Name: detection of rare mutations in ctdna using next generation sequencing
Uploaded: 2017-08-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Rare Mutations in CtDNA Using Next Generation Sequencing at JoVE.com

Эта работа поддерживается Институтом Geneplus – Пекин.

опухоли образцы и образцы крови были получены в соответствии с протоколом, утвержденным Комитет этики Пекинского университета людей &#39; s больницы. Письменное информированное согласие было получено от пациентов, чтобы использовать их образцы. Участникам были показаны по следующим кр?...

<ol>
	<li>Kennedy, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+ultralow-frequency+mutations+by+Duplex+Sequencing.">Detecting ultralow-frequency mutations by Duplex Sequencing.</a> Nat. Protoc. 9, 2586-2606 (2014).</li><li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+DNA+sequencing.">Next-generation DNA sequencing.</a> Nat Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).</li><li>Bettegowda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+circulating+tumor+DNA+in+early-+and+late-stage+human+malignancies.">Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies.</a> Sci. Transl. Med. 6, (2014).</li><li>Bratman, S. V., Newman, A. M., Alizadeh, A. A., Diehn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+clinical+utility+of+ultrasensitive+circulating+tumor+DNA+detection+with+CAPP-Seq.">Potential clinical utility of ultrasensitive circulating tumor DNA detection with CAPP-Seq.</a> Expert Rev. Mol. Diagn. 15, 715-719 (2015).</li><li>Diaz, L. A., Bardelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsies:+genotyping+circulating+tumor+DNA.">Liquid biopsies: genotyping circulating tumor DNA.</a> J. Clin. Oncol. 32, 579-586 (2014).</li><li>Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsy:+monitoring+cancer-genetics+in+the+blood.">Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood.</a> Nat. Rev. Clin. Oncol. 10, 472-484 (2013).</li><li>Su, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+platform+for+rapid+detection+of+multiple+oncogenic+mutations+with+relevance+to+targeted+therapy+in+non-small-cell+lung+cancer.">A platform for rapid detection of multiple oncogenic mutations with relevance to targeted therapy in non-small-cell lung cancer.</a> J. Mol. Diagn. 13, 74-84 (2011).</li><li>Kukita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-fidelity+target+sequencing+of+individual+molecules+identified+using+barcode+sequences:+de+novo+detection+and+absolute+quantitation+of+mutations+in+plasma+cell-free+DNA+from+cancer+patients.">High-fidelity target sequencing of individual molecules identified using barcode sequences: de novo detection and absolute quantitation of mutations in plasma cell-free DNA from cancer patients.</a> DNA Res. 22, 269-277 (2015).</li><li>Schmitt, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequencing+small+genomic+targets+with+high+efficiency+and+extreme+accuracy.">Sequencing small genomic targets with high efficiency and extreme accuracy.</a> Nat. Methods. 12, 423-425 (2015).</li><li>Schmitt, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+ultra-rare+mutations+by+next-generation+sequencing.">Detection of ultra-rare mutations by next-generation sequencing.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 14508-14513 (2012).</li><li>Newman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrasensitive+method+for+quantitating+circulating+tumor+DNA+with+broad+patient+coverage.">An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage.</a> Nat. Med. 20, 548-554 (2014).</li><li>Newman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+digital+error+suppression+for+improved+detection+of+circulating+tumor+DNA.">Integrated digital error suppression for improved detection of circulating tumor DNA.</a> Nat Biotechnol. 34 (5), 547-555 (2016).</li><li>Alix-Panabie&#768;res, C., Schwarzenbach, H., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+and+circulating+tumor+DNA.">Circulating tumor cells and circulating tumor DNA.</a> Annu. Rev. Med. 63, 199-215 (2012).</li><li>Dawson, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+circulating+tumor+DNA+to+monitor+metastatic+breast+cancer.">Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer.</a> N. Engl. J. Med. 368, 1199-1209 (2013).</li><li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+accurate+short-read+alignment+with+Burrows-+Wheeler+transform.">Fast and accurate short-read alignment with Burrows- Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).</li><li>Youn, A., Simon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+cancer+driver+genes+in+tumor+genome+sequencing+studies.">Identifying cancer driver genes in tumor genome sequencing studies.</a> Bioinformatics. 27, 175-181 (2011).</li><li>Forshew, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+identification+and+monitoring+of+cancer+mutations+by+targeted+deep+sequencing+of+plasma+DNA.">Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA.</a> Sci. Transl. Med. 4, (2012).</li><li>Kobayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFR+mutation+and+resistance+of+non-small-cell+lung+cancer+to+gefitinib.">EGFR mutation and resistance of non-small-cell lung cancer to gefitinib.</a> N. Engl. J. Med. 352, 786-792 (2005).</li><li>Kuang, Y., Rogers, A., Yeap, Y., Wang, L., Makrigiorgos, M., Vetrand, K., Thiede, S., Distel, R. J., Ja&#776;nne, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+detection+of+EGFR+T790M+in+gefitinib+or+erlotinib+resistant+non-small+cell+lung+cancer.">Noninvasive detection of EGFR T790M in gefitinib or erlotinib resistant non-small cell lung cancer.</a> Clin. Cancer Res. 15, 2630-2636 (2009).</li><li>Taniguchi, K., Uchida, J., Nishino, K., Kumagai, T., Okuyama, T., Okami, J., Higashiyama, M., Kodama, K., Imamura, F., Kato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+detection+of+EGFR+mutations+in+circulating+tumor+DNA+derived+from+lung+adenocarcinomas.">Quantitative detection of EGFR mutations in circulating tumor DNA derived from lung adenocarcinomas.</a> Clin. Cancer Res. 17, 7808-7815 (2011).</li><li>Leary, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+personalized+tumor+biomarkers+using+massively+parallel+sequencing.">Development of personalized tumor biomarkers using massively parallel sequencing.</a> Sci. Transl. Med. 2, (2010).</li><li>Forshew, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+identification+and+monitoring+of+cancer+mutations+by+targeted+deep+sequencing+of+plasma+DNA.">Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA.</a> Sci. Transl. Med. 4, (2012).</li><li>Bratman, S. V., Newman, A. M., Alizadeh, A. A., Diehn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+clinical+utility+of+ultrasensitive+circulating+tumor+DNA+detection+with+CAPP-Seq.">Potential clinical utility of ultrasensitive circulating tumor DNA detection with CAPP-Seq.</a> Expert Rev. Mol. Diagn. 15, 715-719 (2015).</li></ol>

Существование циркулирующей ДНК опухоли (ctDNA) было обнаружено более 30 лет назад, однако применение ctDNA анализов до сих пор не рутинной в клинической практике. С развитием технологий для обнаружения ctDNA и анализа возрос интерес к практическому применению методов ctDNA. Опухоль мониторинг с ...

Следующего поколения последовательности (НГС), мощный инструмент для исследовать тайны генома, может предоставить большое количество информации, которая может выявить генетические изменения. Применение анализа NGS в клинике стало более распространенным, особенно для персонализированной медицины. Одним из величайших ограничений NGS, однако, является высокая погрешность. Хотя это считается подходит для изучения унаследованные мутации, является анализ редких мутаций значительно ограничены1,2, особенно когда анализа ДНК получены от «жидкий биопсии».
Циркулирующих опухоли ДНК (ctDNA) — свободных клеток ДНК (cfDNA) в крови, что является пролить от опухолевых клеток. В большинстве случаев количество ctDNA крайне низка, которые делают его обнаружения и анализа очень сложным. Однако, ctDNA имеет много привлекательных особенностей: его изоляция является малоинвазивной, он может быть обнаружен на ранних стадиях роста опухоли, ctDNA уровень отражает терапевтическую эффективность и ctDNA содержит мутаций ДНК, в первичных и метастатических поражений 3 , 4 , 5. Таким образом, учитывая быстрое развитие техники NGS и анализа, приложение обнаружения ctDNA стал более привлекательным.
Различные массивно параллельной последовательности подходы были использованы для обнаружения ctDNA, но ни один из этих подходов были приняты для обычного использования в клиниках из-за их ограничений: низкая чувствительность, отсутствие универсальности и относительно высокая стоимость6 ,,78. Например дуплекс последовательности, основываясь на теге уникальный идентификатор (UID), неоднократно исправляет ошибки в двунаправленно консенсус, выпрямлять большинство последовательности ошибок. Однако возможности этого метода теряется из-за ее высокой стоимости и низкого данных использования9,10. Аналогичным образом КАПП-Seq и ее улучшение итерации, КАПП-IDES11,12, имеют большей практичности в cfDNA обнаружения, хотя точность и универсальность этих методов нуждаются в улучшении.
Для удовлетворения текущих потребностей для точного ctDNA обнаружения и анализа, мы разработали новую стратегию, обогатить редкой мутации виртуализации (ER-Seq). Этот подход сочетает в себе следующее: уникальная последовательность адаптеры эффективно восстановить ctDNA молекулы, с коррекцией ошибок двунаправленный и способность различать одной мутации из &#62; 1 × 107 одичал тип нуклеотидов; Зонды 1021 Кб, которые обогащают измерение целевых областей, которые охватывают более 95% мутаций связанных с опухоль от 12 опухолей, включая рак легких, колоректального рака, рак желудка, рак молочной железы, рак почки, поджелудочной железы, рак печени, рак щитовидной железы, Рак шейки матки, рак пищевода и рака эндометрия (Таблица 1); и основной базы данных скрининг, что делает его эффективным и легко точно обнаружить редкие мутации в ctDNA.
Для создания основной базы данных, найти все мутации гена, ER-Seq от ряда того же типа образцов (~ 1000 в начале). Эти реальные мутации должны быть проверены несколько других методов надежного обнаружения и анализа. Далее обобщить шаблон ложных мутаций и кластера все ложные мутации для создания первоначальной основной базы данных. Продолжайте добавлять накладные мутации, нашли от последующих последовательность экспериментов в этой базе данных. Таким образом этот основной базы данных становится динамической расширенной базы данных, что значительно повышает точность последовательности.
Для содействия прогрессу в опухоли диагностики и мониторинга, мы представляем ER-Seq, низкой стоимости и осуществимости метода для получения данных. Мы представляем тематическое исследование, которое прошли анализ ER-Seq, демонстрируя свою точность обнаружения редкой мутации и возможности для использования в клинике.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>55114</td>
			<td>DNA Extraction from Peripheral Blood for cfDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51105</td>
			<td>DNA Extraction from Peripheral Blood for gDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>Measure cfDNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32853</td>
			<td>Measure library concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 1000 Reagents</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1504</td>
			<td>Measure cfDNA and library fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The NEBNext UltraII DNA Library Prep Kit for Illumina</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E7645L</td>
			<td>Library Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt SPRIselect Reagent</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>B23317</td>
			<td>DNA fragment screening and purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (10 mM, pH 8.0)-100ML</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93283</td>
			<td>Dissolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xGen Lockdown Probes</td>
			<td>IDT</td>
			<td>&#8212;&#8212;</td>
			<td>xGen Custom Probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Cot-1 DNA</td>
			<td>Life</td>
			<td>15279-011</td>
			<td>Targeted DNA capture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-270 Streptavidin</td>
			<td>Life</td>
			<td>65305</td>
			<td>Targeted DNA capture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xGen Lockdown Reagents</td>
			<td>IDT</td>
			<td>1072281</td>
			<td>Targeted DNA capture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix</td>
			<td>KAPA</td>
			<td>KK2602</td>
			<td>post-capture PCR enrichment libraries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA Library Quantification Kit</td>
			<td>KAPA</td>
			<td>KK4602</td>
			<td>Measure library concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500 High Output Kit v2((150 cycles)</td>
			<td>illumina</td>
			<td>FC-404-2002</td>
			<td>Sequence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge5810</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop8000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>8000</td>
			<td>Measure gDNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>Quantify</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16-tube DynaMagTM-2 Magnet</td>
			<td>Life</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrator plus</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR</td>
			<td>AB</td>
			<td>simplyamp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QPCR</td>
			<td>AB</td>
			<td>7500Dx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500</td>
			<td>illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of rare mutations in ctdna using next generation sequencing

Анализ распространения опухоли ДНК (ctDNA) с помощью следующего поколения последовательности (НГС) стал ценным инструментом для развития клинической онкологии. Однако применение этого метода является сложной задачей из-за его низкой чувствительности при анализе трассировки количество ctDNA в крови. Кроме того этот метод может генерировать ложные положительные и отрицательные результаты из этой последовательности и последующего анализа. Чтобы улучшить возможности и надежность обнаружения ctDNA в клинике, здесь мы представляем технику, которая обогащает редкой мутации для виртуализации, обогатить редкой мутации последовательности (ER-Seq). ER-Seq можно отличить один мутации из 1 x 107 одичал тип нуклеотидов, что делает его перспективным инструментом для обнаружения крайне низкой частоты генетические изменения и таким образом будет весьма полезным при изучении heterogenicity болезни. Благодаря адаптеру уникальный последовательности перевязки этот метод позволяет эффективное восстановление ctDNA молекул, в то же время исправление ошибки двунаправленно (смысл и antisense). Наш выбор 1021 КБ зондов обогащает измерение целевых областей, которые охватывают более 95% мутаций связанных с опухоль водителя в 12 опухоли. Этот экономичный и универсальный метод позволяет уникально успешным накопления генетических данных. После эффективно отфильтровывать фон ошибка, ER-seq точно можно обнаружить редкой мутации. С помощью тематического исследования, мы представляем подробный протокол, демонстрируя зонд дизайн, строительство библиотеки и целевой ДНК захвата методологии, а также включая процесс анализа данных. Процесс для выполнения этого метода обычно занимает 1-2 дней.

Зонды 1021 Кб, обогащенный целевых регионов, используемые в ER-Seq приведены в таблице 1, которая охватывает более 95% мутаций гена в 12 распространенных опухолей. Широкий спектр этих датчиков делает этот процесс применимы для большинства больных раком. Кро...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Rare Mutations in CtDNA Using Next Generation Sequencing at JoVE.com

Detection of Rare Mutations in CtDNA Using Next Generation Sequencing

Эта рукопись описывает метод для обнаружения мутаций низкой частоты в ctDNA, ER-Seq. Этот метод отличается ее уникальной использование коррекции ошибок двунаправленный, Специальный фон фильтра и эффективной молекулярной приобретение.

Обнаружение редкой мутации в CtDNA с помощью следующего поколения последовательности

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. ...

The overall goal of this technique is to detect mutations of low frequency in circulating tumor or ctDNA to provide clinical physicians a powerful tool to diagnose tumors and monitor tumor dynamics in response to therapy. The method of testing ctDNA can help answer key questions about what kinds of mutations a patient carries such as single nuclear-type variation, insertion deletion, copy number variation, and structural variation. The main advantage of this technqiue is high sensitivity and specificity which precise detection of low frequency mutations in ctDNA.Demonstrating the procedures will be Yuliang Yang, a technician from my laboratory. To begin, draw 10 milliliters of peripheral blood in a collection tube and gently invert the tube up and down six to eight times to mix the contents. Store blood samples in the collection tubes at six to 37 degrees Celsius for up to 72 hours.Centrifuge the collection tube at 1, 600 times g at room temperature for 10 minutes. Then use a disposal pipette to transfer the supernatant or plasma from the tube to four clean two milliliter appropriately labeled centrifuge tubes without disturbing the pellet. Use a clean disposal pipette to transfer one milliliter of the cells to a two milliliter appropriately labeled centrifuge tube.Store the cells at minus 20 degrees Celsius or colder before genomic or gDNA isolation. Next, centrifuge the plasma at 1, 600 times g at four degrees Celsius for 10 minutes. Then transfer the plasma to clean centrifuge tubes properly labeled as plasma leaving approximately 0.1 milliliter of residual volume at the bottom to avoid contamination.The buffy coat should be avoided from the plasma during the separation process. Otherwise, large DNA fragments extracted from the cells might dilute the ctDNA and affect the sensitivity of the test. Using a commercially available kit, isolate cfDNA from three milliliters of the collected plasma following the manufacturer's instructions.Then also with a kit, isolate gDNA from 200 microliters of white blood cells following the manufacturer's instructions. To fragment the gDNA control sample by sonication, prepare one microgram of gDNA sample in 100 microliters of Tris-EDTA buffer in a clean sonication tube. Set the sonication program to 30 seconds on and 30 seconds off for 12 cycles for a total of 12 minutes.After confirming the product contains 200 to 250 base pair fragments, transfer all fragmentation products to a new 1.5 milliliter tube containing 150 microliters of magnetic beads and incubate the sample for five minutes to select the correct fragments. Next, place the tube on a magnetic rack for 30 seconds and remove the supernatant. Then while keeping the tube on the rack, add 200 microliters of freshly prepared 80%ethanol to wash the beads.Incubate the beads for 30 seconds before removing the supernatant and repeat the wash. Keep the tube on the rack with the lid open to air dry the beads. Then elute the DNA fragments by adding 32 microliters of 10 millimolar Tris-HCL to the beads.To carry out the end prep reaction following the manufacturer's instructions, to a sterile nuclease-free tube, add seven microliters of reaction buffer, three microliters of the enzyme mix, 30 nanograms of cfDNA, and doubly distilled water for a total volume of 60 microliters. In a separate tube, add the same components but with one microgram of gDNA instead of cfDNA. Incubate the mixture in a thermal cycler at 20 degrees Celsius for 30 minutes followed by 65 degrees Celsius for 30 minutes without the lid heated.Immediately following the incubation, add 30 microliters of the ligation master mix, one microliter of the ligation enhancer, and four microliters of the unique sequencing adapter to the tube. Incubate the reaction in the thermal cycler at 20 degrees Celsius for 15 minutes without the lid heated. Vortex to resuspend the magnetic beads and leave the beads at room temperature for at least 30 minutes.Then add 87 microliters of the resuspended magnetic beads to the ligation reaction. Mix well by pipetting up and down and then incubate the sample at room temperature for five minutes. After washing and air drying the beads, elute the DNA target from the beads by adding 20 microliters of 10 millimolar Tris-HCL.Add 20 microliters of adapter ligated DNA fragments, five microliters of index primer i7, 25 microliters of library amplification master mix, and doubly distilled water up to a total volume of 50 microliters. PCR amplify the adapter ligated cfDNA or gDNA. Then add 45 microliters of suspended magnetic beads to the PCR-enriched DNA.Mix the sample by pipetting up and down and incubate it for five minutes. After removing the supernatant and washing the beads, use 30 microliters of 10 millimolar Tris-HCL to elute the DNA fragments with adapters. To carry out targeted DNA capture, in a sterile tube, block the sample by adding 1.5 micrograms of pooling libraries, eight microliters each of P5 block 100P and P7 block 100P, and five microliters of one microgram per microliter cock one DNA.Dry the contents of the tube using a vacuum concentrator set at 60 degrees Celsius. Hybridize the DNA capture probes with the library by adding 8.5 microliters of 2X hybridization buffer, 2.7 microliters of hybridization enhancer, and 1.8 microliters of nuclease-free doubly distilled water. Mix by pipetting up and down and incubate in the thermal mixer at 95 degrees Celsius for 10 minutes.Then immediately add four microliters of the custom probe. Incubate the samples in a thermal mixer at 65 degrees Celsius with the lid heated to 75 degrees Celsius for four hours. Incubate the hybridized target DNA with streptavidin beads then wash the beads to remove unbound DNA.Use the commercial kit according to the manufacturer's instructions to get a final 20 microliters of resuspended beads with captured DNA fragments. The washing step of unbound DNA from streptavidin beads should be quick. Otherwise, the capture efficiency of the targeted DNA might be affected.Amplify the captured DNA fragments by performing PCR using a commercial kit with two micromolar backbone oligonucleotides according to the manufacturer's instructions. Finally, add 45 microliters of suspended beads directly to the PCR product and enrich the amplified target DNA fragments bound to the beads by elution with 30 microliters of 10 millimolar Tris-HCL. Quantify the fragments and carry out sequencing and data analysis according to the text protocol.This table outlines how ER-seq improves coverage depth by 23%compared with the traditional method. This is due to its efficient recovery of cfDNA molecules, thus greatly enhancing the analysis of rare mutations. It is also clear that the unique sequencing adapters used in ER-seq enable easy differentiation of natural and PCR-induced duplications.As detailed in this table on the calling results, analysis based on ER-seq was 100%consistent for EGFR pL858R detection and the frequency of detection was a bit higher when compared with a traditional analysis. Importantly, ER-seq analysis enabled the detection of other relatively low frequency mutations including EGFR pT790M which was not recognized by traditional analysis due to high background noise. Once mastered, this technique can be done in 48 hours if it is performed properly.While attempting this procedure, it's important to remember to avoid loss of a very low quantity of cfDNA during extraction, library prep, and bead wash after hybridization. After watching this video, you should have a good understanding of how ctDNA from patient was collected, prepared, and targeted based on unique identified for sequencing. After its development, this technique paved the way for the researchers in the field of liquid biopsy to explore better practices in making clinic decisions.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Next Generation Sequencing for the Detection of Actionable Mutations in Solid and Liquid Tumors

Следующее поколение Секвенирование для обнаружения осуществимых Мутации в твердых и жидких опухолей

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific ...

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

С помощью РНК-последовательности для обнаружения Novel сращивание Варианты, относящиеся к лекарственной устойчивости<em&gt; In Vitro</em&gt; Модели рака

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance ...

Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines

Развитие человека доклинических модели Osteoclastogenesis от периферической крови моноциты совместно культивируемых с линии клеток рака молочной железы

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We ...

An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues

Интегрированная платформа для картирования генома общесистемной Chromatin государств с использованием высокопроизводительный чип последовательности в тканях опухоли

Histone modifications constitute a major component of the epigenome and play important regulatory roles in determining the transcriptional status of ...

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

Обнаружение CDH1 редких Стенограмма вариант в тканях свежемороженые рака желудка на основе чипа цифровой ПЦР

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal ...

Oncogenic Gene Fusion Detection Using Anchored Multiplex Polymerase Chain Reaction Followed by Next Generation Sequencing

Онкогенный ген Fusion Обнаружение Использование якорный мультиплекс полимеразы Цепная реакция после следующего поколения секвенирования

Gene fusions frequently contribute to the oncogenic phenotype of many different types of cancer. Additionally, the presence of certain fusions in samples ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

Быстрый процесс скрининга для определения потенциальной комбинированной терапии GBM с использованием стволовых клеток глиомы, полученных от пациента

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Spatial Profiling of Protein and RNA Expression in Tissue: An Approach to Fine-Tune Virtual Microdissection

Пространственное профилирование экспрессии белка и РНК в тканях: подход к тонкой настройке виртуальной микродиссекции

Multiplexing enables the assessment of several markers on the same tissue while providing spatial context. Spatial Omics technologies allow both protein ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Генерация и культивирование высокодифференцированных серозных органоидов, полученных от пациентов с раком яичников

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

Engineering Oncogenic Heterozygous Gain-of-Function Mutations in Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Инженерные онкогенные гетерозиготные мутации усиления функции в гемопоэтических стволовых и прогениторных клетках человека

Throughout their lifetime, hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) acquire somatic mutations. Some of these mutations alter HSPC functional ...