Name: detection of rare mutations in ctdna using next generation sequencing
Uploaded: 2017-08-24T15:00:00
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ट्यूमर नमूनों और रक्त के नमूनों को पेकिंग विश्वविद्यालय के पीपुल्स & #39; एस अस्पताल की एथिक्स कमेटी द्वारा अनुमोदित एक प्रोटोकॉल के अनुसार प्राप्त किया गया. मरीजों से उनके नमूनों का उपयोग करने के लिए ?...

<ol>
	<li>Kennedy, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+ultralow-frequency+mutations+by+Duplex+Sequencing.">Detecting ultralow-frequency mutations by Duplex Sequencing.</a> Nat. Protoc. 9, 2586-2606 (2014).</li><li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+DNA+sequencing.">Next-generation DNA sequencing.</a> Nat Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).</li><li>Bettegowda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+circulating+tumor+DNA+in+early-+and+late-stage+human+malignancies.">Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies.</a> Sci. Transl. Med. 6, (2014).</li><li>Bratman, S. 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Diagn. 13, 74-84 (2011).</li><li>Kukita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-fidelity+target+sequencing+of+individual+molecules+identified+using+barcode+sequences:+de+novo+detection+and+absolute+quantitation+of+mutations+in+plasma+cell-free+DNA+from+cancer+patients.">High-fidelity target sequencing of individual molecules identified using barcode sequences: de novo detection and absolute quantitation of mutations in plasma cell-free DNA from cancer patients.</a> DNA Res. 22, 269-277 (2015).</li><li>Schmitt, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequencing+small+genomic+targets+with+high+efficiency+and+extreme+accuracy.">Sequencing small genomic targets with high efficiency and extreme accuracy.</a> Nat. Methods. 12, 423-425 (2015).</li><li>Schmitt, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+ultra-rare+mutations+by+next-generation+sequencing.">Detection of ultra-rare mutations by next-generation sequencing.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 14508-14513 (2012).</li><li>Newman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrasensitive+method+for+quantitating+circulating+tumor+DNA+with+broad+patient+coverage.">An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage.</a> Nat. Med. 20, 548-554 (2014).</li><li>Newman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+digital+error+suppression+for+improved+detection+of+circulating+tumor+DNA.">Integrated digital error suppression for improved detection of circulating tumor DNA.</a> Nat Biotechnol. 34 (5), 547-555 (2016).</li><li>Alix-Panabie&#768;res, C., Schwarzenbach, H., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+and+circulating+tumor+DNA.">Circulating tumor cells and circulating tumor DNA.</a> Annu. Rev. Med. 63, 199-215 (2012).</li><li>Dawson, S. 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Transl. Med. 4, (2012).</li><li>Kobayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFR+mutation+and+resistance+of+non-small-cell+lung+cancer+to+gefitinib.">EGFR mutation and resistance of non-small-cell lung cancer to gefitinib.</a> N. Engl. J. Med. 352, 786-792 (2005).</li><li>Kuang, Y., Rogers, A., Yeap, Y., Wang, L., Makrigiorgos, M., Vetrand, K., Thiede, S., Distel, R. J., Ja&#776;nne, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+detection+of+EGFR+T790M+in+gefitinib+or+erlotinib+resistant+non-small+cell+lung+cancer.">Noninvasive detection of EGFR T790M in gefitinib or erlotinib resistant non-small cell lung cancer.</a> Clin. Cancer Res. 15, 2630-2636 (2009).</li><li>Taniguchi, K., Uchida, J., Nishino, K., Kumagai, T., Okuyama, T., Okami, J., Higashiyama, M., Kodama, K., Imamura, F., Kato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+detection+of+EGFR+mutations+in+circulating+tumor+DNA+derived+from+lung+adenocarcinomas.">Quantitative detection of EGFR mutations in circulating tumor DNA derived from lung adenocarcinomas.</a> Clin. Cancer Res. 17, 7808-7815 (2011).</li><li>Leary, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+personalized+tumor+biomarkers+using+massively+parallel+sequencing.">Development of personalized tumor biomarkers using massively parallel sequencing.</a> Sci. Transl. Med. 2, (2010).</li><li>Forshew, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+identification+and+monitoring+of+cancer+mutations+by+targeted+deep+sequencing+of+plasma+DNA.">Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA.</a> Sci. Transl. Med. 4, (2012).</li><li>Bratman, S. V., Newman, A. M., Alizadeh, A. A., Diehn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+clinical+utility+of+ultrasensitive+circulating+tumor+DNA+detection+with+CAPP-Seq.">Potential clinical utility of ultrasensitive circulating tumor DNA detection with CAPP-Seq.</a> Expert Rev. Mol. Diagn. 15, 715-719 (2015).</li></ol>

परिसंचारी ट्यूमर डीएनए (ctDNA) के अस्तित्व से अधिक 30 साल पहले की खोज की थी, लेकिन ctDNA विश्लेषण के आवेदन अभी भी नैदानिक अभ्यास में नियमित नहीं है । ctDNA तरीकों के व्यावहारिक अनुप्रयोग में ब्याज ctDNA का पता लगाने और ?...

अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (NGS), जीनोम के रहस्यों की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण, आनुवंशिक परिवर्तन प्रकट हो सकता है, जो जानकारी की एक बड़ी मात्रा में प्रदान कर सकते हैं । क्लिनिक में NGS विश्लेषण के आवेदन विशेष रूप से व्यक्तिगत चिकित्सा के लिए, अधिक आम हो गया है । NGS की सबसे बड़ी सीमाओं में से एक, तथापि, एक उच्च त्रुटि दर है । हालांकि यह विरासत में मिला उत्परिवर्तनों के अध्ययन के लिए उपयुक्त समझा जाता है, दुर्लभ उत्परिवर्तनों के विश्लेषण बहुत1,2सीमित है, खासकर जब एक "तरल बायोप्सी" से प्राप्त डीएनए का विश्लेषण ।
ट्यूमर डीएनए (ctDNA) परिचालित ट्यूमर कोशिकाओं से बहाया जाता है कि रक्त में सेल मुक्त डीएनए (cfDNA) है । ज्यादातर मामलों में, ctDNA की मात्रा बेहद कम है, जो इसका पता लगाने और विश्लेषण बहुत चुनौतीपूर्ण बनाते हैं । हालांकि, ctDNA कई आकर्षक विशेषताएं हैं: इसका अलगाव न्यूनतम इनवेसिव है, यह ट्यूमर के विकास के प्रारंभिक दौर में पता लगाया जा सकता है, ctDNA स्तर चिकित्सकीय दक्षता को दर्शाता है, और ctDNA दोनों प्राथमिक और मेटास्टेटिक घावों में पाया डीएनए उत्परिवर्तनों शामिल 3 , 4 , 5. इसलिए, NGS तकनीक और विश्लेषण के तेजी से विकास को देखते हुए, ctDNA का पता लगाने के आवेदन और अधिक आकर्षक हो गया है ।
विभिन्न बड़े पैमाने पर समानांतर अनुक्रमण दृष्टिकोण ctDNA का पता लगाने के लिए उपयोग किया गया है लेकिन इन तरीकों में से कोई भी उनकी सीमाओं के कारण क्लीनिक में नियमित उपयोग के लिए स्वीकार किया गया है: कम संवेदनशीलता, बहुमुखी प्रतिभा की कमी है, और एक अपेक्षाकृत उच्च लागत6 ,7,8. उदाहरण के लिए, डुप्लेक्स अनुक्रमण, एक अनन्य पहचानकर्ता टैग (UID) के आधार पर, बार-बार आम सहमति में त्रुटियों को सुधारता है, अधिकांश sequencing त्रुटियों को सुधारने । हालांकि, इस पद्धति की व्यवहार्यता अपनी उच्च लागत और कम डेटा के उपयोग के कारण9,10खो दिया है । इसी प्रकार, छाया-Seq और इसके सुधारात्मक पुनरावृत्ति, छाया-इडस11,12, cfDNA डिटेक्शन में अधिक से अधिक व्यावहारिकता है, हालांकि इन पद्धतियों की सटीकता और सार्वभौमिकता में सुधार की आवश्यकता है ।
सटीक ctDNA का पता लगाने और विश्लेषण के लिए वर्तमान की जरूरत को पूरा करने के लिए, हम एक नई रणनीति विकसित, दुर्लभ उत्परिवर्तन अनुक्रमण (एर-Seq) को समृद्ध । यह प्रकिया निम्न को संयोजित करता है: अद्वितीय sequencing एडाप्टर ctDNA अणुओं को कुशलतापूर्वक पुनर्प्राप्त करने के लिए, द्वि-दिशा त्रुटि सुधार और & #62 से बाहर एक एकल उत्परिवर्तन को अलग करने की क्षमता के साथ; 1 × 107 वाइल्ड-टाइप न्यूक्लियोटाइड; १०२१ kb की जांच जो लक्ष्य क्षेत्रों है कि ट्यूमर से संबंधित उत्परिवर्तनों के ९५% से अधिक कवर के माप को समृद्ध 12 ट्यूमर, फेफड़ों के कैंसर सहित, कोलोरेक्टल कैंसर, गैस्ट्रिक कैंसर, स्तन कैंसर, गुर्दे के कैंसर, अग्नाशय के कैंसर, लीवर कैंसर, थायराइड कैंसर, गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर, कैंसर, और एंडोमेट्रियल कार्सिनोमा (तालिका 1); और आधारभूत डाटाबेस यह कुशल और ठीक ctDNA में दुर्लभ उत्परिवर्तनों का पता लगाने के लिए आसान बनाने स्क्रीनिंग ।
एक आधारभूत डाटाबेस का निर्माण, एर द्वारा सभी जीन उत्परिवर्तनों-Seq नमूनों की एक ही प्रकार के एक नंबर से मिल (~ १००० शुरुआत में) । इन वास्तविक उत्परिवर्तनों कई अंय विश्वसनीय जांच तरीकों और विश्लेषण से सत्यापित किया जाना चाहिए । अगले, झूठी उत्परिवर्तनों और क्लस्टर सभी झूठी उत्परिवर्तनों के पैटर्न को संक्षिप्त करने के लिए प्रारंभिक आधारभूत डाटाबेस का निर्माण । झूठी उत्परिवर्तनों इस डाटाबेस को अनुवर्ती अनुक्रमण प्रयोगों से पाया जोड़ने जारी है । इसलिए, यह आधार रेखा डेटाबेस गतिशील विस्तारित डेटाबेस, जो काफी sequencing सटीकता में सुधार करता है हो जाता है ।
ट्यूमर निदान और निगरानी में प्रगति को बढ़ावा देने के लिए, हम वर्तमान एर-Seq, सार्वभौमिक डेटा के अधिग्रहण के लिए एक कम लागत और व्यवहार्य विधि । हम एक मामले का अध्ययन है जो ईआर-Seq विश्लेषण से गुजरा, क्लिनिक में उपयोग के लिए दुर्लभ उत्परिवर्तनों और व्यवहार्यता का पता लगाने के लिए अपनी सटीकता का प्रदर्शन ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>55114</td>
			<td>DNA Extraction from Peripheral Blood for cfDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51105</td>
			<td>DNA Extraction from Peripheral Blood for gDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>Measure cfDNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32853</td>
			<td>Measure library concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 1000 Reagents</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1504</td>
			<td>Measure cfDNA and library fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The NEBNext UltraII DNA Library Prep Kit for Illumina</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E7645L</td>
			<td>Library Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt SPRIselect Reagent</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>B23317</td>
			<td>DNA fragment screening and purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (10 mM, pH 8.0)-100ML</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93283</td>
			<td>Dissolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xGen Lockdown Probes</td>
			<td>IDT</td>
			<td>&#8212;&#8212;</td>
			<td>xGen Custom Probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Cot-1 DNA</td>
			<td>Life</td>
			<td>15279-011</td>
			<td>Targeted DNA capture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-270 Streptavidin</td>
			<td>Life</td>
			<td>65305</td>
			<td>Targeted DNA capture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xGen Lockdown Reagents</td>
			<td>IDT</td>
			<td>1072281</td>
			<td>Targeted DNA capture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix</td>
			<td>KAPA</td>
			<td>KK2602</td>
			<td>post-capture PCR enrichment libraries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA Library Quantification Kit</td>
			<td>KAPA</td>
			<td>KK4602</td>
			<td>Measure library concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500 High Output Kit v2((150 cycles)</td>
			<td>illumina</td>
			<td>FC-404-2002</td>
			<td>Sequence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge5810</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop8000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>8000</td>
			<td>Measure gDNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>Quantify</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16-tube DynaMagTM-2 Magnet</td>
			<td>Life</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrator plus</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR</td>
			<td>AB</td>
			<td>simplyamp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QPCR</td>
			<td>AB</td>
			<td>7500Dx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500</td>
			<td>illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of rare mutations in ctdna using next generation sequencing

परिचालित ट्यूमर डीएनए का विश्लेषण (ctDNA) अगली पीढ़ी के अनुक्रमण का उपयोग (NGS) नैदानिक ऑन्कोलॉजी के विकास के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण बन गया है. हालांकि, इस विधि के आवेदन रक्त में ctDNA की ट्रेस मात्रा का विश्लेषण करने में अपनी कम संवेदनशीलता के कारण चुनौतीपूर्ण है । इसके अलावा, विधि झूठी सकारात्मक और नकारात्मक परिणाम इस अनुक्रमण और बाद के विश्लेषण से उत्पन्न हो सकता है । व्यवहार्यता और क्लिनिक में ctDNA का पता लगाने की विश्वसनीयता में सुधार करने के लिए, यहाँ हम अनुक्रमण के लिए दुर्लभ उत्परिवर्तनों को समृद्ध करती है, जो एक तकनीक मौजूद है, दुर्लभ उत्परिवर्तन अनुक्रमण (एर-Seq) को समृद्ध. एर Seq 1 x 107 वंय प्रकार न्यूक्लियोटाइड है, जो यह एक आशाजनक उपकरण के लिए अत्यंत कम आवृत्ति आनुवंशिक परिवर्तन का पता लगाने और इस प्रकार के अध्ययन में बहुत उपयोगी हो जाएगा से बाहर एक एकल उत्परिवर्तन भेद कर सकते है रोग heterogenicity । अद्वितीय sequencing एडाप्टर के बंधाव के आधार पर, इस विधि से ctDNA अणुओं की एक कुशल वसूली सक्षम बनाता है, जबकि एक ही समय में त्रुटियों के लिए सुधारना-द्विता (भावना और antisense). हमारा चयन १०२१ kb जांच के लक्ष्य क्षेत्रों है कि 12 ट्यूमर में ट्यूमर से संबंधित चालक उत्परिवर्तनों के ९५% से अधिक कवर की माप को समृद्ध करता है । इस लागत प्रभावी और सार्वभौमिक विधि आनुवंशिक डेटा का एक अनूठा सफल संचय सक्षम बनाता है । के बाद कुशलता से बाहर पृष्ठभूमि त्रुटि फ़िल्टरिंग, एर seq ठीक दुर्लभ उत्परिवर्तनों का पता लगा सकते हैं । एक मामले का अध्ययन का उपयोग करना, हम एक विस्तृत जांच डिजाइन, पुस्तकालय निर्माण का प्रदर्शन प्रोटोकॉल वर्तमान, और लक्ष्य डीएनए कैप्चर के तरीके, जबकि भी डेटा विश्लेषण कार्यप्रवाह शामिल है । इस विधि को ले जाने के लिए प्रक्रिया सामान्यतया 1-2 दिन लेता है ।

१०२१ kb की जांच से समृद्ध लक्ष्य ईआर में प्रयुक्त क्षेत्रों-Seq तालिका 1है, जो 12 आम ट्यूमर में जीन उत्परिवर्तनों के ९५% से अधिक कवर में दिखाया जाता है । इन जांचों की विस्तृत श्रृंखल?...

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Detection of Rare Mutations in CtDNA Using Next Generation Sequencing

इस पांडुलिपि ctDNA, एर-Seq में कम आवृत्ति के उत्परिवर्तनों का पता लगाने के लिए एक तकनीक का वर्णन । इस विधि दो के अपने अद्वितीय उपयोग-दिशात्मक त्रुटि सुधार, एक विशेष पृष्ठभूमि फिल्टर, और कुशल आणविक अधिग्रहण से अलग है ।

अगली पीढ़ी अनुक्रमण का उपयोग कर CtDNA में दुर्लभ उत्परिवर्तनों का पता लगाने

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. ...

The overall goal of this technique is to detect mutations of low frequency in circulating tumor or ctDNA to provide clinical physicians a powerful tool to diagnose tumors and monitor tumor dynamics in response to therapy. The method of testing ctDNA can help answer key questions about what kinds of mutations a patient carries such as single nuclear-type variation, insertion deletion, copy number variation, and structural variation. The main advantage of this technqiue is high sensitivity and specificity which precise detection of low frequency mutations in ctDNA.Demonstrating the procedures will be Yuliang Yang, a technician from my laboratory. To begin, draw 10 milliliters of peripheral blood in a collection tube and gently invert the tube up and down six to eight times to mix the contents. Store blood samples in the collection tubes at six to 37 degrees Celsius for up to 72 hours.Centrifuge the collection tube at 1, 600 times g at room temperature for 10 minutes. Then use a disposal pipette to transfer the supernatant or plasma from the tube to four clean two milliliter appropriately labeled centrifuge tubes without disturbing the pellet. Use a clean disposal pipette to transfer one milliliter of the cells to a two milliliter appropriately labeled centrifuge tube.Store the cells at minus 20 degrees Celsius or colder before genomic or gDNA isolation. Next, centrifuge the plasma at 1, 600 times g at four degrees Celsius for 10 minutes. Then transfer the plasma to clean centrifuge tubes properly labeled as plasma leaving approximately 0.1 milliliter of residual volume at the bottom to avoid contamination.The buffy coat should be avoided from the plasma during the separation process. Otherwise, large DNA fragments extracted from the cells might dilute the ctDNA and affect the sensitivity of the test. Using a commercially available kit, isolate cfDNA from three milliliters of the collected plasma following the manufacturer's instructions.Then also with a kit, isolate gDNA from 200 microliters of white blood cells following the manufacturer's instructions. To fragment the gDNA control sample by sonication, prepare one microgram of gDNA sample in 100 microliters of Tris-EDTA buffer in a clean sonication tube. Set the sonication program to 30 seconds on and 30 seconds off for 12 cycles for a total of 12 minutes.After confirming the product contains 200 to 250 base pair fragments, transfer all fragmentation products to a new 1.5 milliliter tube containing 150 microliters of magnetic beads and incubate the sample for five minutes to select the correct fragments. Next, place the tube on a magnetic rack for 30 seconds and remove the supernatant. Then while keeping the tube on the rack, add 200 microliters of freshly prepared 80%ethanol to wash the beads.Incubate the beads for 30 seconds before removing the supernatant and repeat the wash. Keep the tube on the rack with the lid open to air dry the beads. Then elute the DNA fragments by adding 32 microliters of 10 millimolar Tris-HCL to the beads.To carry out the end prep reaction following the manufacturer's instructions, to a sterile nuclease-free tube, add seven microliters of reaction buffer, three microliters of the enzyme mix, 30 nanograms of cfDNA, and doubly distilled water for a total volume of 60 microliters. In a separate tube, add the same components but with one microgram of gDNA instead of cfDNA. Incubate the mixture in a thermal cycler at 20 degrees Celsius for 30 minutes followed by 65 degrees Celsius for 30 minutes without the lid heated.Immediately following the incubation, add 30 microliters of the ligation master mix, one microliter of the ligation enhancer, and four microliters of the unique sequencing adapter to the tube. Incubate the reaction in the thermal cycler at 20 degrees Celsius for 15 minutes without the lid heated. Vortex to resuspend the magnetic beads and leave the beads at room temperature for at least 30 minutes.Then add 87 microliters of the resuspended magnetic beads to the ligation reaction. Mix well by pipetting up and down and then incubate the sample at room temperature for five minutes. After washing and air drying the beads, elute the DNA target from the beads by adding 20 microliters of 10 millimolar Tris-HCL.Add 20 microliters of adapter ligated DNA fragments, five microliters of index primer i7, 25 microliters of library amplification master mix, and doubly distilled water up to a total volume of 50 microliters. PCR amplify the adapter ligated cfDNA or gDNA. Then add 45 microliters of suspended magnetic beads to the PCR-enriched DNA.Mix the sample by pipetting up and down and incubate it for five minutes. After removing the supernatant and washing the beads, use 30 microliters of 10 millimolar Tris-HCL to elute the DNA fragments with adapters. To carry out targeted DNA capture, in a sterile tube, block the sample by adding 1.5 micrograms of pooling libraries, eight microliters each of P5 block 100P and P7 block 100P, and five microliters of one microgram per microliter cock one DNA.Dry the contents of the tube using a vacuum concentrator set at 60 degrees Celsius. Hybridize the DNA capture probes with the library by adding 8.5 microliters of 2X hybridization buffer, 2.7 microliters of hybridization enhancer, and 1.8 microliters of nuclease-free doubly distilled water. Mix by pipetting up and down and incubate in the thermal mixer at 95 degrees Celsius for 10 minutes.Then immediately add four microliters of the custom probe. Incubate the samples in a thermal mixer at 65 degrees Celsius with the lid heated to 75 degrees Celsius for four hours. Incubate the hybridized target DNA with streptavidin beads then wash the beads to remove unbound DNA.Use the commercial kit according to the manufacturer's instructions to get a final 20 microliters of resuspended beads with captured DNA fragments. The washing step of unbound DNA from streptavidin beads should be quick. Otherwise, the capture efficiency of the targeted DNA might be affected.Amplify the captured DNA fragments by performing PCR using a commercial kit with two micromolar backbone oligonucleotides according to the manufacturer's instructions. Finally, add 45 microliters of suspended beads directly to the PCR product and enrich the amplified target DNA fragments bound to the beads by elution with 30 microliters of 10 millimolar Tris-HCL. Quantify the fragments and carry out sequencing and data analysis according to the text protocol.This table outlines how ER-seq improves coverage depth by 23%compared with the traditional method. This is due to its efficient recovery of cfDNA molecules, thus greatly enhancing the analysis of rare mutations. It is also clear that the unique sequencing adapters used in ER-seq enable easy differentiation of natural and PCR-induced duplications.As detailed in this table on the calling results, analysis based on ER-seq was 100%consistent for EGFR pL858R detection and the frequency of detection was a bit higher when compared with a traditional analysis. Importantly, ER-seq analysis enabled the detection of other relatively low frequency mutations including EGFR pT790M which was not recognized by traditional analysis due to high background noise. Once mastered, this technique can be done in 48 hours if it is performed properly.While attempting this procedure, it's important to remember to avoid loss of a very low quantity of cfDNA during extraction, library prep, and bead wash after hybridization. After watching this video, you should have a good understanding of how ctDNA from patient was collected, prepared, and targeted based on unique identified for sequencing. After its development, this technique paved the way for the researchers in the field of liquid biopsy to explore better practices in making clinic decisions.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Next Generation Sequencing for the Detection of Actionable Mutations in Solid and Liquid Tumors

ठोस और तरल ट्यूमर में कार्रवाई म्यूटेशन की जांच के लिए अगली पीढ़ी के अनुक्रमण

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific ...

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

उपन्यास ब्याह वेरिएंट में दवा प्रतिरोध करने के लिए संबंधित का पता लगाने के लिए शाही सेना अनुक्रमण का उपयोग<em&gt; इन विट्रो</em&gt; कैंसर मॉडल

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance ...

Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines

परिधीय रक्त Monocytes सह से Osteoclastogenesis के एक मानव नैदानिक मॉडल का विकास स्तन कैंसर सेल लाइनों के साथ-कल्चरल

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We ...

An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues

ट्यूमर के ऊतकों में उच्च प्रवाह चिप-अनुक्रमण का उपयोग कर क्रोमेटिन राज्यों के जीनोम चौड़ा मानचित्रण के लिए एक एकीकृत मंच

Histone modifications constitute a major component of the epigenome and play important regulatory roles in determining the transcriptional status of ...

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

चिप आधारित डिजिटल पीसीआर द्वारा ताजा जमे हुए गैस्ट्रिक कैंसर ऊतकों में एक CDH1 दुर्लभ प्रतिलिपि संस्करण का पता लगाने

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal ...

Oncogenic Gene Fusion Detection Using Anchored Multiplex Polymerase Chain Reaction Followed by Next Generation Sequencing

Oncogenic जीन फ्यूजन जांच लंगर मल्टीप्लेक्स पॉलिमरेज चेन रिएक्शन का उपयोग अगली पीढ़ी अनुक्रमण द्वारा पीछा किया

Gene fusions frequently contribute to the oncogenic phenotype of many different types of cancer. Additionally, the presence of certain fusions in samples ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

रोगी-व्युत्पन्न ग्लियोमा स्टेम सेल का उपयोग करके जीबीएम के लिए संभावित संयोजन थेरेपी की पहचान करने के लिए एक रैपिड स्क्रीनिंग वर्कफ़्लो

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Spatial Profiling of Protein and RNA Expression in Tissue: An Approach to Fine-Tune Virtual Microdissection

ऊतक में प्रोटीन और आरएनए अभिव्यक्ति की स्थानिक प्रोफाइलिंग: वर्चुअल माइक्रोडिसेक्शन को ठीक करने के लिए एक दृष्टिकोण

Multiplexing enables the assessment of several markers on the same tissue while providing spatial context. Spatial Omics technologies allow both protein ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

उच्च श्रेणी के सीरस डिम्बग्रंथि के कैंसर रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स का उत्पादन और संवर्धन

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

Engineering Oncogenic Heterozygous Gain-of-Function Mutations in Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

मानव हेमटोपोइएटिक स्टेम और पूर्वज कोशिकाओं में ऑन्कोजेनिक विषमयुग्मित गेन-ऑफ-फंक्शन म्यूटेशन इंजीनियरिंग

Throughout their lifetime, hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) acquire somatic mutations. Some of these mutations alter HSPC functional ...