Name: comprehensive protocol to sample and process bone marrow for measuring measurable residual disease and leukemic stem cells in acute myeloid leukemia
Uploaded: 2018-03-05T12:30:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia at JoVE.c

Dit onderzoek heeft al ondersteund door Nederlandse Cancer Society (ALPE 2013-6371) en Egbers foundation voor VONK. We danken de Nederlandse AML-MRD-werkgroep voor de samenwerking en vruchtbare discussies voor continue verbetering en standaardisatie van AML-MRD.

<ol>
	<li>D&#246;hner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+management+of+AML+in+adults:+2017+ELN+recommendations+from+an+international+expert+panel.">Diagnosis and management of AML in adults: 2017 ELN recommendations from an international expert panel.</a> Blood. 129 (4), 424-447 (2017).</li><li>Zwaan, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collaborative+Efforts+Driving+Progress+in+Pediatric+Acute+Myeloid+Leukemia.">Collaborative Efforts Driving Progress in Pediatric Acute Myeloid Leukemia.</a> J Clin Oncol. 33 (27), 2949-2962 (2015).</li><li>Cornelissen, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+European+LeukemiaNet+AML+Working+Party+consensus+statement+on+allogeneic+HSCT+for+patients+with+AML+in+remission:+an+integrated-risk+adapted+approach.">The European LeukemiaNet AML Working Party consensus statement on allogeneic HSCT for patients with AML in remission: an integrated-risk adapted approach.</a> Nat Rev Clin Oncol. 9 (10), 579-590 (2012).</li><li>Grimwade, D., Freeman, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+minimal+residual+disease+in+acute+myeloid+leukemia:+which+platforms+are+ready+for+&amp;#34;prime+time&amp;#34;?.">Defining minimal residual disease in acute myeloid leukemia: which platforms are ready for &amp;#34;prime time&amp;#34;?.</a> Hematology. 2014 (1), 222-233 (2014).</li><li>Kr&#246;nke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+minimal+residual+disease+in+NPM1-mutated+acute+myeloid+leukemia:+a+study+from+the+German-Austrian+acute+myeloid+leukemia+study+group.">Monitoring of minimal residual disease in NPM1-mutated acute myeloid leukemia: a study from the German-Austrian acute myeloid leukemia study group.</a> J Clin Oncol. 29 (19), 2709-2716 (2011).</li><li>Terwijn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+prognostic+impact+of+flow+cytometric+minimal+residual+disease+detection+in+acute+myeloid+leukemia:+data+from+the+HOVON/SAKK+AML+42A+study.">High prognostic impact of flow cytometric minimal residual disease detection in acute myeloid leukemia: data from the HOVON/SAKK AML 42A study.</a> J Clin Oncol. 31 (31), 3889-3897 (2013).</li><li>van der Velden, V. H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+significance+of+flowcytometric+minimal+residual+disease+detection+in+pediatric+acute+myeloid+leukemia+patients+treated+according+to+the+DCOG+ANLL97/MRC+AML12+protocol.">Clinical significance of flowcytometric minimal residual disease detection in pediatric acute myeloid leukemia patients treated according to the DCOG ANLL97/MRC AML12 protocol.</a> Leukemia. 24 (9), 1599-1606 (2010).</li><li>Ossenkoppele, G., Schuurhuis, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRD+in+AML:+time+for+redefinition+of+CR?.">MRD in AML: time for redefinition of CR?.</a> Blood. 121 (12), 2166-2168 (2013).</li><li>Feller, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRD+parameters+using+immunophenotypic+detection+methods+are+highly+reliable+in+predicting+survival+in+acute+myeloid+leukaemia.">MRD parameters using immunophenotypic detection methods are highly reliable in predicting survival in acute myeloid leukaemia.</a> Leukemia. 18 (8), 1380-1390 (2004).</li><li>Terwijn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukemic+stem+cell+frequency:+a+strong+biomarker+for+clinical+outcome+in+acute+myeloid+leukemia.">Leukemic stem cell frequency: a strong biomarker for clinical outcome in acute myeloid leukemia.</a> PLoS One. 9 (9), e107587 (2014).</li><li>Kalina, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EuroFlow+standardization+of+flow+cytometer+instrument+settings+and+immunophenotyping+protocols.">EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols.</a> Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).</li><li>Paietta, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+minimal+residual+disease+(MRD)+in+leukemia:+a+changing+definition+and+concept?.">Assessing minimal residual disease (MRD) in leukemia: a changing definition and concept?.</a> Bone Marrow Transplant. 29 (6), 459-465 (2002).</li><li>Loken, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residual+disease+detected+by+multidimensional+flow+cytometry+signifies+high+relapse+risk+in+patients+with+de+novo+acute+myeloid+leukemia:+a+report+from+Children's+Oncology+Group.">Residual disease detected by multidimensional flow cytometry signifies high relapse risk in patients with de novo acute myeloid leukemia: a report from Children's Oncology Group.</a> Blood. 120 (8), 1581-1588 (2012).</li><li>Zeijlemaker, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+one-tube+assay+for+immunophenotypical+quantification+of+leukemic+stem+cells+in+acute+myeloid+leukemia.">A simple one-tube assay for immunophenotypical quantification of leukemic stem cells in acute myeloid leukemia.</a> Leukemia. 30 (2), 439-446 (2015).</li><li>. Guidance for Collection, Transport and Submission of Specimens for Ebola Virus Testing Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/vhf/ebola/healthcare-us/laboratories/specimens.html">https://www.cdc.gov/vhf/ebola/healthcare-us/laboratories/specimens.html</a> (2017)</li><li>Bachas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+minor+subpopulations+within+the+leukemic+blast+compartment+of+AML+patients+at+initial+diagnosis+in+the+development+of+relapse.">The role of minor subpopulations within the leukemic blast compartment of AML patients at initial diagnosis in the development of relapse.</a> Leukemia. 26 (6), 1313-1320 (2012).</li><li>Ravandi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+minimal+residual+disease+assessed+by+multiparameter+flow+cytometry+is+highly+prognostic+in+younger+patients+with+acute+myeloid+leukemia.">Persistence of minimal residual disease assessed by multiparameter flow cytometry is highly prognostic in younger patients with acute myeloid leukemia.</a> Cancer. 123 (3), 426-435 (2017).</li><li>Hourigan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurable+residual+disease+testing+in+acute+myeloid+leukaemia.">Measurable residual disease testing in acute myeloid leukaemia.</a> Leukemia. 31 (7), 1482-1490 (2017).</li></ol>

De antilichaam-cocktails gebruikt voor de validatie van de stamcel buis in verschillende onafhankelijke instituten werden beschikbaar gesteld door BD. De auteurs hebben niets te vermelden in verband met dit manuscript.

Voldoende gegevens zijn beschikbaar die bewijzen voor MRD positiviteit wordt geassocieerd met slechte overleven, en daarom MRD beoordeling geduldige resultaten kan verbeteren door extra prognostische informatie waarop klinische beslissingen kunnen worden genomen. Een consistente en geharmoniseerde methode voor immuno-fenotypische beoordelingvan MRD is dus essentieel om uiteindelijk patiënt therapie. Dit is ook belangrijk bij het vergelijken van klinische studies in verschillende klinische sites, en kan uiteindelijk helpen in de klinische beslissing maken en serveren als een surrogaat klinisch eindpunt voor algehele overleving. De notie dat solide richtsnoeren voor nauwkeurige en consistente MRD metingen zijn gerechtvaardigd heeft geleid tot een gezamenlijke actie van het Europese netwerk voor leukemie (ELN) aan de richtlijnen van de stand van de techniek van het ontwerp. Dit uitgebreide document gepubliceerd eind-2017 zal worden, en zullen instrumentale voor vele studiegroepen en laboratoria vooruit.
Kritische stappen binnen het protocol
Een belangrijke en vaak onderbelicht aspect van MRD analyse is de impact van monster kwaliteit op de nauwkeurige bepaling van MRD. Dit is duidelijker wanneer materiaal worden vervoerd naar andere instituten in wereldwijde klinische tests moet, de extra operationele overwegingen die moeten worden genomen in deze instelling rekening gegeven. Om het risico van het vermengen van patiënt is informatie en tijdige levering van de monsters voldoende administratie cruciaal. Nogmaals, in dit stadium van het vervoer de juiste vormen en/of invoer in elektronische ziekenhuissystemen met duidelijke opdrachten van de gevraagde analyse is vereist. Overwegende het stadium therapie MRD bemonstering is ook cruciaal omdat het relevant kan zijn voor klinische besluitvorming (bijvoorbeeld na de tweede loop van de therapie) en moet daarom duidelijk worden omschreven. Het gebruik van mock gegevens (zoals bijvoorbeeld 1 januari per geboortejaar) verhoogt het risico van het vermengen van patiënten of analyses. Indien vereist door de wet, moet een alternatieve geanonimiseerde manier van identificatie worden gebruikt.
Alle exemplaren voor immunophenotyping moeten bij voorkeur binnen de 24 uur van collectie worden verwerkt. Hoewel niet aan te bevelen, kunnen beenmerg en perifeer bloedmonsters nog steeds worden verwerkt en geanalyseerd wanneer maximaal 72 uur bij kamertemperatuur bewaard. Daarnaast alle handlings met het materiaal kunnen best worden uitgevoerd onder steriele condities, zodat verdere cryopreservatie van cellen in de (lokale) biobanken relevant blijft: veel klinische studies hebben aanvullende analyses ter verdere onderzoeken leukemie cellen met betrekking tot moleculaire, immuno-fenotypische en functionele functies op een later tijdstip moet worden uitgevoerd. Details van biobanking zijn echter niet binnen de werkingssfeer van dit manuscript.
Met behulp van MRD als een diagnostisch hulpprogramma impliceert dat het een erkend laboratorium, niet alleen voor stroom cytometry, maar ook met betrekking tot de kwaliteitscontrole van MRD beoordeling moet. Hiervoor kunnen distribueren monsters aan specifieke referentielaboratoria of (her) analyseren van stroom bestanden met de MRD metingen door verwijzing teams.
Dit artikel beschrijft de belangrijkste acties uit het beenmerg aspirate collectie voor bepaling van MRD in klinische monsters - een volledig team van deskundigen met specifieke taken, verantwoordelijkheden, en met frequente mededeling vereisen voor effectief karakterisering en analyse. Aangezien elke taak cruciaal voor de procedure is, is het aanbevolen om het hebben van geluid logistiek met inbegrip van de protocollen bij elke laboratorium en voldoende personeel van de back-up die speciaal zijn opgeleid voor de taak. Bovendien, aangezien er zijn enkele relatief subjectieve stappen in een deel van de procedures (met name LAIP en LSC aberrant marker identificatie), is het essentieel hebben de discussies over het eindresultaat door het team, en het definitieve verslag gemachtigd door een team van toezichthouders. Huidige inspanningen zijn het nastreven van ontwikkeling van software die u zullen helpen de (LAIP en LSC) MRD analyse te standaardiseren.
Wijziging en probleemoplossing
Elk lab kan een eigen set van antilichamen die kan worden gebruikt voor het definiëren van de verschillende subpopulaties, hoewel met een gestandaardiseerde ruggengraat van markeringen essentieel voor vergelijkbare resultaten, is zoals uiteengezet in de richtsnoeren van de stand van de techniek ELN voor MRD metingen document hebben genoemde. Ongeacht de gekozen markers, er zijn enkele problemen die kunnen bemoeilijken de analyse van de resultaten en moeten in aanmerking worden genomen.
Beperkingen van de techniek
De identificatie van LAIP en LSC aberrant marker-expressie is eerst beoordeeld op de diagnose en trendmatige (tijdens en na de therapie) voor nauwkeurige karakterisering van het fenotype MRD. Terwijl meer dan 95% van de patiënten kan worden geëvalueerd via LAIP of LSC (of beide), nog sommige patiënten hebben geen gedefinieerde LAIPs of geen CD34 + CD38-LSCs presenteren met CD34 negatieve ontploffingen, of hebben een ontbrekende diagnose monster. In deze gevallen is het nog de moeite waard om te proberen en MRD meten met een panel van antilichamen zo breed als het aantal beschikbare cellen mogelijk maakt en selecteer vervolgens het meest betrouwbare (geven de sterkste onderscheid van leukemische cellen) LAIP. Gezien het feit dat een deel van de patiënten die uiteindelijk terugvallen niet volledig lijken op de diagnose immunophenotype, als gevolg van de heterogeniteit van AML ziekte, hoe dan ook een brede panel van antilichamen bij MRD meten wordt aanbevolen. De verschuivingen van deze immunophenotypic omvatten blast cellen en LSCs en is aangetoond dat het optreden tijdens therapie16 en de measureable ziekte kan worden gebaseerd op deze zogenaamde komende bevolking. Op dit moment echter, is niet vastgesteld of alle immunophenotypic subpopulatie tot ziekte herval leiden zal, en is daarom niet gebruikelijk om te rapporteren MRD op maat-therapie op basis van deze cellen in klinische proeven. Het is belangrijk op te merken dat het risico van ontbrekende LSC als gevolg van verschuivingen van de bevolking wordt verminderd door de aanpak van de ene buis waarin de belangrijkste bepalende aberrancy-markers in een stroom cytometry (PE) kanaal14 zijn.
Betekenis ten opzichte van bestaande methoden
De in dit protocol beschreven methode is afhankelijk van de definitie van een of meer LAIPs, welke cellen worden gevolgd tijdens therapie. Een nadeel van deze methode is dat het heeft onlangs aangetoond dat LAIP tijdens de therapie veranderen kunnen. Op deze manier die sommige aanstaande populaties met verschillende afwijkende markers kunnen worden gemist. Om te omzeilen dit, zou het beste zijn voor het meten van alle afwijkende markeerders in plaats van alleen die gevonden op diagnose. Dit zou vervolgens zijn vergelijkbaar met de "verschillend van normale" aanpak die wordt gebruikt door verschillende laboratoria17.
Toekomstige toepassingen
MRD heeft onlangs, extra aandacht voor nieuwe klinische proefopzet gekregen. In het tijdperk van gespecialiseerde behandelingsopties en gerichte medicamenteuze therapie, het gebruik van MRD als resultaat maatregel zal verminderen de tijd die nodig is om de klinische werkzaamheid van nieuwe behandelingen, uiteindelijk zodat snellere invoering van dringend therapeutische opties in de kliniek. Het belang van passende logistieke en praktische uitvoering van een geharmoniseerde MRD beoordeling zijn cruciaal voor toekomstige AML behandeling succes zoals de FDA onderzoekt momenteel de haalbaarheid van het gebruik van MRD als het eindpunt van een surrogaat in plaats van de totale overleving meet18.

Acute myeloïde leukemie (AML) is dat een maligniteit van het beenmerg gekenmerkt door gebreken in het programma van de rijping, met abnormale verspreiding en accumulatie van myeloïde voorlopercellen, remming van de normale Haematopoiese, en uiteindelijk het beenmerg falen . De ziekte is zeer heterogene met betrekking tot de morfologie, immunophenotype, cytogenetica, moleculaire aberraties en gen expressie handtekeningen, alsmede behandeling reactie en behandeling resultaat1,2. Huidige management omvat inductie chemotherapie met het streven naar volledige verlossing (CR), gevolgd door na verlossing behandeling, die wordt grotendeels gestuurd door de resultaten van moleculaire cytogenetische en immunophenotypic bestudeert en bestaat uit een verschillende cursussen van aanvullende chemotherapie of (autologe of allogene) stamcel transplantatie3. Ondanks de hoge kwijtschelding tarieven na intensieve chemotherapie van maximaal 90%, 5-jaars overleving bij volwassenen slechts ongeveer 30% - 40%, voornamelijk als gevolg van de ontwikkeling van is relapses die zijn meestal resistent tegen chemotherapie en daardoor zeer moeilijk te behandelen. Resultaten bij kinderen is beter, hoewel ongeveer eenderde ook terugvallen. Daarom, vroegtijdige opsporing van dreigende instorting vult een onvervulde medische noodzaak en kan begeleiden na verlossing therapie4.
Residuele ziekte na therapie de som van alle diagnose en na diagnose resistentie mechanismen/factoren weerspiegelen kan; Vandaar de meting mogelijk prognostische en instrumentale voor de begeleiding van de behandeling. De mogelijkheid van deﬁning resterende ziekte (voorheen minimale residuele ziekte en nu bedoeld als meetbare residuele ziekte of MRD) ver beneden de morfologische criterium van 5% blast cellen verandert het landschap van risico-classiﬁcation. Op dit moment zijn de twee methoden die veelal gebruikt voor het opsporen van MRD stroom cytometry- en moleculaire gebaseerde, de laatste wordt beoordeeld door reverse-transcriptase (RT-qPCR) PCR5 of, hoewel in een vroeg stadium, door de volgende generatie sequencing (NGS). Veel studies bij volwassenen ook zoals in kinderen reeds aangetoond dat verschillende MRD benaderingen in AML zowel na inductie en consolidatie therapie6,7, en een nieuwe definitie van de ziekte last (sterke prognostische informatie verstrekken superieur aan morfologische CR) ontstaat nu8. Dit suggereert dat MRD beoordeeld door stroom en/of moleculaire technieken moeten worden, en in feite al steeds, standaard in elke klinische proef in AML.
Dit manuscript bespreekt de gedetailleerde stroom cytometry procedure voor het verkrijgen van een nauwkeurig en reproduceerbaar immunophenotypic karakterisering van MRD in beenmerg monsters, met inbegrip van de bemonstering voor het beenmerg en procedures voorafgaand aan stroom cytometry verwerking. De beschikbaarheid van goede kwaliteit beenmerg monsters op de diagnose en opvolging is cruciaal voor het succes van deze meting over klinische sites en klinische proeven. In feite, zijn deze vooraf analytische overwegingen ook van vitaal belang voor moleculaire (PCR en NGS) MRD benaderingen. Voor immunophenotypic-karakterisatie van MRD, worden aberrantly uitgedrukt markeringen gecombineerd met normale myeloïde en voorlopercellen markers, identificeren een leukemie-geassocieerde immunophenotype (LAIP)9. MRD meet de resultante van vele factoren die beïnvloeden van respons op therapie, zoals leukemie intrinsieke of verworven resistentie, farmacodynamica en kinetiek van therapie, immuun toezicht en compliance. MRD is daarom een zeer sterke na diagnose prognostische parameter klinische resultaten wanneer dichotomized op een niveau van de licht-donkerscheiding bepaald door analyse van de karakteristiek van de ontvanger-operationele (ROC) zijn gekoppeld. Voor onze volwassen AML cohort van de HOVON 42a studie, de licht-donkerscheiding niveau is ingesteld op 0,1% van LAIP positieve cellen/total witte bloedcellen. Met behulp van dit criterium voor het bepalen van de status van positieve versus negatieve MRD, kan een groep van patiënten worden geïdentificeerd die een beduidend slechter herval incidentie, en de algehele instorting-vrije overleving6 hebben. Daarnaast beschrijven we de meting van onrijpe, resistente leukemie cellen met functies van de cel van de stam-achtige (de cellen van de stam van de CD34 + CD38-leukemie, of LSC), die een sterke voorspeller van patiënten uitkomst10biedt. Samen LAIP en LSC benadert vorm de stroom cytometrische MRD aanpak. De LAIP benadering is geschikt voor ongeveer 90% van de patiënten, terwijl de LSC aanpak kan worden toegepast in ongeveer 80% van de patiënten. Samen meer dan 95% van de patiënten kan worden geëvalueerd voor één parameter of beide.
Tot slot, deze publicatie geeft een gedetailleerde operationele beschrijving om te beoordelen MRD door stroom cytometry. Dit omvat: 1) harmonisatie en/of standaardisatie van beenmerg bemonsteringsprocedures, 2) monster transport begeleiding 3) gedetailleerde beschrijving van de detectie leukemische cellen met FACS met behulp van verschillende antilichaam panelen met inbegrip van eencellige buis benaderingen te karakteriseren de LSC, 4) opzet van de FACS machines voor gestandaardiseerde metingen, 5) analytische programma's voor MRD metingen en 6) analytische programma's voor het Certificatieschema opsporen.
Wij streven ernaar om te laten zien van alle facetten van de procedure met inbegrip van de bereiding van de monsters, aangezien die zelden wordt besproken, hoewel het een belangrijke kwestie voor de kwaliteit van het uiteindelijke resultaat. Het beenmerg aspiratie en biopsie zijn klinische procedures gebruikt om te evalueren van de hematopoietische cellen in het beenmerg. Deze worden uitgevoerd samen met een complete blood count (CBC) en bloed-uitstrijkje. De optimale methode voor het beenmerg aspiratie is cruciaal voor de accurate diagnose en opvolging voor MRD meting. Daarnaast moet een succesvolle beenmergaspiraat genoeg cellen voor het uitvoeren van de LAIP en LSC flow analyse (ten minste 10 miljoen levensvatbare cellen) bevatten. Hier beschrijven we de methode voor het uitvoeren van een beenmerg aspiratie en voorzien in richtsnoeren, die in adequate cel bemonstering (en beperken de mogelijkheden voor hemodilution uitmonden moeten) die nodig zijn voor een nauwkeurige diagnose en aanvullend onderzoek. Deze vooraf analytische overwegingen zijn eveneens van vitaal belang voor moleculaire (PCR en NGS) MRD benaderingen. Alle exemplaren voor immunophenotyping moeten bij voorkeur binnen de 24 uur van collectie worden verwerkt. Hoewel niet aan te bevelen, kunnen beenmerg en perifeer bloedmonsters nog steeds worden verwerkt en geanalyseerd wanneer maximaal 72 uur bij kamertemperatuur bewaard. Bovendien moeten alle handelingen met het materiaal worden uitgevoerd onder steriele condities, zodat cryopreservatie van steriele cellen voor later onderzoek/kwaliteitsbeoordeling enz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >120995496,060996589 and 013729</td>
			<td >FACS Canto II&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >555360</td>
			<td>CD7 FITC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >DAKO</td>
			<td >F076701</td>
			<td>CD2 FITC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Sanquin</td>
			<td >M1613</td>
			<td>CD36 FITC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >332778</td>
			<td>CD15 FITC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>335039</td>
			<td>CD45RA FITC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >345810</td>
			<td >CD56 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >337899</td>
			<td >CD22 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >345785</td>
			<td >CD14 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Miltenyi Biotec</td>
			<td >130-080-801</td>
			<td >CD133 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562566</td>
			<td>Clec12a PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565568</td>
			<td>Tim-3 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >332774</td>
			<td >CD7 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >333142</td>
			<td >CD11b PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >337899</td>
			<td >CD22 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >345810</td>
			<td >CD56 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >347222</td>
			<td >CD34 PERCP-CY5.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558714</td>
			<td>CD123 PERCP-CY5.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Beckman Coulter</td>
			<td>B49221</td>
			<td >CD117 PE-CY7</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562854</td>
			<td>CD33 BV421</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >345791</td>
			<td >CD19 APC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >333143</td>
			<td >CD11b APC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >345800</td>
			<td >CD33 APC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>345807</td>
			<td>CD38 APC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >641411</td>
			<td >HLA-DR APC-H7</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560532</td>
			<td>CD44 APC-H7</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >562596</td>
			<td >CD13 BV421</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>348811</td>
			<td>CD34 PE-CY7</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Beckman Coulter</td>
			<td>A96416</td>
			<td >CD45 Krome Orange</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>655873</td>
			<td >CD45 HV500c</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >655051</td>
			<td>CST beads&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >555899</td>
			<td>Pharm lysing solution</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >644204</td>
			<td>Multicolor CompBeads</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >655051</td>
			<td>CST beads</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td ></td>
			<td>FACSDiva software</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Cytognos</td>
			<td ></td>
			<td >Infinicyt&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Spherotech</td>
			<td>Euroflow RCP-30-5a</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td ></td>
			<td >Tuerk solution</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Spherotech</td>
			<td>BCP-100-5</td>
			<td>Blank Calibration Particles Beads</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#160;&#160;</td>
			<td >&#160;&#160;</td>
			<td >&#160;&#160;</td>
			<td >HSA</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#160;&#160;</td>
			<td >&#160;&#160;</td>
			<td >&#160;&#160;</td>
			<td >Azide</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#160;&#160;</td>
			<td >&#160;&#160;</td>
			<td >&#160;&#160;</td>
			<td >ddH2O</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comprehensive protocol to sample and process bone marrow for measuring measurable residual disease and leukemic stem cells in acute myeloid leukemia

Antwoord criteria in acute myeloïde leukemie (AML) is onlangs hersteld, met de morfologische onderzoek gebruikt om te bepalen of de patiënten volledige verlossing (CR) hebben bereikt. Ongeveer zal de helft van de volwassen patiënten die meededen aan CR terugvallen binnen 12 maanden als gevolg van de uitgroei van residuele AML cellen in het beenmerg. De kwantificatie van deze resterende leukemie cellen, bekend als minimal of meetbare residuele ziekte (MRD), kunnen een robuuste biomarker voor de voorspelling van deze hervallen. Retrospectieve analyse van verschillende studies heeft bovendien aangetoond dat de aanwezigheid van MRD in het beenmerg van AML patiënten met slechte overleven correleert. Niet alleen is de totale leukemische bevolking, weerspiegeld door cellen herbergen een leukemie associated immuun-fenotype (LAIP), gekoppeld aan klinische resultaten, maar zo is de subpopulatie onvolwassen lage frequentie van leukemie stamcellen (LSC), die beide kunnen worden gecontroleerd door stroom cytometry MRD of MRD-achtige benaderingen. De beschikbaarheid van gevoelige tests waarmee detectie van residuele leukemie (stam) cellen op basis van specifieke ziekten of ziekte-geassocieerde functies (abnormale moleculaire merkers of afwijkende immunophenotypes) hebben drastisch verbeterde MRD beoordeling in AML. Echter, gezien de inherente heterogeniteit en de complexiteit van AML als een ziekte, methoden voor bemonstering van beenmerg en het uitvoeren van MRD en LSC analyse geharmoniseerd dienen te worden indien mogelijk. In dit manuscript beschrijven we een gedetailleerde methodologie voor voldoende beenmergaspiraat bemonstering, transport, verwerking voor optimale Multi-Color stroom cytometry beoordeling, en strategieën om te beoordelen MRD en LSC om hulp bij het therapeutische besluitvorming gating proeven voor AML patiënten.

In 90% van de patiënten van de AML kan ten minste één LAIP worden geïdentificeerd. Oog op het genereren van de nauwkeurige percentages van LAIP + cellen van de primitieve blast cellen in diagnose, de juiste instelling voor de poort van de ontploffing is cruciaal en moet verificatie zoals gevisualiseerde in Figuur 3. Een voorbeeld van elke patiënt herbergen van een bepaald type aberrancy op de CD34 + primitieve cellen is gevisualiseerd in Figuur 5. Voor meting van MRD op follow-up, de eerder gedefinieerde LAIP + cellen zijn omheinde en gedefinieerd als percentage van LAIP + cellen van de WBC. Vandaar is de instelling van deze poort cruciaal om de juiste MRD resultaten te bereiken. Figuur 6 toont een patiënt die in volledige verlossing blijft en een patiënt die relapses na MRD positieve resultaten (≥ 0,1%) na de tweede cyclus van inductie therapie.
Het huidige protocol is alleen geschikt om te definiëren van stamcellen in CD34 + cellen, sinds grondige karakterisering van dit compartiment is gebleken dat de CD38-bevolking de meest potente cel van de stam als breuk herbergt. Om te scheiden van de LSC van de HSC binnen deze fractie, worden extra markeringen gebruikt. Vaakst geselecteerde markeringen te onderscheiden van de LSC zijn CD45RA en het kanaal van de combi 6 specifieke markers van de LSC aangeduid met PE herbergen. Gebaseerd op verdere klinische evaluaties, een niveau van de licht-donkerscheiding van ≥ 0.004% werd gedefinieerd als LSC-positieve en werd geassocieerd met slechtere overleving bij diagnose terwijl een niveau van de licht-donkerscheiding van 0,0001% werd gebruikt op follw-up10.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig1.jpg"> Figuur 1 : Het beenmerg uitstrijkje. A) gezonde donor en B) AML patiënt (FAB 5 subtype). Giemsa-kleuring vertoond op 100 x vergroting. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig2.jpg"> Figuur 2 : Corrigeren van verpakkingsmateriaal voor biologische vloeistoffen. Meer informatie over de regels en voorschriften voor het vervoer van biologische vloeistoffen vindt u op de website15 van de Centers for Disease Control and Prevention. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig3.jpg"> Figuur 3 : Strategie voor het definiëren van blast cellen gating. A) Gating CD45dim, B) Gating CD34 + ontploffing.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig4.jpg"> Figuur 4 : Gating lymfocyten. A) blauwe cellen zijn WBC aangetoond in FSC/SSC perceel, B) groene cellen lymfocyten gekenmerkt door CD45hoge/SSClage, C) voorbeelden van negativiteit voor CD34, D) negativiteit voor CD117 en E) negativiteit voor CD13, F) de verschillende soorten cellen worden weergegeven in een overzicht bevolking boom. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig5.jpg"> Figuur 5 : LAIPs bij AML diagnose. A) LAIP gebaseerd op grensoverschrijdende lineage aberrancy (CD7 op CD33 waarin cellen), B) LAIP gebaseerd op asynchrone differentiatie (CD11b op CD13 waarin cellen), C) LAIP gebaseerd op overexpressie in vergelijking met normale cellen (CD34zeer hoog op CD13 uiten van cellen), D). LAIP gebaseerd op underexpression in vergelijking met normale cellen (HLA-DRlaag op CD33 uiting van cellen). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig6.jpg"> Figuur 6 : LAIP gevolgd tijdens therapie. A) LAIP definitie tot diagnose (CD34 +/ CD13 +/ CD33-) en verlies van LAIP tijdens de follow-up bij een patiënt die bleef in continue volledige verlossing, B) LAIP definitie tot diagnose (CD117 +/ CD7 +/ CD33 +) en persistentie van LAIP tijdens de follow-up bij een patiënt die recidiverende. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig7.jpg"> Figuur 7 : Stamcel gating. A) Gating van de verschillende CD34 +/ CD38 populaties gebaseerd op parels (CD38lage is onder de bovenste grens van de parels, terwijl CD38zeer laag worden gedefinieerd als het ware negatieve cellen vertegenwoordigt de LSC en bevinden zich onder de mediaan van de kralen), B) twee voorbeelden van patiënten met onderscheid tussen HSC en LSC bij follow-up op basis van CD45RA,neg en CD45RApos expressie. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
Aanvullende bestand 1. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/Sampling_Form_MRD_1.pdf" target="_blank">Klik hier voor downoad dit bestand.</a>
Aanvullende bestand 2. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/Sampling_Form_MRD_2.pdf" target="_blank">Klik hier voor downoad dit bestand.</a>
Aanvullende bestand 3. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/Supplementary_information_revised_Cloos_et_al_final2018.docx" target="_blank">Klik hier voor downoad dit bestand.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia at JoVE.c

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Detectie van minimale of meetbare residuele ziekte (MRD) is een belangrijke voorspellende biomarker voor risico-evaluatie te verfijnen en het voorspellen van herval in acute myeloïde leukemie (AML). Deze uitgebreide richtlijnen en aanbevelingen met de best practices voor consistente en accurate identificatie en opsporing van MRD, kan steun bij het maken van effectieve AML behandelingsbeslissingen.

Uitgebreide Protocol bij monster en proces beenmerg voor het meten van meetbare residuele ziekte en leukemische cellen van de stam in Acute myeloïde leukemie

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

The overall goal of this protocol is to perform an accurate testing of bone marrow samples from acute myeloid leukemia patients for measurable residual disease including the quantification of leukemia stem cells. This method can provide an accurate assessment of measurable residual disease in bone marrow samples of acute myeloid leukemia patients. The main advantage of this approach is that a close following of the protocol yields highly-reproducible, high-quality results.The implications of this technique extends toward clinical decision-making as it can be used as a read-out of patients'response to treatment. Demonstrating the procedures will be Jeroen Janssen, hematologist, Gerrit Sijm, technician of the diagnostic hematology laboratory and Jennifer Scheick and Sander Snel, technicians of the MRD team. With the patient in the lateral decubitus position, mark the superior posterior iliac spine with a pen and disinfect the skin of the intended biopsy area with 0.5 to 1%chlorhexidine in ethanol in an outward circular motion.After administering a local anesthetic, pick up a 15-gauge 2.8-inch needle with the proximal end in the palm and the index finger against the side of the metal shaft of the needle near the tip for control. Using gentle but firm pressure, introduce the needle with a quick alternating pronating supinating movement through the anesthetized skin toward the iliac spine. When the needle comes into contact with the posterior iliac spine, remove the stilette and attach an empty 10-milliliter syringe to the needle.Gently withdraw the plunger to create negative pressure within the syringe until up to 10 milliliters of bone marrow spicules have been harvested. Do not take more than 10 mils of bone marrow per aspirate to avoid hemodilution. Remove the syringe and place the stilette back onto the needle.Then, eject about two milliliters of the marrow into a watch glass and ensure that enough sample is drawn to be injected into a heparin-coated eight-milliliter tube and immediately invert the tube. To prevent clotting, it is important to invest the anticoagulant-containing tube as soon as the bone marrow is added. For optimal morphological assessment, use a plastic spatula to transfer spicules from the aspirate in the watch glass onto a glass slide, and carefully glide another glass slide on top of the marrow.After drying, stain the spicules with May-Grunwald Giemsa for analysis by light microscopy. Place the bone marrow tube in a plastic holder and place the holder into a plastic container with an ambient gel pack and a completed request form. Before analyzing the bone marrow by flow cytometry, start up the flow cytometer and open the flow cytometry analysis software to create a new experiment with a forward scatter versus side scatter dot plot.For assessment of the size and granularity of the cells, load unlabeled lysed peripheral blood cells from a healthy donor and select the Acquire Cells function. Gate the lymphocytes and adjust the forward and side scatter voltages to reach the appropriate mean target values for the gated cell population. Then, acquire data for at least 10, 000 events.To set up the target florescence channel photo multiplier tube voltages, first use eight-peak rainbow bead calibration particles according to the manufacturer's instructions to acquire 10, 000 events at a low flow rate. Gate the singlet beads in the forward versus side scatter dot plot followed by gating the 7th peak in the FITC-PE dot plot. Gate the resulting bead populations for each fluorophore.Continue the acquisition of the eight-peak rainbow bead suspension and adjust and fine-tune PMT voltages in all fluorescence channels to reach target MFI values according to the manufacturer's instructions. Use Record to collect data of about 2, 000 events and check the MFI for the 7th peak beads. Next, add a sufficient volume of each experimental flourochrome conjugated antibody to stain the beads in the corresponding florescence tubes minus one control and vortex the tubes thoroughly.Create a new blank experiment with the same compensation parameters taking care that the forward scatter threshold is set to 5, 000 and the compensation values of all the flourochromes are zero. To create the compensation controls, select the Create Compensation Control function and load the unstained control tube. Adjust the P1 gate around the singlet bead population and confirm that the P1 gate contains only singlet beads.Right-click the P1 gate and select Apply to All Compensation Controls. Then, record data for all of the single labeled florescence tubes confirming that the P2 gate encompasses the positive population on each florescence histogram. To stain the cells for flow cytometric analysis, transport the bone marrow to the laboratory, check the request form to verify patient study number and date of birth and determine what needs to be stained.For MRD, we use a staining panel consisting of four tubes. Here we demonstrate the staining of the LSC panel which consists of one tube. After cell count, transfer the appropriate volume of bone marrow into a new 15-milliliter tube.Add lysis buffer at 10 times the experimental cell volume to lyse the red blood cells. Invert the tube to mix and incubate the cells for 10 minutes at room temperature. At the end of the lysis period, pellet the cells by centrifugation.Resuspend the cells in 15 milliliters of wash buffer at room temperature and harvest the cell pellet again by centrifugation. In the meantime, pipette the appropriate amount of antibody cocktail solution in five-milliliter FACS tubes. Shown here is the panel for the stem cell tube.Resuspend the pellet in wash buffer and add the cell's suspension to the FACS tube containing the monoclonal antibody cocktail solution for a 15-minute incubation in the dark. Then, wash the cells in wash buffer and pellet the cells by centrifugation. After centrifugation, resuspend the pellet in 400 microliters of fresh wash buffer.To analyze the leukemic stem cells, add four microliters of blank beads to the cell suspension that is stained with the stem cell antibody cocktail. Then, read the samples using the previously set parameters acquiring at least four times 10 to the 6th events from the experimental patient samples. To identify the leukemia-associated immunophenotype observed in approximately 90%of acute myeloid leukemia patients, it is crucial that the blast gates are set appropriately as illustrated.Here, examples of data from individual patients harboring different types of aberrancy on the CD34-positive primitive cells are shown. In these graphs, a patient who remains in complete remission and a patient who relapsed after having measurable residual disease positive results after the second cycle of induction therapy can be observed underscoring the need for accurate gate setting prior to sample analysis. The identification and quantification of LSC requires additional analysis of aberrancies specifically on CD34-positive CD38-negative blast cells as shown in these graphs.While performing this protocol, it's very important to have specialized and backup personnel for the bone marrow sampling, the transport, the experimental work and analysis steps of this procedure. This procedure can also be used to perform cytogenetic and molecular analysis to answer additional questions about the correlation between specific cell populations and molecular aberrancies of interest, or to refine the risk group of a patient for predicting clinical outcome. After its development, this technique paved the way for researchers in the field of hematology to explore residual disease in AML patients after treatment.After watching this video, you should have a good understanding how we accurately identify and quantify residual disease by using flow cytometry including the collection and transportation of bone marrow samples of AML patients.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model

Een gedetailleerd protocol voor het karakteriseren van het Muizen C1498 Cell Line en de bijbehorende Leukemie muismodel

The intravenous injection of C1498 cells into syngeneic or congenic mice has been performed since 1941. These injections result in the development of ...

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Een protocol voor snelle post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsieke Pontine glioom (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

Voorbereiding van primaire Acute lymfatische leukemie cellen in verschillende celcyclus fasen door centrifugaal Elutriation

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Verplaatsen naar boven: Een eenvoudig en flexibel In Vitro driedimensionale invasie Assay Protocol

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Stroom Cytometry om te schatten leukemie cellen van de stam in primaire Acute myeloïde leukemie en patiënt-afgeleid-xenografts, bij diagnose en Follow Up

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

Het meten van bot remodelleren en recreëren van de Tumor-Bone Microenvironment Met behulp van Calvaria Co-cultuur en Histomorphometrie

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Flow cytometrische analyse van mitochondriale reactieve zuurstof soorten in Muriene hematopoietische stam en voorlopercellen en MLL-AF9 gedreven leukemie

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone

Modellering van primaire bottumoren en botmetastase met implantatie van solide tumortransplantaten in bot

Primary bone tumors or bone metastasis from solid tumors result in painful osteolytic, osteoblastic, or mixed osteolytic/osteoblastic lesions. These ...

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

Twee flow cytometrische benaderingen van NKG2D Ligand-oppervlaktedetectie om stamcellen te onderscheiden van bulksubpopulaties bij acute myeloïde leukemie

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice

Intra-peritoneale transplantatie voor het genereren van acute myeloïde leukemie bij muizen

There is an unmet need for novel therapies to treat acute myeloid leukemia (AML) and the associated relapse that involves persistent leukemia stem cells ...