Name: comprehensive protocol to sample and process bone marrow for measuring measurable residual disease and leukemic stem cells in acute myeloid leukemia
Uploaded: 2018-03-05T12:30:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia at JoVE.c

دعمت هذه البحوث "سرطان المجتمع الهولندي" (الب 2013-6371) ومؤسسة اجبيرس فونك. ونشكر الفريق الهولندي مكافحة غسل الأموال-MRD للتعاون وإجراء مناقشات مثمرة للتحسين المستمر، والتوحيد القياسي لمكافحة غسل الأموال-.

<ol>
	<li>D&#246;hner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+management+of+AML+in+adults:+2017+ELN+recommendations+from+an+international+expert+panel.">Diagnosis and management of AML in adults: 2017 ELN recommendations from an international expert panel.</a> Blood. 129 (4), 424-447 (2017).</li><li>Zwaan, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collaborative+Efforts+Driving+Progress+in+Pediatric+Acute+Myeloid+Leukemia.">Collaborative Efforts Driving Progress in Pediatric Acute Myeloid Leukemia.</a> J Clin Oncol. 33 (27), 2949-2962 (2015).</li><li>Cornelissen, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+European+LeukemiaNet+AML+Working+Party+consensus+statement+on+allogeneic+HSCT+for+patients+with+AML+in+remission:+an+integrated-risk+adapted+approach.">The European LeukemiaNet AML Working Party consensus statement on allogeneic HSCT for patients with AML in remission: an integrated-risk adapted approach.</a> Nat Rev Clin Oncol. 9 (10), 579-590 (2012).</li><li>Grimwade, D., Freeman, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+minimal+residual+disease+in+acute+myeloid+leukemia:+which+platforms+are+ready+for+&amp;#34;prime+time&amp;#34;?.">Defining minimal residual disease in acute myeloid leukemia: which platforms are ready for &amp;#34;prime time&amp;#34;?.</a> Hematology. 2014 (1), 222-233 (2014).</li><li>Kr&#246;nke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+minimal+residual+disease+in+NPM1-mutated+acute+myeloid+leukemia:+a+study+from+the+German-Austrian+acute+myeloid+leukemia+study+group.">Monitoring of minimal residual disease in NPM1-mutated acute myeloid leukemia: a study from the German-Austrian acute myeloid leukemia study group.</a> J Clin Oncol. 29 (19), 2709-2716 (2011).</li><li>Terwijn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+prognostic+impact+of+flow+cytometric+minimal+residual+disease+detection+in+acute+myeloid+leukemia:+data+from+the+HOVON/SAKK+AML+42A+study.">High prognostic impact of flow cytometric minimal residual disease detection in acute myeloid leukemia: data from the HOVON/SAKK AML 42A study.</a> J Clin Oncol. 31 (31), 3889-3897 (2013).</li><li>van der Velden, V. H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+significance+of+flowcytometric+minimal+residual+disease+detection+in+pediatric+acute+myeloid+leukemia+patients+treated+according+to+the+DCOG+ANLL97/MRC+AML12+protocol.">Clinical significance of flowcytometric minimal residual disease detection in pediatric acute myeloid leukemia patients treated according to the DCOG ANLL97/MRC AML12 protocol.</a> Leukemia. 24 (9), 1599-1606 (2010).</li><li>Ossenkoppele, G., Schuurhuis, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRD+in+AML:+time+for+redefinition+of+CR?.">MRD in AML: time for redefinition of CR?.</a> Blood. 121 (12), 2166-2168 (2013).</li><li>Feller, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRD+parameters+using+immunophenotypic+detection+methods+are+highly+reliable+in+predicting+survival+in+acute+myeloid+leukaemia.">MRD parameters using immunophenotypic detection methods are highly reliable in predicting survival in acute myeloid leukaemia.</a> Leukemia. 18 (8), 1380-1390 (2004).</li><li>Terwijn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukemic+stem+cell+frequency:+a+strong+biomarker+for+clinical+outcome+in+acute+myeloid+leukemia.">Leukemic stem cell frequency: a strong biomarker for clinical outcome in acute myeloid leukemia.</a> PLoS One. 9 (9), e107587 (2014).</li><li>Kalina, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EuroFlow+standardization+of+flow+cytometer+instrument+settings+and+immunophenotyping+protocols.">EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols.</a> Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).</li><li>Paietta, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+minimal+residual+disease+(MRD)+in+leukemia:+a+changing+definition+and+concept?.">Assessing minimal residual disease (MRD) in leukemia: a changing definition and concept?.</a> Bone Marrow Transplant. 29 (6), 459-465 (2002).</li><li>Loken, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residual+disease+detected+by+multidimensional+flow+cytometry+signifies+high+relapse+risk+in+patients+with+de+novo+acute+myeloid+leukemia:+a+report+from+Children's+Oncology+Group.">Residual disease detected by multidimensional flow cytometry signifies high relapse risk in patients with de novo acute myeloid leukemia: a report from Children's Oncology Group.</a> Blood. 120 (8), 1581-1588 (2012).</li><li>Zeijlemaker, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+one-tube+assay+for+immunophenotypical+quantification+of+leukemic+stem+cells+in+acute+myeloid+leukemia.">A simple one-tube assay for immunophenotypical quantification of leukemic stem cells in acute myeloid leukemia.</a> Leukemia. 30 (2), 439-446 (2015).</li><li>. Guidance for Collection, Transport and Submission of Specimens for Ebola Virus Testing Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/vhf/ebola/healthcare-us/laboratories/specimens.html">https://www.cdc.gov/vhf/ebola/healthcare-us/laboratories/specimens.html</a> (2017)</li><li>Bachas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+minor+subpopulations+within+the+leukemic+blast+compartment+of+AML+patients+at+initial+diagnosis+in+the+development+of+relapse.">The role of minor subpopulations within the leukemic blast compartment of AML patients at initial diagnosis in the development of relapse.</a> Leukemia. 26 (6), 1313-1320 (2012).</li><li>Ravandi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+minimal+residual+disease+assessed+by+multiparameter+flow+cytometry+is+highly+prognostic+in+younger+patients+with+acute+myeloid+leukemia.">Persistence of minimal residual disease assessed by multiparameter flow cytometry is highly prognostic in younger patients with acute myeloid leukemia.</a> Cancer. 123 (3), 426-435 (2017).</li><li>Hourigan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurable+residual+disease+testing+in+acute+myeloid+leukaemia.">Measurable residual disease testing in acute myeloid leukaemia.</a> Leukemia. 31 (7), 1482-1490 (2017).</li></ol>

وقدمت الكوكتيل الأجسام المضادة المستخدمة للتحقق الأنبوب الخلايا الجذعية في العديد من المعاهد المستقلة يرجى دينار بحريني. الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن فيما يتعلق بهذه المخطوطة.

وافرة من البيانات المتاحة التي تظهر الأدلة الإيجابية MRD يجري المرتبطة ببقاء الفقراء، وذلك التقييم MRD قد يحسن نتائج المريض بتوفير معلومات تشخيصية إضافية يمكن أن يكون أساسها القرارات السريرية. ومن ثم، طريقة متسقة ومنسقة لتقييم المناعية المظهرية MRD أمر أساسي لتحسين علاج المرضى في نهاية المطاف. هذا مهم أيضا عند مقارنة الدراسات السريرية عبر مختلف المواقع السريرية، وربما في نهاية المطاف المقرر مساعدة في السريرية مما يجعل وتخدم كنقطة نهاية مركب سريرية للبقاء على قيد الحياة عموما. فكرة أن هناك ما يبرر صلبة من المبادئ التوجيهية للقياسات MRD دقيقة ومتسقة أدى إلى عمل متضافر من شبكة اللوكيميا الأوروبية (جيش التحرير الوطني) لتصميم أحدث المبادئ التوجيهية. هذه الوثيقة الشاملة سيتم نشرها أواخر عام 2017، وسوف تكون مفيدة للعديد من مجموعات الدراسة والمختبرات التي تتحرك إلى الأمام.
الخطوات الحاسمة في إطار البروتوكول
هو جانبا هاما، وكثيراً ما يغفل التحليل MRD أثر نوعية العينة على تحديد دقيق ل MRD. هذا أكثر وضوحاً عندما بنقلها إلى المعاهد الأخرى في التجارب السريرية العالمية نظراً للاعتبارات التشغيلية الإضافية التي يجب أن تؤخذ في الاعتبار عند إعداد هذه المواد. للحد من خطر الخلط بين المريض المعلومات وتسليم إدارة العينات الكافية في الوقت المناسب أمر حاسم. مرة أخرى، في هذه المرحلة للنقل أشكال الصحيح و/أو استيراد نظم المستشفى الإلكترونية مع مهام واضحة للتحليل المطلوب المطلوب. مشيراً إلى مرحلة العلاج لأخذ العينات MRD هي أيضا حاسمة نظراً لأنها قد تكون ذات صلة للقرارات السريرية (على سبيل المثال بعد الدورة الثانية من العلاج) وذلك أن تعرف تعريفاً واضحا. استخدام بيانات وهمية (مثل على سبيل المثال 1 يناير كل سنة الميلاد) يزيد من خطر الخلط بين المرضى أو تحليلات. إذا كان ذلك مطلوباً بموجب القانون، ينبغي أن تستخدم طريقة مجهولة المصدر بديل لتحديد الهوية.
ينبغي معالجة جميع العينات إيمونوفينوتيبينج تفضيلي ضمن 24 ساعة جمع. على الرغم من غير المستحب، عينات الدم ونخاع العظام يمكن لا تزال معالجتها وتحليلها عند الاحتفاظ تصل إلى 72 ساعة في درجة حرارة الغرفة. وبالإضافة إلى ذلك، جميع هاندلينجس بالمادة يمكن أفضل إجراء تحت ظروف معقمة، حيث نعد المزيد من الخلايا في المصارف الأحيائية (المحلية) ما زالت ذات الصلة: العديد من الدراسات السريرية أن تحاليل إضافية لمواصلة التحقيق خلايا سرطان الدم مع احترام للسمات الجزيئية والمناعية المظهرية والوظيفية المراد تنفيذها في مرحلة لاحقة. إلا أن تفاصيل بيوبانكينج ليست ضمن نطاق هذه المخطوطة.
استخدام MRD كأداة تشخيص يعني أنها بحاجة إلى مختبرات معتمدة، ليس فقط لقياس التدفق، ولكن أيضا فيما يتعلق بمراقبة الجودة لتقييم MRD. وقد يتطلب توزيع العينات إلى مختبرات مرجعية محددة أو (إعادة) تحليل تدفق الملفات مع القياسات MRD فرق إشارة.
توضح هذه المقالة الإجراءات أهم من جمع aspirate نخاع العظام تصميم MRD في العينات السريرية-التي تحتاج إلى فريق كامل من الخبراء بمهام محددة، المسؤوليات، ومع كثرة الاتصالات فعالة الوصف والتحليل. نظراً لكل مهمة حاسمة بالنسبة للإجراء، من المستحسن أن يكون الصوت اللوجستية بما في ذلك البروتوكولات في كل مختبر وكافية أفراد الاحتياطي الذين تدربوا على وجه التحديد للمهمة. وبالإضافة إلى ذلك، أن هناك بعض الخطوات ذاتية نسبيا في جزء من الإجراءات (على خاصة ليب واحلركه تحديد علامة الشاذة)، أنها ضرورية لإجراء مناقشات حول النتيجة النهائية بالفريق، وقد أذنت بها فريق من التقرير النهائي المشرفين. الجهود المبذولة حاليا نسعى لتطوير برامج الكمبيوتر التي ستساعد على توحيد التحليل (ليب والمهارات).
التعديل واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
يمكن أن يكون لكل مختبر مجموعتها الخاصة من الأجسام المضادة التي يمكن استخدامها لتعريف مختلف الفئات السكانية الفرعية على الرغم من أن وجود العمود الفقري موحدة من علامات ضروري لنتائج مماثلة، كما ورد في المبادئ التوجيهية للدولة من الفن جيش التحرير الوطني للوثيقة القياسات MRD المشار إليها أعلاه. بصرف النظر عن علامات المختار وهناك بعض القضايا التي يمكن أن يجعل من الصعب تحليل النتائج وينبغي أن تؤخذ في الاعتبار.
القيود المفروضة على هذه التقنية
أولاً هو تحديد التعبير علامة الشاذة ليب والمهارات المقررة في التشخيص ورصدها مع مرور الوقت (أثناء وبعد العلاج) لتوصيف دقيق للنمط الظاهري MRD. في حين أن ما يزيد على 95% المرضى يمكن تقييمها عبر ليب أو المهارات (أو كليهما)، لا يزال بعض المرضى قد لا ليبس محددة أو لا CD34 + CD38-أو يقدم مع الانفجارات السلبية CD34، أو عينة تشخيص مفقودة. وفي هذه الحالات، أنها لا تزال جديرة بالاهتمام في محاولة لقياس MRD مع فريق من الأجسام المضادة واسعة كما يسمح عدد الخلايا المتوفرة ثم قم بتحديد الأكثر موثوقية (التمييز أقوى من الخلايا ليوكيميك إعطاء) ليب. وإذ ترى أن نسبة المرضى الذين الانتكاس في نهاية المطاف لا تشبه تماما إيمونوفينوتيبي التشخيص، نظراً لعدم تجانس المرض مكافحة غسل الأموال، وقياس فريق واسع من الأجسام المضادة في MRD يوصي على أية حال. هذه التحولات إيمونوفينوتيبيك وتشمل انفجار الخلايا ولسكس وقد ثبت أن تحدث أثناء العلاج16 ويمكن أن يستند هذا المرض measureable هؤلاء السكان القادمة ما يسمى. في هذا الوقت ومع ذلك، لا تقرر ما إذا كان جميع السكان الفرعية إيمونوفينوتيبيك سوف تؤدي إلى انتكاس المرض، وهو ذلك ممارسة غير شائعة تقرير العلاج مصممة على MRD استناداً إلى هذه الخلايا في التجارب السريرية. من المهم ملاحظة أن يتم تقليل مخاطر احلركه في عداد المفقودين بسبب التحولات السكانية بأنبوب واحد النهج التي هي أهم العلامات المميزة أبيرانسي في واحدة من التدفق الخلوي (PE) قناة14.
أهمية فيما يتعلق بالأساليب القائمة
الطريقة الموصوفة في هذا البروتوكول يعتمد على تعريف ليبس أو أكثر، الخلايا التي يتم اتباعها أثناء العلاج. عيوب هذا الأسلوب أن أنه تم مؤخرا أظهرت أن ليب قد تتغير أثناء العلاج. وبهذه الطريقة قد غاب بعض السكان القادمة مع علامات شاذة مختلفة. للالتفاف على هذا، سيكون من الأفضل لقياس كافة علامات شاذة بدلاً من فقط تلك التي عثر عليها في التشخيص. ثم هذا سيكون مماثلاً للنهج "مختلفة من العادية" التي يتم استخدامها من قبل عدة مختبرات17.
التطبيقات المستقبلية
في الآونة الأخيرة، تلقت MRD اهتمام إضافي لرواية تصميم التجربة السريرية. في العصر من خيارات العلاج المتخصص والعلاج بالعقاقير المستهدفة، باستخدام MRD كتدبير نتائج سوف يقلل الوقت اللازم لإقامة فعالية العلاجات الرواية، في نهاية المطاف مما يتيح إدخال أسرع من حاجة ملحة إلى العلاج السريري خيارات إلى العيادة. أهمية الخدمات اللوجستية المناسبة، وتنفيذ عملية تقييم MRD منسقة ذات أهمية حاسمة لنجاح العلاج مكافحة غسل الأموال في المستقبل كإدارة الأغذية والعقاقير حاليا بالتحقيق في إمكانية استخدام MRD كنقطة نهاية مركب بدلاً من البقاء على قيد الحياة عموما التدابير18.

سرطان الدم النقوي الحاد (مكافحة غسل الأموال) خبيثة من نخاع العظام تتسم بعيوب في البرنامج النضج، مع انتشار غير طبيعي وتراكم الخلايا السلف النقوي، تثبيط هيماتوبويسيس العادية، وفي نهاية المطاف فشل نخاع العظم . هذا المرض متغايرة جداً فيما يتعلق مورفولوجيا، إيمونوفينوتيبي، سيتوجينيتيكس، الانحرافات الجزيئية، والتوقيعات تعبير الجينات، وكذلك الاستجابة للمعالجة، ومعالجة نتائج1،2. الإدارة الحالية ويشمل العلاج الكيميائي التعريفي بهدف تحقيق مغفرة كاملة (CR)، تليها مغفرة بعد انتهاء العلاج، التي تسترشد بنتائج الجزيئية والخلوية الوراثية إلى حد كبير، والدراسات إيمونوفينوتيبيك وتتكون من أما عدة دورات من العلاج الكيميائي إضافية أو زرع الخلايا الجذعية (ذاتي أو متمكنة)3. على الرغم من معدلات عالية مغفرة الانتكاس بعد العلاج الكيميائي المكثف لتصل إلى 90%، البقاء على قيد الحياة 5 سنوات في البالغين فقط حوالي 30-40 ٪، أساسا بسبب تطوير التي هي عادة مقاومة للعلاج الكيميائي وصعبة جداً مما يؤدي علاج. نتائج في الأطفال أفضل، على الرغم من أن ما يقرب من ثلث أيضا الانتكاس. ولذلك، الكشف المبكر عن الانتكاس وشيك ستسد حاجة غير ملباة إلى طبية وقد توجه العلاج مغفرة بعد4.
الأمراض المتبقية بعد العلاج قد يعكس مجموع جميع التشخيص والتشخيص بعد انتهاء المقاومة آليات/العوامل؛ وبالتالي قد تكون قياس تشخيصية ومفيداً لتوجيه العلاج. إمكانية المرض deﬁning المتبقية (كان يسمى سابقا الأمراض المتبقية ضئيلة والأمراض المتبقية المشار إليها الآن على أنها قابلة للقياس أو MRD) أقل بكثير من المعيار المورفولوجية للخلايا انفجار 5% هو تغيير المناظر الطبيعية من خطر classiﬁcation. حاليا طريقتين تستخدم في الغالب للكشف عن MRD تدفق المستندة إلى الخلوي والجزيئي، القائم، هذا الأخير يجري تقييمها بعكس المنتسخة بكر (RT-qPCR)5 ، أو أن كان في مرحلة سابقة لأوانها، من الجيل التالي التسلسل (خ ع). أثبتت دراسات عديدة في البالغين، وكذلك كما هو الحال في الأطفال أن مختلف MRD النهج معلومات تشخيصية قوية في مكافحة غسل الأموال على حد سواء بعد التوجيهي وتدعيم العلاج6،7، وتعريفاً جديداً لعبء المرض ( متفوقة على الجمهورية التشيكية المورفولوجية) يظهر الآن8. وهذا يوحي بأن MRD المقررة بالتدفق و/أو التقنيات الجزيئية وينبغي أن تصبح، وفي الواقع الفعل أصبحت، القياسية في كل التجارب السريرية في مجال مكافحة غسل الأموال.
ويناقش هذه المخطوطة الإجراء الخلوي تدفق تفصيلية للحصول توصيف إيمونوفينوتيبيك دقيقة واستنساخه من MRD في عينات نخاع العظام، بما في ذلك أخذ عينات نخاع العظم وتجهيز الإجراءات السابقة للتدفق الخلوي. توافر عينات نخاع العظام ذات نوعية جيدة في التشخيص والمتابعة أمر حاسم لنجاح هذا القياس عبر المواقع السريرية والتجارب السريرية. في الواقع، هذه الاعتبارات التحليلية السابقة أيضا النهج MRD الأهمية الحيوية الجزيئية (PCR وخ ع). لوصف إيمونوفينوتيبيك MRD، تقترن علامات أبيررانتلي أعرب عادي النقوي وعلامات السلف، لتعريف إيمونوفينوتيبي المرتبطة بسرطان الدم (لايب)9. التدابير الناتجة عن ذلك للعديد من العوامل التي تؤثر على استجابة للعلاج، مثل مقاومة العقاقير اللوكيميا المتأصلة أو المكتسبة والدوائية وحركية من العلاج والترصد المناعي والامتثال. ولذلك، MRD معلمة تنبؤاتها قوية جداً بعد تشخيص المقترنة بالنتائج السريرية عند ديتشوتوميزيد على مستوى إنتاج يحدده تحليل خصائص التشغيل المتلقي (ROC). لأعمالنا فوج مكافحة غسل الأموال الكبار من هوفن 42a الدراسة، يتم تعيين مستوى وقف إنتاج المواد الانشطارية في 0.1% خلايا الدم البيضاء إيجابية إلى مجموع الخلايا ليب. باستخدام هذا المعيار لتحديد مركز MRD إيجابية مقابل السلبية، مجموعة من المرضى يمكن التعرف على الذين لديهم حالات الانتكاس أسوأ بكثير، والبقاء خالية من الانتكاس والإجمالية6. بالإضافة إلى ذلك، يصف لنا قياس خلايا اللوكيميا غير ناضجة، ومقاومة المخدرات مع ميزات مثل الخلايا الجذعية (CD34 + CD38-لوكيميا الخلايا الجذعية، أو المهارات)، الذي يقدم مؤشرا قويا لنتائج المريض10. معا ليب واحلركه نهج نموذج النهج MRD سيتوميتريك التدفق. والنهج ليب مناسبة لما يقرب من 90 في المائة المرضى، بينما يمكن تطبيق النهج احلركه في حوالي 80% من المرضى. معا لأكثر من 95% المرضى ويمكن تقييم معلمة واحدة أو على حد سواء.
وأخيراً، يقدم هذا المنشور وصفاً مفصلاً تشغيلية لتقييم MRD بالتدفق الخلوي. وهذا يشمل: 1) مواءمة و/أو توحيد إجراءات أخذ العينات نخاع العظم، 2) نموذج النقل التوجيه 3) الوصف المفصل للكشف عن الخلايا ليوكيميك مع نظام مراقبة الأصول الميدانية باستخدام لوحات جسم عدة بما في ذلك النهج أنبوب خلية مفردة وصف المهارات، 4) إنشاء نظام مراقبة الأصول الميدانية آلات لتوحيد القياسات، 5) برامج تحليلية للقياسات MRD و 6) برامج تحليلية للكشف عن المهارات.
ونحن نهدف إلى إظهار جميع جوانب الإجراء بما في ذلك إعداد عينة حيث أنه نادراً ما تناقش في حين أنها مسألة هامة للنوعية للنتيجة النهائية. تطلع نخاع العظام وخزعة هي الإجراءات السريرية المستخدمة لتقييم الخلايا المكونة للدم داخل نخاع العظام. وتجري هذه مع تعداد الدم الكامل (CBC) وتشهير الدم. الأسلوب الأمثل لتطلع نخاع العظام أمر حاسم لتشخيص دقيق ومتابعة للقياس. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن تتضمن aspirate ناجح نخاع العظام خلايا كافية لإجراء تحليل تدفق ليب والمهارات (خلايا قابلة للتطبيق على الأقل 10 مليون). هنا، يمكننا وصف طريقة أداء مطمح نخاع العظام، وتوفر المبادئ التوجيهية التي ينبغي أن يسفر كافية خلية أخذ العينات (وحدود إمكانات تخفيف الدم) اللازمة لتشخيص دقيق وإجراء بحوث إضافية. هذه الاعتبارات التحليلية السابقة أيضا النهج MRD الأهمية الحيوية الجزيئية (PCR وخ ع). ينبغي معالجة جميع العينات إيمونوفينوتيبينج تفضيلي ضمن 24 ساعة جمع. على الرغم من غير المستحب، عينات الدم ونخاع العظام يمكن لا تزال معالجتها وتحليلها عند الاحتفاظ تصل إلى 72 ساعة في درجة حرارة الغرفة. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي إجراء جميع هاندلينجس مع المواد تحت ظروف معقمة، تمكينا لتجميد خلايا عقيمة لأحدث البحوث/نوعية التقييم إلخ.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >120995496,060996589 and 013729</td>
			<td >FACS Canto II&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >555360</td>
			<td>CD7 FITC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >DAKO</td>
			<td >F076701</td>
			<td>CD2 FITC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Sanquin</td>
			<td >M1613</td>
			<td>CD36 FITC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >332778</td>
			<td>CD15 FITC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>335039</td>
			<td>CD45RA FITC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >345810</td>
			<td >CD56 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >337899</td>
			<td >CD22 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >345785</td>
			<td >CD14 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Miltenyi Biotec</td>
			<td >130-080-801</td>
			<td >CD133 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562566</td>
			<td>Clec12a PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565568</td>
			<td>Tim-3 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >332774</td>
			<td >CD7 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >333142</td>
			<td >CD11b PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >337899</td>
			<td >CD22 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >345810</td>
			<td >CD56 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >347222</td>
			<td >CD34 PERCP-CY5.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558714</td>
			<td>CD123 PERCP-CY5.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Beckman Coulter</td>
			<td>B49221</td>
			<td >CD117 PE-CY7</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562854</td>
			<td>CD33 BV421</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >345791</td>
			<td >CD19 APC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >333143</td>
			<td >CD11b APC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >345800</td>
			<td >CD33 APC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>345807</td>
			<td>CD38 APC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >641411</td>
			<td >HLA-DR APC-H7</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560532</td>
			<td>CD44 APC-H7</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >562596</td>
			<td >CD13 BV421</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>348811</td>
			<td>CD34 PE-CY7</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Beckman Coulter</td>
			<td>A96416</td>
			<td >CD45 Krome Orange</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>655873</td>
			<td >CD45 HV500c</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >655051</td>
			<td>CST beads&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >555899</td>
			<td>Pharm lysing solution</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >644204</td>
			<td>Multicolor CompBeads</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >655051</td>
			<td>CST beads</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td ></td>
			<td>FACSDiva software</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Cytognos</td>
			<td ></td>
			<td >Infinicyt&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Spherotech</td>
			<td>Euroflow RCP-30-5a</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td ></td>
			<td >Tuerk solution</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Spherotech</td>
			<td>BCP-100-5</td>
			<td>Blank Calibration Particles Beads</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#160;&#160;</td>
			<td >&#160;&#160;</td>
			<td >&#160;&#160;</td>
			<td >HSA</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#160;&#160;</td>
			<td >&#160;&#160;</td>
			<td >&#160;&#160;</td>
			<td >Azide</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#160;&#160;</td>
			<td >&#160;&#160;</td>
			<td >&#160;&#160;</td>
			<td >ddH2O</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comprehensive protocol to sample and process bone marrow for measuring measurable residual disease and leukemic stem cells in acute myeloid leukemia

معايير الاستجابة في سرطان الدم النقوي الحاد (مكافحة غسل الأموال) تم مؤخرا إعادة تأسيس، مع دراسة السمات المستخدمة في تحديد ما إذا كان المرضى قد حققت مغفرة كاملة (CR). ما يقرب من نصف المرضى الكبار الذين دخلوا الجمهورية التشيكية سوف الانتكاس في غضون 12 شهرا بسبب ثمرة خلايا مكافحة غسل الأموال المتبقية في نخاع العظام. كوانتيتيشن هذه تبقى خلايا اللوكيميا، المعروفة باسم الأمراض المتبقية ضئيلة أو قابلة للقياس (MRD)، يمكن أن يكون العلامات البيولوجية قوية للتنبؤ بهذه الانتكاسات. وعلاوة على ذلك، أظهر تحليل استعادي للعديد من الدراسات أن وجود MRD في نخاع العظام من المرضى مكافحة غسل الأموال ترتبط ببقاء الفقراء. ليس فقط من مجموع السكان ليوكيميك، وتنعكس إيواء لوكيميا المرتبطة بالخلايا المناعية-النمط/الظاهري (ليب)، المقترنة بالنتائج السريرية، ولكن ذلك هو يتدنى التردد المنخفض غير ناضجة من الخلايا الجذعية اللوكيميا (المهارات)، التي يمكن أن تكون ترصد من خلال التدفق الخلوي MRD أو النهج مثل MRD. توفر فحوصات الحساسة التي تمكن من الكشف عن خلايا اللوكيميا المتبقية (الجذعية) استناداً إلى الميزات الخاصة بالمرض أو المرتبطة بالمرض (الواسمات الجزيئية الشاذ أو الشاذة إيمونوفينوتيبيس) قد تحسنت كثيرا التقييم في مجال مكافحة غسل الأموال. ومع ذلك، نظراً لعدم تجانس المتأصلة والتعقيد لمكافحة غسل الأموال كمرض، أساليب لأخذ عينات من نخاع العظم وإجراء تحليل MRD والمهارات ينبغي مواءمة عندما يكون ذلك ممكناً. في هذه المخطوطة يمكننا وصف منهجية مفصلة لنخاع العظم كافية أسبيراتي أخذ العينات، النقل، ونماذج تجهيز للتقييم الأمثل متعدد الألوان التدفق الخلوي، والنابضة استراتيجيات تقييم MRD والمهارات للمساعدة في اتخاذ القرار العلاجي للمرضى في مجال مكافحة غسل الأموال.

90% مرضى مكافحة غسل الأموال يمكن أن يحدد ليب واحد على الأقل. من أجل توليد نسب دقيقة من ليب + الخلايا من الخلايا البدائية الانفجار عند التشخيص، الإعداد المناسب لبوابة الانفجار أمر بالغ الأهمية ويحتاج التحقق كتصور في الشكل 3. مثال لكل مريض إيواء نوع معين من أبيرانسي على الخلايا البدائية CD34 + هو متصور في الشكل 5. لقياس MRD في المتابعة، في وقت سابق المعرفة ليب + الخلايا هي بوابات والمحددة كنسبة مئوية من ليب + خلايا مكافحة حرائق آبار النفط. ومن ثم وضع هذه البوابة أمر حاسم لتحقيق النتائج MRD الحق. ويبين الشكل 6 مريض الذي لا يزال في مغفرة كاملة ومريض أن الانتكاس بعد النتائج الإيجابية (≥ 0.1 ٪) بعد الدورة الثانية من العلاج التعريفي.
البروتوكول الحالي فقط مناسبة لتعريف الخلايا الجذعية في CD34 + الخلايا، حيث وصف دقيق لهذه المقصورة قد أظهرت أن CD38-السكان المرافئ الخلية الجذعية أقوى مثل الكسر. وتستخدم من أجل فصل المهارات من HSC داخل هذا الكسر، علامات إضافية. هي علامات المحدد في أغلب الأحيان لتمييز احلركه CD45RA والقناة كومبي إيواء 6 علامات احلركه محددة وصفت مع PE. استناداً إلى التقييمات السريرية الأخرى، مستوى إنتاج ≥ 0.004% عرف بأنه إيجابي احلركه وترافق مع بقاء أسوأ في التشخيص بينما كان يستخدم الحد الأدنى من 0.0001% في يلي حتى10.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig1.jpg"> الشكل 1 : لطاخة نخاع العظام. المانحة A) صحية والمريض ب) مكافحة غسل الأموال (النوع الفرعي 5 القوات المسلحة البوروندية). جيمسى وصمة عار في التكبير 100 x. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig2.jpg"> الشكل 2 : تصحيح مواد التغليف للسوائل البيولوجية. يمكن الاطلاع على مزيد من التفاصيل عن قواعد وأنظمة نقل السوائل البيولوجية في الموقع15 من مراكز "السيطرة على الأمراض" والوقاية. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig3.jpg"> الشكل 3 : استراتيجية لتحديد انفجار الخلايا النابضة. A) النابضة CD45dim، ب) النابضة CD34 + الانفجارات.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig4.jpg"> الشكل 4 : النابضة لمفاوية. A) الخلايا الزرقاء هي مكافحة حرائق آبار النفط سيظهر في منتدى التعاون الأمني/SSC الأرض، خلايا ب) الخضراء هي الخلايا الليمفاوية تميزت CD45عالية/SSCمنخفضة، ج) أمثلة سلبية ل CD34، د) سلبية ل CD117 و E) سلبية ل CD13، أنواع الخلايا المختلفة و) تظهر في نظرة عامة حول شجرة السكان. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig5.jpg"> الشكل 5 : ليبس في تشخيص مكافحة غسل الأموال- A) ليب استناداً إلى الصليب أبيرانسي النسب (CD7 على الخلايا وإذ تعرب عن CD33)، ب) ليب القائم على التفرقة غير متزامن (CD11b على الخلايا CD13 إذ تعرب عن)، ليب ج) استناداً إلى مقارنة بالخلايا العادية (CD34عالية جداً في CD13 معربا عن الخلايا)، أوفيريكسبريشن د). ليب استناداً إلى أونديريكسبريشن مقارنة بالخلايا العادية (الدكتور هلامنخفضة في CD33 التعبير عن الخلايا). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig6.jpg"> الرقم 6 : لايب اتباعها أثناء العلاج. تعريف A) ليب في التشخيص (CD34 + CD13 + CD33-) وفقدان ليب أثناء متابعة مريض الذي بقي في مغفرة كاملة متواصلة، تعريف ب) ليب في التشخيص (CD117 + CD7 + CD33 +) واستمرار ليب أثناء متابعة مريض الذي انتكست. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig6large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig7.jpg"> الشكل 7 : الخلايا الجذعية النابضة. أ) Gating CD34 مختلفة + CD38 السكان استناداً إلى الخرز (CD38منخفضة أدناه الحد العلوي من الخرز، بينما CD38 تم تعريفها كالخلايا سلبية حقيقية تمثل المهاراتمنخفضة جداً وتوجد أدناه متوسط الخرز)، ب) اثنين أمثلة للمرضى الذين يعانون من التمييز بين HSC والمهارات في المتابعة على أساس CD45RAالراتب والتعبير CD45RAنقاط البيع . <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig7large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
الملف الإضافي 1- <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/Sampling_Form_MRD_1.pdf" target="_blank">الرجاء النقر هنا ل downoad هذا الملف.</a>
ملف إضافي 2- <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/Sampling_Form_MRD_2.pdf" target="_blank">الرجاء النقر هنا ل downoad هذا الملف.</a>
ملف إضافي 3- <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/Supplementary_information_revised_Cloos_et_al_final2018.docx" target="_blank">الرجاء النقر هنا ل downoad هذا الملف.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia at JoVE.c

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

الكشف عن الأمراض المتبقية ضئيلة أو قابلة للقياس (MRD) هو العلامات البيولوجية تشخيصية هامة لتحسين تقييم المخاطر والتنبؤ بانتكاسة في سرطان الدم النقوي الحاد (مكافحة غسل الأموال). هذه مبادئ توجيهية شاملة وتوصيات مع أفضل الممارسات لتحديد هوية ثابتة ودقيقة واكتشاف MRD، يمكن أن تساعد في صنع قرارات علاج فعالة لمكافحة غسل الأموال.

بروتوكول شامل للعينة ونخاع العظام عملية قياس الأمراض المتبقية قابلة للقياس والخلايا الجذعية ليوكيميك في سرطان الدم النقوي الحاد

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

The overall goal of this protocol is to perform an accurate testing of bone marrow samples from acute myeloid leukemia patients for measurable residual disease including the quantification of leukemia stem cells. This method can provide an accurate assessment of measurable residual disease in bone marrow samples of acute myeloid leukemia patients. The main advantage of this approach is that a close following of the protocol yields highly-reproducible, high-quality results.The implications of this technique extends toward clinical decision-making as it can be used as a read-out of patients'response to treatment. Demonstrating the procedures will be Jeroen Janssen, hematologist, Gerrit Sijm, technician of the diagnostic hematology laboratory and Jennifer Scheick and Sander Snel, technicians of the MRD team. With the patient in the lateral decubitus position, mark the superior posterior iliac spine with a pen and disinfect the skin of the intended biopsy area with 0.5 to 1%chlorhexidine in ethanol in an outward circular motion.After administering a local anesthetic, pick up a 15-gauge 2.8-inch needle with the proximal end in the palm and the index finger against the side of the metal shaft of the needle near the tip for control. Using gentle but firm pressure, introduce the needle with a quick alternating pronating supinating movement through the anesthetized skin toward the iliac spine. When the needle comes into contact with the posterior iliac spine, remove the stilette and attach an empty 10-milliliter syringe to the needle.Gently withdraw the plunger to create negative pressure within the syringe until up to 10 milliliters of bone marrow spicules have been harvested. Do not take more than 10 mils of bone marrow per aspirate to avoid hemodilution. Remove the syringe and place the stilette back onto the needle.Then, eject about two milliliters of the marrow into a watch glass and ensure that enough sample is drawn to be injected into a heparin-coated eight-milliliter tube and immediately invert the tube. To prevent clotting, it is important to invest the anticoagulant-containing tube as soon as the bone marrow is added. For optimal morphological assessment, use a plastic spatula to transfer spicules from the aspirate in the watch glass onto a glass slide, and carefully glide another glass slide on top of the marrow.After drying, stain the spicules with May-Grunwald Giemsa for analysis by light microscopy. Place the bone marrow tube in a plastic holder and place the holder into a plastic container with an ambient gel pack and a completed request form. Before analyzing the bone marrow by flow cytometry, start up the flow cytometer and open the flow cytometry analysis software to create a new experiment with a forward scatter versus side scatter dot plot.For assessment of the size and granularity of the cells, load unlabeled lysed peripheral blood cells from a healthy donor and select the Acquire Cells function. Gate the lymphocytes and adjust the forward and side scatter voltages to reach the appropriate mean target values for the gated cell population. Then, acquire data for at least 10, 000 events.To set up the target florescence channel photo multiplier tube voltages, first use eight-peak rainbow bead calibration particles according to the manufacturer's instructions to acquire 10, 000 events at a low flow rate. Gate the singlet beads in the forward versus side scatter dot plot followed by gating the 7th peak in the FITC-PE dot plot. Gate the resulting bead populations for each fluorophore.Continue the acquisition of the eight-peak rainbow bead suspension and adjust and fine-tune PMT voltages in all fluorescence channels to reach target MFI values according to the manufacturer's instructions. Use Record to collect data of about 2, 000 events and check the MFI for the 7th peak beads. Next, add a sufficient volume of each experimental flourochrome conjugated antibody to stain the beads in the corresponding florescence tubes minus one control and vortex the tubes thoroughly.Create a new blank experiment with the same compensation parameters taking care that the forward scatter threshold is set to 5, 000 and the compensation values of all the flourochromes are zero. To create the compensation controls, select the Create Compensation Control function and load the unstained control tube. Adjust the P1 gate around the singlet bead population and confirm that the P1 gate contains only singlet beads.Right-click the P1 gate and select Apply to All Compensation Controls. Then, record data for all of the single labeled florescence tubes confirming that the P2 gate encompasses the positive population on each florescence histogram. To stain the cells for flow cytometric analysis, transport the bone marrow to the laboratory, check the request form to verify patient study number and date of birth and determine what needs to be stained.For MRD, we use a staining panel consisting of four tubes. Here we demonstrate the staining of the LSC panel which consists of one tube. After cell count, transfer the appropriate volume of bone marrow into a new 15-milliliter tube.Add lysis buffer at 10 times the experimental cell volume to lyse the red blood cells. Invert the tube to mix and incubate the cells for 10 minutes at room temperature. At the end of the lysis period, pellet the cells by centrifugation.Resuspend the cells in 15 milliliters of wash buffer at room temperature and harvest the cell pellet again by centrifugation. In the meantime, pipette the appropriate amount of antibody cocktail solution in five-milliliter FACS tubes. Shown here is the panel for the stem cell tube.Resuspend the pellet in wash buffer and add the cell's suspension to the FACS tube containing the monoclonal antibody cocktail solution for a 15-minute incubation in the dark. Then, wash the cells in wash buffer and pellet the cells by centrifugation. After centrifugation, resuspend the pellet in 400 microliters of fresh wash buffer.To analyze the leukemic stem cells, add four microliters of blank beads to the cell suspension that is stained with the stem cell antibody cocktail. Then, read the samples using the previously set parameters acquiring at least four times 10 to the 6th events from the experimental patient samples. To identify the leukemia-associated immunophenotype observed in approximately 90%of acute myeloid leukemia patients, it is crucial that the blast gates are set appropriately as illustrated.Here, examples of data from individual patients harboring different types of aberrancy on the CD34-positive primitive cells are shown. In these graphs, a patient who remains in complete remission and a patient who relapsed after having measurable residual disease positive results after the second cycle of induction therapy can be observed underscoring the need for accurate gate setting prior to sample analysis. The identification and quantification of LSC requires additional analysis of aberrancies specifically on CD34-positive CD38-negative blast cells as shown in these graphs.While performing this protocol, it's very important to have specialized and backup personnel for the bone marrow sampling, the transport, the experimental work and analysis steps of this procedure. This procedure can also be used to perform cytogenetic and molecular analysis to answer additional questions about the correlation between specific cell populations and molecular aberrancies of interest, or to refine the risk group of a patient for predicting clinical outcome. After its development, this technique paved the way for researchers in the field of hematology to explore residual disease in AML patients after treatment.After watching this video, you should have a good understanding how we accurately identify and quantify residual disease by using flow cytometry including the collection and transportation of bone marrow samples of AML patients.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model

بروتوكول مفصل للتميز الخط خلية الفئران C1498 ونموذج أسوشيتد اللوكيميا ماوس ل

The intravenous injection of C1498 cells into syngeneic or congenic mice has been performed since 1941. These injections result in the development of ...

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

بروتوكول للثقافة السريع بعد الوفاة خلية من منتشر الجوهرية جسري بالورم الدبقي (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

إعداد الخلايا الأولية من سرطان الدم الليمفاوي الحاد في مراحل مختلفة من دورة الخلية بالطرد المركزي الوترياتيون

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

تتحرك صعودا: بسيطة ومرنة في المختبر غزو ثلاثية الأبعاد مقايسة بروتوكول

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

التدفق الخلوي لتقدير لوكيميا الخلايا الجذعية في الابتدائي سرطان الدم النقوي الحاد والمريض-المشتقة-تكثيفها، في التشخيص والمتابعة حتى

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

قياس إعادة عرض العظام وإعادة إنشاء بيئة الورم والعظام الدقيقة باستخدام ثقافة كالفاريا المشتركة والقياس الHISTOMORPHometry

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

تحليل مقياس التدفق لأنواع الأكسجين التفاعلي الميتوكوندريا في الجذعية المكونة للدم وخلايا البروجينوتريو وابيضاض الدم المدفوع MLL-AF9

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone

نمذجة أورام العظام الأولية وورم خبيث في العظام مع زرع طعم الورم الصلب في العظام

Primary bone tumors or bone metastasis from solid tumors result in painful osteolytic, osteoblastic, or mixed osteolytic/osteoblastic lesions. These ...

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

نهجين تدفق القياسات الخلوية من NKG2D ليغاند الكشف عن السطح لتمييز الخلايا الجذعية من الخلايا الفرعية السائبة في سرطان الدم النخاعي الحاد

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice

زرع داخل الصفاق لتوليد سرطان الدم النخاعي الحاد في الفئران

There is an unmet need for novel therapies to treat acute myeloid leukemia (AML) and the associated relapse that involves persistent leukemia stem cells ...