung Cancer Early Detection.</a> J Natl Cancer Inst. 19 (6), 063 (2015).</li><li>Sestini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNA+signature+as+liquid-biopsy+to+monitor+lung+cancer+in+low-dose+computed+tomography+screening.">Circulating microRNA signature as liquid-biopsy to monitor lung cancer in low-dose computed tomography screening.</a> Oncotarget. 20 (32), 32868-32877 (2015).</li><li>Verri, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+Profile+from+Targeted+NGS+Predicts+Survival+in+LDCT+Screening-Detected+Lung+Cancers.">Mutational Profile from Targeted NGS Predicts Survival in LDCT Screening-Detected Lung Cancers.</a> J Thorac. Oncol. (17), 10 (2017).</li><li>Bianchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+serum+circulating+miRNA+diagnostic+test+to+identify+asymptomatic+high-risk+individuals+with+early+stage+lung+cancer.">A serum circulating miRNA diagnostic test to identify asymptomatic high-risk individuals with early stage lung cancer.</a> EMBO Mol Med. 3 (8), 495-503 (2011).</li><li>Gyoba, J., Shan, S., Roa, W., Bedard, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosing+Lung+Cancers+through+Examination+of+Micro-RNA+Biomarkers+in+Blood,+Plasma,+Serum+and+Sputum:+A+Review+and+Summary+of+Current+Literature.">Diagnosing Lung Cancers through Examination of Micro-RNA Biomarkers in Blood, Plasma, Serum and Sputum: A Review and Summary of Current Literature.</a> Int J Mol Sci. 17 (4), 494 (2016).</li></ol>

Gabriella Sozzi, Маттиа Boeri и Ugo Пасторино, Сопредседатель изобретателей три патентных заявок, лицензированных для наук о жизни Gensignia, относительно подписания Мирна, раскрыты в этой статье. Все остальные авторы заявляют отсутствие конфликта интересов в отношении работы, представленные.

Рак легких является наиболее часто диагноз рака во всем мире, приходится около 25% всех диагнозов рака1. Несмотря на неуклонное сокращение легких рака смертности за последние 2 десятилетия, главным образом вследствие сокращения табакокурения рака легкого остается ведущей причиной смерти от рака у мужчин и женщин. В 2017 году по прогнозам приходится приблизительно 25% и 20% всего случаев смерти от рака в Соединенных Штатах и Европе, соответственно,1,2.
Так как симптомы не возникают обычно в начале заболевания, большинство рака легких диагностируется на поздних стадиях. Это приводит к возможности ограничены для терапевтического вмешательства и плохой эффективности лечения3. Таким образом многие научные усилия направлены на определение эффективного тест для раннего обнаружения рака легких.
Разнообразие скрининговых исследований показывает, что рентгенография не имеет значения в легких скрининге рака, тогда как низкие дозы компьютерная томография (LDCT)-это средство лучше, по сравнению с рентгенография для обнаружения рака легких ранней стадии4. Кроме того было показано, что thatscreening с использованием LDCT сократить смертность от рака легких среди нынешние и бывшие курильщики5до 20%. Эти данные подтверждают использование скрининга рака легкого в популяции высокого риска, определенных в руководящих принципах по несколько профессиональных обществ4,6.
Следует отметить, что среди основных проблем о LDCT скрининг является высокий уровень ложно положительных результатов и чрезмерной диагноз. Что таким образом, научное сообщество ищет стратегию для преодоления этих проблем и увеличения специфичности LDCT скрининг-теста. Разработка неинвазивных взаимодополняющих биомаркеров может быть полезным здесь. На сегодняшний день, существует обширный список кандидата биомаркеров под следствием, например адаптивной, свободных клеток ДНК, Джин метилирования, маленькие белки и другие7.
На основе крови биомаркеров, включая Биомаркеры иммунный ответ и циркулирующих адаптивной, являются те, которые достигают более продвинутые стадии проверки8. Иммунный ответ биомаркеров основаны на знании, что иммунный ответ против обоих внутриклеточные и поверхности опухолевых антигенов встроены в больных раком легких9. К примеру, Ajona и др. оценку роли C4d, продуктом разложения классической дополнением путь в диагностике и прогнозе рака легких10. В противном случае коммерчески доступных аутоантител сыворотки тест, изучение семь связанных с опухолевых антигенов проверяются в немелкоклеточного больных раком легкого и показал 36% чувствительность и специфичность1191%. Иммунный ответ биомаркеров интересны, но необходимы дальнейшие исследования проверки для потенциальных клинического применения.
интерферирующим являются эндогенные малые некодирующих РНК с сохраняется механизм и большой функциональную значимость всего животного и растительного царства. Роль адаптивной заключается в регулировании белка перевод: они подавляют выражение большого набора целевых генов12. Он хорошо задокументировано что выражение ofmiRNAs изменения внести вклад в патогенезе большинства человеческих рака12,,1314. Кроме того опухоль и стромальные клетки релиз адаптивной, стабилизируемых путем их включения в микровезикулы или через ассоциацию для RNA-связывая протеинов, в жидкостях организма, например, сыворотки и плазмы15,16, моча17 и слюна18. Циркулирующих интерферирующим может таким образом отражать принимающей ответ и динамического взаимодействия между опухоли и ее микроокружения19. Вместе взятые эти замечания сделали циркулирующего интерферирующим перспективных класса биомаркеров для обнаружения рака человека.
Циркулирующих интерферирующим могут быть обнаружены с помощью различных методов: microarray платформ20, количественные обратной транскрипции ПЦР (RT-ПЦР)21и следующего поколения последовательности (НГС)14,22. В последние годы были разработаны различные исследования профиль выражение, на основе вышеупомянутых технологий. Microarray — это технология высокой пропускной способности, возможность анализировать до тысячи интерферирующим в один единый assay. Однако он имеет меньше динамический диапазон и специфичностью, по сравнению с RT-ПЦР или NGS. Кроме того microarray является не количественный метод, поэтому далее экспериментальная проверка не требуется. Методы на основе последовательности можно разрешить идентификации неизвестных адаптивной и подходят особенно в фазу обнаружения. С другой стороны NGS методы все еще дорого и требует специального оборудования и экспертов биоинформатики, тем самым ограничивая их использования в больших проверки когорты и в клинических условиях23. На данный момент RT-ПЦР является наиболее принимается платформой для циркулирующих Мирна обнаружения в диагностический/клинические контексте24. Существуют различные технологии RT-ПЦР для адаптивной анализа, но стебель петля RT, следуют TaqMan PCR является наиболее широко используемым25. Этот метод является чрезвычайно чувствительным и точным (одного нуклеотида дискриминации) и имеет высокий динамический диапазон; Однако это позволяет обнаружение известных интерферирующим только.
Контроль качества микроРНК исследование (miRQC исследование), Местдагом, et al. широко исследованы характеристики некоторых коммерчески доступных платформ для адаптивной профилирование, основанное на трех вышеупомянутых технологий26. Анализируя 196 интерферирующим в образцах сыворотки крови и тканей, производительность различных платформ был оценивать с точки зрения воспроизводимости, чувствительность, точность, специфика и согласование дифференциальных выражения. Результаты показали, что платформ на основе NGS и технологии microarray дна имели более высокую воспроизводимость и специфичности, но RT-ПЦР платформ были более точные, чувствительной и имели более высокий уровень обнаружения, особенно для низкого входного РНК образцов, таких как тело жидкости. Таким образом RT-ПЦР, как представляется, наиболее подходящим методом для возможного применения в повседневной клинической диагностики.
В 2011 году Sozzi et al. проанализировали Мирна профиля плазмы, пробах добровольцев, зачисленных в первый LDCT screeningtrial (INT-НОО суда)27 и четыре подписи Мирна, составленный взаимные отношения среди 24 циркулирующих адаптивной были созданы. Эти подписи были способен различать заболевания освободить людей от пациентов с любым или смертоносного рака легких на время или до 2 лет до обнаружения болезни LDCT28. В еще один документ, той же группы, описанные в первый раз Мирна подпись классификатора (MSC), полученные путем объединения четырех Мирна подписей для того, чтобы стратифицировать пациентов в трех уровнях риска: высокого, среднего и низкого. Его клинической полезности был апробирован в большой ретроспективной набор более чем 1000 лиц, обучающихся в процессе мягкая скрининга, рандомизированное исследование, сравнивающее ежегодных или двухгодичных LDCT оружия с рукой наблюдения29. Действительно сочетание MSC и LDCT снизил ставку ложно положительных LDCT, около 5 раз и были три группы риска MSCсвязанные с общей выживаемости.
Позже, в 2013 году в «Фондом IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori» (Милан, она) перспективных скрининг суда (BioMILD) реализации LDCT с плазмой, на основе MSC тест был запущен. Добровольцы, поступил в BioMILD суда проходят LDCT и крови вывода, который обрабатывается немедленно для разделения плазмы для Мирна, профилирование с помощью пользовательских сделал microfluidic карт. Сочетание LDCT и MSC результатов определяет конкретные скрининг алгоритм24.
В настоящей работе описан весь методологических протокол, используемый в процессе BioMILD, начиная от сбора образцов крови, плазмы изоляции, извлечение RNA, и выражение 24 адаптивной, профилирование с помощью пользовательских сделал RT-ПЦР microfluidic карт. Учитывая высокую согласованность и воспроизводимость, эти процедуры могут также использоваться для разработки на основе Мирна жидкого биопсии при других заболеваниях.

<table style="border-collapse:collapse;width:570pt" width="760">
	<colgroup>
		<col style="width:162pt" width="216" />
		<col style="width:122pt" width="162" />
		<col style="width:89pt" width="119" />
		<col style="width:197pt" width="263" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl25" height="21" style="width:162pt;height:15.75pt" width="216">&#160;1x PBS&#160;</td>
			<td class="xl26" style="width:122pt" width="162">Lonza</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">BE-17-516</td>
			<td class="xl23" style="width:197pt" width="263"></td>
		</tr>
		<tr height="63" style="height:47.25pt">
			<td class="xl21" height="63" style="width:162pt;height:47.25pt" width="216">20xTE Buffer, pH 8.0</td>
			<td class="xl26" style="width:122pt" width="162">Molecular probe</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">T11493</td>
			<td class="xl22" style="width:197pt" width="263">Dilute the 20X stock solution to have the final concentration of&#160; 0,1X in Nuclease-free water</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:162pt;height:15.75pt" width="216">Nuclease-free water&#160;</td>
			<td class="xl26" style="width:122pt" width="162"></td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119"></td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="126" style="height:94.5pt">
			<td class="xl21" height="126" style="width:162pt;height:94.5pt" width="216">Maxwell RSC miRNA Tissue Kit&#160;</td>
			<td class="xl26" style="width:122pt" width="162">Promega</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">AS1460</td>
			<td class="xl21" style="width:197pt" width="263">The kit contains Homogenization Solution, DNase I, Proteinase K, Lysis Buffer and cartridges. For 1-Thioglycerol, inhalation and contact with skin and eyes should be avoided. Use it under a Fume Cabinet.</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl21" height="42" style="width:162pt;height:31.5pt" width="216">TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit&#160;</td>
			<td class="xl22" style="width:122pt" width="162">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">4366596</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl21" height="42" style="width:162pt;height:31.5pt" width="216">Custom TaqMan RT Primer Pool&#160;</td>
			<td class="xl22" style="width:122pt" width="162">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">4459649</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl21" height="42" style="width:162pt;height:31.5pt" width="216">TaqMan PreAmp Master Mix 2X&#160;</td>
			<td class="xl22" style="width:122pt" width="162">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">4391128</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:162pt;height:15.75pt" width="216">Custom TaqMan&#160; PreAmp pool&#160;</td>
			<td class="xl22" style="width:122pt" width="162">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">4459657</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl21" height="42" style="width:162pt;height:31.5pt" width="216">TaqMan Universal Master Mix II, No UNG 2x&#160;</td>
			<td class="xl22" style="width:122pt" width="162">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">4440048</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="63" style="height:47.25pt">
			<td class="xl21" height="63" style="width:162pt;height:47.25pt" width="216">Custom TaqMan Array MicroRNA Cards&#160;</td>
			<td class="xl22" style="width:122pt" width="162">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">4449137</td>
			<td class="xl22" style="width:197pt" width="263">Bring the Custom TaqMan Array MicroRNA Cards to room temperature before to load samples</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl21" height="42" style="width:162pt;height:31.5pt" width="216">Vacutainer Safety-Lock Blood Collection Set&#160;</td>
			<td class="xl26" style="width:122pt" width="162">Becton Dickinson</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">367286-364815</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="46" style="height:34.5pt">
			<td class="xl21" height="46" style="width:162pt;height:34.5pt" width="216">Vacutainer plastic spray-coated K2EDTA tube.&#160;</td>
			<td class="xl26" style="width:122pt" width="162">Becton Dickinson</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">366643</td>
			<td class="xl23">Lavender BD Hemogard closure&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:162pt;height:15.75pt" width="216">Cuvette PS semi-micro&#160;</td>
			<td class="xl22" style="width:122pt" width="162">VWR/PBI</td>
			<td class="xl22" style="width:89pt" width="119">&#160;643-0326</td>
			<td class="xl23">Light path 10 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl21" height="42" style="width:162pt;height:31.5pt" width="216">NanoDrop 2000c UV-VIS Spectrophotometer</td>
			<td class="xl22" style="width:122pt" width="162">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl22" style="width:89pt" width="119"></td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:162pt;height:15.75pt" width="216">Cryogenic vials 1.5 ml&#160;</td>
			<td class="xl22" style="width:122pt" width="162">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl22" style="width:89pt" width="119">Z359033</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl21" height="42" style="width:162pt;height:31.5pt" width="216">Centrifuge 5810R&#160;</td>
			<td class="xl22" style="width:122pt" width="162">Eppendorf</td>
			<td class="xl22" style="width:89pt" width="119"></td>
			<td class="xl24" style="width:197pt" width="263">Bring the centrifuge to 4 &#176;C before starting plasma collection</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl21" height="42" style="width:162pt;height:31.5pt" width="216">Heraeus Multifuge 3S+ Centrifuge</td>
			<td class="xl22" style="width:122pt" width="162">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl22" style="width:89pt" width="119">D-37520</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:162pt;height:15.75pt" width="216">Vortex Mixer</td>
			<td class="xl22" style="width:122pt" width="162">Velp Scientifica</td>
			<td class="xl22" style="width:89pt" width="119">F202A0173</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl21" height="42" style="width:162pt;height:31.5pt" width="216">ThermoMixer T- shaker</td>
			<td class="xl23">Euroclone&#160;</td>
			<td class="xl23">A00564</td>
			<td class="xl28" style="width:197pt" width="263">Bring the Thermo Mixer to 37 &#176;C before starting RNA&#160; extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:162pt;height:15.75pt" width="216">Maxwell RSC Instrument</td>
			<td class="xl22" style="width:122pt" width="162">Promega</td>
			<td class="xl22" style="width:89pt" width="119">AS4500</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl21" height="42" style="width:162pt;height:31.5pt" width="216">GeneAmp PCR System 9700 thermo-cycler&#160;</td>
			<td class="xl22" style="width:122pt" width="162">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl22" style="width:89pt" width="119"></td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:162pt;height:15.75pt" width="216">ViiA 7 Real-Time PCR System&#160;</td>
			<td class="xl22" style="width:122pt" width="162">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl22" style="width:89pt" width="119"></td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:162pt;height:15.75pt" width="216">ViiA 7 RUO software&#160;</td>
			<td class="xl22" style="width:122pt" width="162">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl22" style="width:89pt" width="119"></td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:162pt;height:15.75pt" width="216">Arrey Card Staker/Sealer</td>
			<td class="xl22" style="width:122pt" width="162">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">4331770</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microrna based liquid biopsy: the experience of the plasma mirna signature classifier (msc) for lung cancer screening

Развитие малоинвазивных теста, например жидких биопсии, для раннего обнаружения рака легких на доклинической стадии важно улучшить исход этой смертельной болезни. МикроРНК (интерферирующим) являются ткани конкретные, маленькие, некодирующих РНК, регулировании экспрессии генов, которые могут выступать в качестве посыльных внеклеточных сигналов биологических производный от перекрестных помех между опухолью и его окружающие микроокружения. Они могут таким образом представляют собой идеальные кандидаты для раннего выявления рака легких. В этой работе предлагается методологических рабочего процесса для проверки потенциальных циркулирующего Мирна теста с помощью пользовательских сделал microfluidic карты и количественного PCR реального времени в образцах плазмы добровольцев, поступил в легких рака, скрининг суда. Кроме того поскольку освобождение связанных с гемолизом адаптивной и более общие технические вопросы могут повлиять на анализ, также представлены меры контроля качества, включены в стандартные оперативные процедуры. Протокол воспроизводимость и дает надежные количественные результаты; Однако при использовании больших клинических серии, предварительно аналитическую и аналитические функции следует осторожно оценивать.

BioMILD суд-проспективное исследование для раннего обнаружения рака легких с целью тестирования эффективности комбинированного подхода LDCT-MSC в качестве первой линии скрининговых тестов в большой когорты лиц, заядлый курильщик. Класс риска приписывается каждого из добровольцев на основе Мирна тест, который оценивает соотношения между 24 интерферирующим циркулирующей плазмы. Как основном сообщил30,,3132гемолиз является одним из важнейших вопросов для анализа оборотных Мирна, так как ложные результаты могут быть получены за счет неспецифического релиз интерферирующим клеток крови. В рабочем процессе предлагаемой методологии, предварительно аналитического контроля качества шаг (QC1 в таблице 1) для выявления Опаковые, и таким образом не анализируемые, образцы плазмы был описан. Рисунок 1 сообщает спектрофотометрический анализ Опаковые (рис. 1А) и не опаковые образцы плазмы (рис. 1Б) с соответствующими значениями A414/A375. В клинических условиях были результатом молекулярной теста имеет решающее значение для управления добровольцами, этот QC1 позволяет повторять проб крови и, в большинстве случаев восстановление образца.
После молекулярной обработки, RT-ПЦР производительности должно оцениваться точно определить любые технические вопросы. Рисунок 2 A показывает RT-ПЦР с низкой производительности из-за плохой пассивной опорного сигнала. В этом случае перезагрузка предварительного усиления продукта на новую карту microfluidic рекомендуется. Когда RT-ПЦР выполняет хорошо, как показано на рисунке 2B, карта переходит к первому шагу пост аналитического контроля качества для обеспечения сопоставимости с историческое измерение значения выражений Мирна (QC2 в таблице 1). Если QC2 шаг завершился с ошибкой, техническая проблема, произошедших во время обратной транскрипции или предварительное усиление реакции, и это удобно повторить весь молекулярной обработки, начиная с обратной транскрипции.
Последний этап контроля качества (QC3 в таблице 1) оценивает гемолиз также на молекулярном уровне. Уровни выражения 4 эритроцитов конкретных интерферирующим (мир-16, мир-451, мир-486-5 p и мир 92a) были по сравнению к тому из 4 связанных интерферирующим не гемолиз (мир-126, мир 15b, мир-221 и мир 30б), генерации подписи связанных с гемолизом Мирна составленный 16 (4 x 4) коэффициенты Мирна. Положительные образцы классифицируются как Опаковые, в то время как негативные примеры приступить к окончательной классификации уровня риска MSC, как описано в раздел 9 протокол и на рисунке 3.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56326/56326fig1.jpg"> 
Рисунок 1: Спектрофотометрический анализ образцов свежей плазмы. Спектрофотометрические профили (A) 2 Опаковые и (B) 2 плазмы не опаковые образцы, измерения оптической плотности соотношение волн A414 и A375. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56326/56326fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56326/56326fig2.jpg"> 
Рисунок 2 : RT-ПЦР производительности в microfluidic карт анализа. Усилители и многокомпонентные участков бедных сравнения (A) и (B) хорошего качества microfluidic карты. Все 24 адаптивной и одного примера Мирна сообщается в каждой панели. Многокомпонентных участки иллюстрируют сигналы пассивного ссылки, происходящих в этих реакциях RT-ПЦР. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56326/56326fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56326/56326fig3.jpg"> 
Рисунок 3: MSC алгоритм для стратификации риска. Представитель результаты с учетом 6 образцы плазмы из добровольцев поступил в BioMILD скрининг судебного разбирательства. (A) подписи Мирна коэффициенты риска заболеваний (РР), риск заболевания агрессивных (RAD), наличие болезни (PD), присутствие агрессивных болезни (PAD) и соответствующих пороговых значений (log2) для образцов плазмы, температуре-80 ° C для наименее 1 неделю и до 5 недель. (B) сочетание четырех подписей для стратификации Анализируемые образцы в высоком (H), средний (I) и низкого MSC (L) уровень риска. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56326/56326fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier MSC for Lung Cancer Screening at JoVE.com

MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier MSC for Lung Cancer Screening

Здесь мы представляем подробный протокол, принятый в BioMILD скрининг суда для выполнения циркулирующего микроРНК подпись классификатор тест для раннего обнаружения рака легких.

МикроРНК основе жидкого биопсия: Опыт плазмы Мирна подпись классификатора (MSC) для скрининга рака легких

The development of a minimally invasive test, such as liquid biopsy, for early lung cancer detection in its preclinical phase is crucial to improve the ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier (MSC) for Lung Cancer Screening

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Использование функциональной геномики скрининг для выявления потенциально новых целей наркотиком в сфероида культур раковых клеток

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

Потока на основе цитометрии наркотиков скрининг системы для идентификации малых молекул, которые способствуют клеточной дифференцировки стволовых клеток глиобластомы

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

Практические соображения в изучении метастатического легких колонизации в остеосаркома, используя Assay легочных метастазов

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

Создание колонизации Assay легких для циркулирующих визуализации опухолевых клеток в тканях легких

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

Упругое окрашивание на параффиновые слайды ткани рака желудка pT3N0M0

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Использование человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток для поколения опухолевых антигенов конкретных Т-клеток

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Perfusion and Inflation of the Mouse Lung for Tumor Histology

Перфузия и инфляция мышиного легкого для гистологии опухолей

The ability to evaluate lung histology is critical for the fields of lung cancer research and cancer metastasis. It is equally important to perform ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Патологический анализ метастазирования в легкие после инъекции опухолевых клеток в латеральную хвостовую вену

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Modeling Brain Metastases Through Intracranial Injection and Magnetic Resonance Imaging

Моделирование метастазов мозга через внутричерепную инъекцию и магнитно-резонансную томографию

Metastatic spread of cancer is an unfortunate consequence of disease progression, aggressive cancer subtypes, and/or late diagnosis. Brain metastases are ...

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

Обнаружение ДНК без клеток в образцах плазмы крови онкологических больных

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...