Name: phagocytosis assay for apoptotic cells in drosophila embryos
Uploaded: 2017-08-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos at JoVE.com

ونحن ممتنون لكاز ناغوسا وأكيكو شيراتسوتشي على مشورتهم.

1. إعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد لوحات أجار عصير العنب الطازج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 مل من الماء إلى 4.4 غرام من أجار، وتسخين الخليط في فرن الميكروويف لحل آجار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 8...

<ol>
	<li>Danial, N. N., Korsmeyer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death:+critical+control+points.">Cell death: critical control points.</a> Cell. 116 (2), 205-219 (2004).</li><li>Vaux, D. L., Korsmeyer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+in+development.">Cell death in development.</a> Cell. 96 (2), 245-254 (1999).</li><li>Savill, J., Fadok, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corpse+clearance+defines+the+meaning+of+cell+death.">Corpse clearance defines the meaning of cell death.</a> Nature. 407 (6805), 784-788 (2000).</li><li>Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearance+of+apoptotic+cells:+getting+rid+of+the+corpses.">Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses.</a> Mol Cell. 14 (3), 277-287 (2004).</li><li>Ravichandran, K. S., Lorenz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engulfment+of+apoptotic+cells:+signals+for+a+good+meal.">Engulfment of apoptotic cells: signals for a good meal.</a> Nat Rev Immunol. 7 (12), 964-974 (2007).</li><li>Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beginnings+of+a+good+apoptotic+meal:+the+find-me+and+eat-me+signaling+pathways.">Beginnings of a good apoptotic meal: the find-me and eat-me signaling pathways.</a> Immunity. 35 (4), 445-455 (2011).</li><li>Nakanishi, Y., Nagaosa, K., Shiratsuchi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytic+removal+of+cells+that+have+become+unwanted:+implications+for+animal+development+and+tissue+homeostasis.">Phagocytic removal of cells that have become unwanted: implications for animal development and tissue homeostasis.</a> Dev Growth Differ. 53 (2), 149-160 (2011).</li><li>Reddien, P. W., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+engulfment+process+of+programmed+cell+death+in+caenorhabditis+elegans.">The engulfment process of programmed cell death in caenorhabditis elegans.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 193-221 (2004).</li><li>Hedgecock, E. M., Sulston, J. E., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+affecting+programmed+cell+deaths+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Mutations affecting programmed cell deaths in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Science. 220 (4603), 1277-1279 (1983).</li><li>Ellis, R. E., Jacobson, D. M., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+required+for+the+engulfment+of+cell+corpses+during+programmed+cell+death+in+Caenorhabditis+elegans.">Genes required for the engulfment of cell corpses during programmed cell death in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 129 (1), 79-94 (1991).</li><li>Gumienny, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CED-12/ELMO,+a+novel+member+of+the+CrkII/Dock180/Rac+pathway,+is+required+for+phagocytosis+and+cell+migration.">CED-12/ELMO, a novel member of the CrkII/Dock180/Rac pathway, is required for phagocytosis and cell migration.</a> Cell. 107 (1), 27-41 (2001).</li><li>Hsu, T. Y., Wu, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engulfment+of+apoptotic+cells+in+C.+elegans+is+mediated+by+integrin+alpha/SRC+signaling.">Engulfment of apoptotic cells in C. elegans is mediated by integrin alpha/SRC signaling.</a> Curr Biol. 20 (6), 477-486 (2010).</li><li>Hanayama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+factor+that+links+apoptotic+cells+to+phagocytes.">Identification of a factor that links apoptotic cells to phagocytes.</a> Nature. 417 (6885), 182-187 (2002).</li><li>Tepass, U., Fessler, L. I., Aziz, A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origin+of+hemocytes+and+their+relationship+to+cell+death+in+Drosophila.">Embryonic origin of hemocytes and their relationship to cell death in Drosophila.</a> Development. 120 (7), 1829-1837 (1994).</li><li>Gold, K. S., Bruckner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+and+cellular+immunity+in+Drosophila+melanogaster.">Macrophages and cellular immunity in Drosophila melanogaster.</a> Semin Immunol. 27, 357-368 (2015).</li><li>Abrams, J. M., White, K., Fessler, L. I., Steller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+death+during+Drosophila+embryogenesis.">Programmed cell death during Drosophila embryogenesis.</a> Development. 117 (1), 29-43 (1993).</li><li>Franc, N. C., Heitzler, P., Ezekowitz, R. A., White, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+croquemort+in+phagocytosis+of+apoptotic+cells+in+Drosophila.">Requirement for croquemort in phagocytosis of apoptotic cells in Drosophila.</a> Science. 284 (5422), 1991-1994 (1999).</li><li>Mukae, N., Yokoyama, H., Yokokura, T., Sakoyama, Y., Nagata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+innate+immunity+in+Drosophila+by+endogenous+chromosomal+DNA+that+escaped+apoptotic+degradation.">Activation of the innate immunity in Drosophila by endogenous chromosomal DNA that escaped apoptotic degradation.</a> Genes Dev. 16 (20), 2662-2671 (2002).</li><li>Manaka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Draper-mediated+and+phosphatidylserine-independent+phagocytosis+of+apoptotic+cells+by+Drosophila+hemocytes/macrophages.">Draper-mediated and phosphatidylserine-independent phagocytosis of apoptotic cells by Drosophila hemocytes/macrophages.</a> J Biol Chem. 279 (46), 48466-48476 (2004).</li><li>Roberts, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila: A Practical Approach. , 3868-3878 (1998).</li><li>Kuraishi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretaporter,+a+Drosophila+protein+serving+as+a+ligand+for+Draper+in+the+phagocytosis+of+apoptotic+cells.">Pretaporter, a Drosophila protein serving as a ligand for Draper in the phagocytosis of apoptotic cells.</a> Embo j. 28 (24), 3868-3878 (2009).</li><li>Franc, N. C., Dimarcq, J. L., Lagueux, M., Hoffmann, J., Ezekowitz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Croquemort,+a+novel+Drosophila+hemocyte/macrophage+receptor+that+recognizes+apoptotic+cells.">Croquemort, a novel Drosophila hemocyte/macrophage receptor that recognizes apoptotic cells.</a> Immunity. 4 (5), 431-443 (1996).</li><li>Kuraishi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+calreticulin+as+a+marker+for+phagocytosis+of+apoptotic+cells+in+Drosophila.">Identification of calreticulin as a marker for phagocytosis of apoptotic cells in Drosophila.</a> Exp Cell Res. 313 (3), 500-510 (2007).</li><li>Nagaosa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+betanu-mediated+phagocytosis+of+apoptotic+cells+in+Drosophila+embryos.">Integrin betanu-mediated phagocytosis of apoptotic cells in Drosophila embryos.</a> J Biol Chem. 286 (29), 25770-25777 (2011).</li><li>Nonaka, S., Nagaosa, K., Mori, T., Shiratsuchi, A., Nakanishi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+alphaPS3/betanu-mediated+phagocytosis+of+apoptotic+cells+and+bacteria+in+Drosophila.">Integrin alphaPS3/betanu-mediated phagocytosis of apoptotic cells and bacteria in Drosophila.</a> J Biol Chem. 288 (15), 10374-10380 (2013).</li><li>Fujita, Y., Nagaosa, K., Shiratsuchi, A., Nakanishi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+NPxY+motif+in+Draper-mediated+apoptotic+cell+clearance+in+Drosophila.">Role of NPxY motif in Draper-mediated apoptotic cell clearance in Drosophila.</a> Drug Discov Ther. 6 (6), 291-297 (2012).</li><li>Bruckner, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PDGF/VEGF+receptor+controls+blood+cell+survival+in+Drosophila.">The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila.</a> Dev Cell. 7 (1), 73-84 (2004).</li><li>Nonaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+Pathway+for+Phagocyte+Priming+upon+Encounter+with+Apoptotic+Cells.">Signaling Pathway for Phagocyte Priming upon Encounter with Apoptotic Cells.</a> J Biol Chem. 292 (19), 8059-8072 (2017).</li><li>Hanayama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmune+disease+and+impaired+uptake+of+apoptotic+cells+in+MFG-E8-deficient+mice.">Autoimmune disease and impaired uptake of apoptotic cells in MFG-E8-deficient mice.</a> Science. 304 (5674), 1147-1150 (2004).</li></ol>

<html> وصفنا هنا مقايسة البلعمة باستخدام الأجنة ذبابة الفاكهة . باستخدام الخلايا الجنينية المتناثرة لقياس البلعمة كميا، يتم الكشف عن الخلايا الدموية، البالعات المهنية ذبابة الفاكهة ، إمونوستيند ل كروسيمورت علامة الكريات البيض أو غفب srpHemo- مدفوعة، وخلاي?...

في الحيوانات ميتازوان، على سبيل المثال النيماتودا كينورهابديتيس ايليجانس ، ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة ميلانوغاستر ، والفئران والبشر، وعدد كبير من الخلايا الخضوع لموت الخلايا المبرمج أثناء التنمية لتشكيل أجسامهم وفي مرحلة البلوغ للحفاظ على التوازن 1 ، 2 . الخلايا الأبوطوزية تحتاج إلى إزالتها بسرعة لأنها تحفز الالتهاب في الأنسجة المحيطة بها عن طريق الإفراج عن المواد المناعية داخل الخلايا إذا لم تتم إزالتها تماما 3 . من أجل تسهيل الإزالة السريعة، والخلايا أبوبتوتيك الحاضر ما يسمى أكل لي إشارات التي يتم التعرف عليها من قبل مستقبلات إنغولفنت من البالعات، ويتم القضاء عليها من قبل البلعمة 3 ، 4 ، 5 ، 6 . وهكذا، البلعمة تلعب دورا حاسما في الحفاظ على التوازن المضيف، وبالتالي، توضيح الجزيئية<html> آليات لار الكامنة وراء البلعمة من الخلايا الأبوطوزية أمر ذو أهمية. ويبدو أن الآليات المسؤولة عن البلعمة من الخلايا أبوبتوتيك محفوظة من الناحية الدستورية بين الأنواع في الديدان الخيطية والذباب والفئران 7 . العديد من المقايسات البلعمة متوفرة حاليا لتقييم تجتاح الخلايا المبرمج في هذه الحيوانات نموذج. في C. ايليجانس ، 131 الخلايا الجسدية الخضوع لعملية موت الخلايا المبرمجة خلال التنمية، وجثث الخلايا هي فاغوسيتوسد الخلايا المجاورة، والتي هي البالعات غير المهنية 8 . وهكذا، عد عدد جثث الخلايا المتبقية في C. ايليجانس يشير إلى مستوى البلعمة في الجسم الحي . من خلال البحث عن المسوخ النيماتودا التي تظهر عددا متزايدا من الخلايا الميتة، تم تحديد العديد من الجينات اللازمة لبلعمة وميز وراثيا 9 ، 10 ،s = &quot;كريف&quot;&gt; 11 ، 12 . السابقين فيفو مقايسات البلعمة مع البالعات الثقافة الأولية، الضامة عموما، وغالبا ما تستخدم في الفئران. يتم إعداد الخلايا الأبوطوزية باستخدام خطوط الخلايا مثل خلايا جوركات، ويتم خلطها مع البالعات الأولية. بعد حضانة لعدة ساعات، يتم حساب العدد الإجمالي للبالعات والبكم البالعات من أجل تقييم مستوى البلعمة. كتعديل متطور لهذه الطريقة، وضعت مجموعة ناغاتا مقايسة البلعمة خارج الجسم الحي مع الخلايا معربا عن إيكاد مقاومة كاسباس (المانع من الدناز تفعيلها كاسباس)، التي الخلايا الخمجية لا تخضع لتجزئة الحمض النووي موت المبرمج، ولكن لا يزال المشقوق الحمض النووي عندما الخلايا هي فاغوسيتوسد. عندما يتم استخدام هذه الخلايا كأهداف أبوبتوتيك في فحص البلعمة، فقط الحمض النووي للخلايا أبوبتوتيك اجتاحت هو مجزأة، وملطخة من قبل توسط بوساطة دوتب نيك نهاية وضع العلامات (تونيل). لذلك، ليفلتر من إنبولفنت الخلايا الخلوية يقاس من خلال عد إشارات تونيل في خليط من الخلايا البالعات والخلايا أبوبتوتيك 13 . في D. ميلانوغاستر ، البالعات المهنية اسمه خلايا الدم، الضامة ذبابة الفاكهة ، هي المسؤولة عن البلعمة من الخلايا المبرمج 14 ، 15 . بالإضافة إلى المقايسات في البلعمة في المختبر مع خطوط الخلايا الثقافة، في المقايسات في البلعمة الجسم الحي مع الأجنة ذبابة الفاكهة كلها متوفرة. الأجنة ذبابة الفاكهة هي أداة قوية لفحص مستوى انحلال الخلايا المبرمج لأن العديد من الخلايا الخضوع لموت الخلايا المبرمج و فاجوسيتوسد من قبل خلايا الدم خلال التطور الجنيني 14 ، 15 ، 16 . مثال على في الجسم الحي فحص البلعمة هو الأسلوب الذي وضعته مجموعة الفرنك. في طريقتهم، هيموسيتس ديالتي يقودها المناعية من بيروكسيداسين، علامة الخلايا الهضمية، والملطخة الخلايا الأبوطوزية باستخدام الصبغة النووية، 7-أمينو أكتينوميسين D في الأجنة ذبابة الفاكهة كاملة، وعدد من الخلايا الإيجابية مزدوجة تحسب كإشارة من البلعمة 17 . ويستند مثال آخر على فحص البلعمة على الأجنة على مفهوم طريقة ناغاتا المذكورة أعلاه؛ ومع ذلك، يتم تقييمها في الجسم الحي البلعمة باستخدام أجنة dCAD (ذبابة الفاكهة كاسباس تنشيط الدناز) متحولة الذباب 18 و 19. هذه المقايسات في البلعمة الجسم الحي مفيدة لمراقبة مباشرة البلعمة في الموقع . ومع ذلك، ترتبط الصعوبات مع استبعاد أي تحيز ممكن في خطوة عد الخلايا البلعمة لأنه من الصعب أن نلاحظ جميع الخلايا البالعات والخلايا المبرمج في الأجنة كاملة بسبب سمكه. من أجل التغلب على هذا القيد، ونحن نطورإد مقايسة البلعمة الجديدة في الأجنة ذبابة الفاكهة . في طريقة لدينا، من أجل الاعتماد بسهولة هيموسيتس البلعمة، يتم تجانس الأجنة كلها لإعداد الخلايا الجنينية فرقت. يتم الكشف عن البالعات بواسطة المناعية من علامة البلعمة، ويتم الكشف عن الخلايا المبرمج بواسطة تونيل مع هذه الخلايا الجنينية المشتتة. استخدام الخلايا الجنينية فرقت تمكننا من قياس في مستويات البلعمة في الجسم الحي كما لو أجرينا فحص البلعمة في المختبر الذي يحدد بدقة مستوى البلعمة. ويمكن استخدام جميع الأنماط الجينية للذباب في هذا الفحص إذا تطورت إلى المرحلة 16 من الأجنة 20 ، والمرحلة التنموية التي إزالة الخلايا المبرمج من البلعمة هو الأكثر وفرة. هذه الطريقة لديها ميزة تقييم مستوى البلعمة كميا، وبالتالي، يمكن أن تسهم في تحديد جزيئات جديدة تشارك في البلعمة من الخلايا الأبوطوزية في الجسم الحي .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>whole swine serum</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>55993</td>
			<td>For bloking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Treff micro test tube(easy fit)&#160; Dnase, Rnase free tube, 1.5 mL</td>
			<td>TreffLab</td>
			<td>96. 4625. 9. 01</td>
			<td>For&#160; homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pellet mixer&#160; 1.5 mL</td>
			<td>TreffLab</td>
			<td>96. 7339. 9. 03</td>
			<td>For&#160; homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-0130</td>
			<td>For preparation of embryonic cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Thermo Fisher SCIENTIFIC</td>
			<td>27250-018</td>
			<td>For preparation of embryonic cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kpl Anti-Rat IgG (H+L) Ab MSA, AP</td>
			<td>KPL</td>
			<td>475-1612</td>
			<td>secondary antibody for 
			stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-bromo-4-chloro- 
			3-indolyl-phosphate</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11383221001</td>
			<td>BCIP, For staining of hemocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nitro blue tetrazolium</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11383213001</td>
			<td>NBT, For staining of hemocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Croquemort antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>described previously in Manaka et al, J. Biol. Chem., 279, 48466-48476</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Anti-GFP 
			from mouse IgG1&#954; (clones 7.1 and 13.1)&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11814460001</td>
			<td>For staining of hemocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG-AP Conjugate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-6520</td>
			<td>secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apop Tag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S7100</td>
			<td>For staining of apoptoitc cells. This kit includes Equilibration buffer, Reaction buffer, STOP/Wash buffer, TdT enzyme, and Anti-Digoxigenin-Peroxidase.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;-diaminobenzidine 
			tetrahydrichloride</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>11009-41</td>
			<td>DAB, For staining of apoptoitc cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Table of Fly Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w1118</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Control flies, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>drpr&#916;5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>drpr mutant, described in Freeman et al, Neuron, 38, 567-580</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Itgbn2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Itgbn mutant, described in Devenport et al., Development, 131, 5405-5415</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>srpHemoGAL4 UAS-EGFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>described in Br&#252;ckner et al., Dev. Cell., 7, 73-84</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-drpr-IR</td>
			<td>VDRC</td>
			<td>4833</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-Itgbn-IR</td>
			<td>NIG-fly</td>
			<td>1762R-1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phagocytosis assay for apoptotic cells in drosophila embryos

الآليات الجزيئية الكامنة وراء البلعمة من الخلايا المبرمج تحتاج إلى توضيح أكثر تفصيلا بسبب دورها في الأمراض المستعصية المناعية والالتهابية. نحن هنا وضعت طريقة تجريبية للتحقيق البلعمة كميا باستخدام ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة ، والتي يتم الحفاظ على شبكة الجينات التي تسيطر على تفاعلات إفراز من الناحية الدستورية من الثدييات. من أجل الكشف بدقة والاعتماد ابتلاع و أون-فولشينغ البالعات باستخدام الحيوانات بأكملها، تم تجانس الأجنة ذبابة الفاكهة للحصول على الخلايا المشتتة بما في ذلك البالعات والخلايا الأبوطوزية. استخدام الخلايا الجنينية فرقت تمكننا من قياس في مستويات الكريات البلعمة في الجسم الحي كما لو أجرينا فحص البلعمة في المختبر الذي من الممكن لمراقبة جميع الخلايا البالعات والخلايا المبرمج في الأجنة كاملة وتحديد بدقة مستوى البلعمة. وأكدنا أن هذه الطريقة تستنسخ تلك الدراسات السابقةالتي حددت الجينات المطلوبة لبلعمة الخلايا المبرمج. هذا الأسلوب يسمح إغراق الخلايا الميتة ليتم تحليلها، وعندما جنبا إلى جنب مع علم الوراثة قوية من ذبابة الفاكهة ، وسوف تكشف عن تفاعلات البلعمة المعقدة تتألف من الهجرة، والاعتراف، إنغولفنت، وتدهور الخلايا الأبوطوزية من قبل البالعات.

من أجل دراسة البلعمة من الخلايا المبرمج، تم جمع الأجنة ذبابة الفاكهة من المرحلة التنموية 16 وأعدت الخلايا كما فرقت. كانت ملطخة الضامة، الضامة ذبابة الفاكهة ، من قبل إمونوسيتوشيميستري للعلامة كريات الخلايا &quot;كروكيمورت&quot; 17 <s...

Watch this Scientific Journal Video about Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos at JoVE.com

Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

نحن هنا وصف مقايسة البلعمة باستخدام الخلايا الجنينية فرقت من ذبابة الفاكهة . أنها تمكننا من تحديد بسهولة ودقة في مستويات البلعمة في الجسم الحي ، وتحديد جزيئات جديدة مطلوبة للبلعمة من الخلايا أبوبتوتيك.

البلعمة فحص الخلايا الخلوية في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأجنة

The molecular mechanisms underlying the phagocytosis of apoptotic cells need to be elucidated in more detail because of its role in immune and ...

The overall goal of this procedure is to measure in vivo phagocytosis in Drosophila to assess the involvement of specific genes of interest in apoptotic cell engulfment. This method can help answer key questions in the immunology and developmental biology fields about the mechanisms involved in apoptotic cell engulfment. The main advantage of this technique is that the cells can be used easily and precisely measured in vivo phagocytosis levels.The implication of this technique extend toward therapy of inflammatory disorders and autoimmune disease as apoptotic cell by phagocytosis is necessary for removing dangerous cells that cause inflammation. Begin by adding 200 adult female and 200 adult male fruit flies and a plate of fresh grape juice agar on yeast into a 50 milliliter conical tube. Close the tube with a sponge cap and incubate the flies in the light at 16 degrees Celsius for two to three days.At the end of the incubation, move the flies to 25 degrees Celsius in the dark for one hour and replace the old plate with a new plate without yeast. Allow the flies to lay eggs for two hours. Then incubate the plate at 16 degrees Celsius for 26 hours.The next day, use a paint brush to transfer the embryos into one milliliter of PBS supplemented with 0.2%Triton X-100. After two washes, add 1.2 milliliters of sodium hypochlorite solution to the embryos to remove the chorion. After three minutes, wash the embryos four times in fresh PBS plus Triton X-100.Transfer the washed embryos onto a six centimeter agarose plate and place the plate under a dissecting microscope. Identify stage 16 embryos using a micro tip. Use a micro pipette to transfer approximately 50 of the stage 16 embryos into a 1.5 milliliter micro test tube.To isolate the embryonic cells, first wash the embryos two times with 150 microliters of PBS. Transfer the embryos into a new 1.5 milliliter micro test tube. Then add 200 microliters of collagenase and homogenize the embryos 30 times with a pellet mixer.At the end of the homogenization, triturate the embryonic cells 10 times and transfer the cell suspension into a new 1.5 milliliter tube. Incubate the cells at 37 degrees Celsius for one minute. Then triturate the cells 10 more times and return them to the 37 degrees Celsius incubator for another minute.At the end of the second incubation, add 800 microliters of PBS to the cells and collect the cells by centrifugation. Resuspend the pellet in 200 microliters of Trypsin before filtering the cell suspension through a 70 micron cell strainer. Stop the enzymatic activity with 40 microliters of heat inactivated fetal bovine serum in 800 microliters of PBS and collect the cells by centrifugation.Resuspend the precipitated cells in 200 microliters of fresh PBS and collect the cells with another centrifugation. Resuspend the pellet in 30 microliters of PBS and mount the cells onto an aminopropyltriethoxysilane-coated glass slide. When the cells have attached, use a pipette to remove the excess PBS from the slide and fix the cells with 60 to 70 microliters of 4%paraformaldehyde.After 10 to 15 minutes, remove the fixative and wash the cells in PBS for one minute. To immunostain the cells with anti-Croquemort antibody, first serially soak the slide in methanol then PBS supplemented with 0.2%Triton X-100 followed by PBS alone. Next, block the nonspecific binding with 20 microliters of 5%whole swine serum in PBS plus 0.2%Triton X-100 for 20 minutes at room temperature.Remove the excess blocking solution and label the cells with 20 microliters of anti-Croquemort antiserum at four degrees Celsius overnight. The next morning, wash the slide in PBS plus Triton X-100 for five 10-minute incubations. After the last wash, rinse the slide in PBS for 10 minutes.Then label the cells with 20 microliters of alkaline phosphatase-labeled Anti-Rat IgG at room temperature for one hour. At the end of the incubation, wash the slide five times in PBS plus Triton X-100 as demonstrated followed by a 10-minute soak in buffer solution. Then label the cells with phosphatase substrate solution and observe the cells under a light microscope.When strong purple signals appear in the hemocyte granules, remove the excess substrate and soak the slide in buffer supplemented with EDTA for five to 10 minutes. At the end of the incubation, rinse the cells with two five-minute PBS washes and treat them with equilibration buffer for 10 minutes. After removing the solution, label the cells with 20 microliters of terminal deoxynucleotidyl transferase solution at 37 degrees Celsius for one hour.Then remove the solution from the slide and soak the cells in 0.5 milliliters stop wash buffer in 17 milliliters of water for 10 minutes. Next, rinse the cells with three five-minute PBS washes and label them with 20 microliters of anti-digoxigenin peroxidase for 30 minutes at room temperature. At the end of the incubation, wash the cells four times in PBS as demonstrated and soak the slide in peroxidase substrate for 30-second increments until the apoptotic cells turn brown.When an optimal staining has been achieved, soak the slide in water to stop the peroxidase reaction. In these images, Drosophila macrophages called hemocytes were stained for the hemocyte marker Croquemort and for the presence of phagocytosed apoptotic cells by TUNEL in dispersed embryonic cells as just demonstrated. Croquemort positive cells exhibit purple signals in the small granules of their cells while TUNEL positive cells demonstrated brown signal in their whole corpuses.Alternatively, hemocytes can be stained with an anti-GFP antibody which stains the entire hemocyte instead of just the granules. In this experiment, the ratio of phagocytosing hemocytes to total hemocytes in wild type or single mutant embryos was analyzed, demonstrating that the phagocytic index was lower in both single mutant strains than in wild type flies while the total numbers of hemocytes and apoptotic cells were similar indicating the requirement of the mutated genes for apoptotic cell engulfment. RNAi knockdown of single genes also reduces the phagocytic index while the total numbers of hemocytes and apoptotic cells remained comparable, further underscoring the involvement of the investigated phagocytosis receptors in apoptotic cell mediated phagocytosis.Once mastered, this technique can be completed in about 15 hours if it is performed properly. While attempting this procedure, it's important to remember to avoid excess hemocyte marker and TUNEL staining for optimal evaluation of the phagocytotic ability of the cells. Following this procedure, in situ phagocytosis assay of all Drosophila embryos can be performed to answer additional questions about the site of engulfment or the distribution of the hemocytes.After its development, this technique paved the way for researchers in the immunology field to explore the mechanisms of apoptotic cell engulfment in Drosophila. After watching this video, you should have a good understanding of how to measure in vivo phagocytosis in Drosophila embryos.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Immunology and Infection

Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

Unit 1

Cell Death

SCIENTISTS IN ACTION

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

فحوص للكشف عن العوامل رني المضيفة المعنية في الوقس عدوى فيروس باستخدام ذبابة الفاكهة خلايا

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

المراقبة المباشرة للالبلعمة وNET تشكيل تلو العدلات في الرئتين المصابة باستخدام الميكروسكوب 2 - الفوتون

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

بعد الخلوي في مصير<em&gt; E. القولونية</em&gt; بعد الإصابة التي كتبها لامدا بالعاثية

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

استخدام الوحيدات أحادي الطبقة الفحص لتقييم البلعمة بوساطة مستقبلات Fcγ

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

التنمية والتحقق من جزيء واحد أولتراسينسيتيفي الصفيف الرقمي المرتبط بالانزيم مقايسة الممتز للبشرية انترفيرون-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Alveolar Macrophage Phagocytosis and Bacteria Clearance in Mice

البلعمه البلاعم السنخية وإزالة البكتيريا في الفئران

Alveolar macrophages (AMs) guard the alveolar space of the lung. Phagocytosis by AMs plays a critical role in the defense against invading pathogens, the ...

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

تقييم الاستجابة المناعية الخلوية ذبابة الفاكهة، melanogaster المورفولوجية، استخدام "في فيفو البلعمه بالانزيم"

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are ...

Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets

عزل الكريات البيض عن حليب الثدي البشري للاستخدام في فحص الفيغوسية الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة لأهداف فيروس نقص المناعة البشرية

Even in the absence of antiretroviral drugs, only ~15% of infants breastfed by HIV-infected mothers become infected, suggesting a strong protective effect ...

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

قياس كثرة الفندره من الرشاشيات تبخير كونيديا من قبل الكريات البيضاء البشرية باستخدام تدفق الخلوي

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...