Name: comprehensive protocol to sample and process bone marrow for measuring measurable residual disease and leukemic stem cells in acute myeloid leukemia
Uploaded: 2018-03-05T12:30:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia at JoVE.c

Questa ricerca è stata sostenuta da Dutch Cancer Society (ALPE 2013-6371) ed Egbers foundation per VONK. Ringraziamo il gruppo di lavoro di AML-MRD olandese per la collaborazione e discussioni fruttuose per il miglioramento continuo e la standardizzazione di AML-MRD.

<ol>
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I cocktail di anticorpi utilizzati per la validazione del tubo delle cellule staminali in diversi istituti indipendenti sono state gentilmente concesse da BD. Gli autori non hanno nulla a rivelare in relazione a questo manoscritto.

Dati ampio sono disponibili che mostrano la prova per la positività MRD essendo associate con la sopravvivenza difficile, e quindi valutazione MRD può migliorare il risultato paziente fornendo informazioni prognostiche supplementari su cui si possono prendere decisioni cliniche. Quindi, un metodo coerenza e armonizzato per valutazione immuno-fenotipica della MRD è indispensabile migliorare in ultima analisi, la terapia del paziente. Questo è importante anche quando si confrontano gli studi clinici attraverso diversi siti clinici, e può in definitiva aiuto in clinica decisione fare e servire come un endpoint clinico surrogato per la sopravvivenza globale. La nozione che solidi orientamenti sono garantiti per le misure precise e coerenti di MRD ha portato a un'azione concertata della rete europea di leucemia (ELN) indicazioni di progettazione all'avanguardia. Questo documento completo sarà pubblicato tardo-2017 e sarà fondamentale per molti gruppi di studio e laboratori muovendo in avanti.
Fasi critiche all'interno del protocollo
Un aspetto importante e spesso trascurato dell'analisi MRD è l'impatto della qualità del campione sulla determinazione accurata di MRD. Questo è più evidente quando il materiale deve essere trasportata ad altri istituti in sperimentazioni cliniche, dati le considerazioni operative aggiuntive che devono essere prese in considerazione in questa impostazione. Per ridurre il rischio di confondere il paziente informazioni e consegna tempestiva dell'amministrazione adeguata campioni è cruciale. Ancora una volta, in questa fase del trasporto le forme corrette e/o importazione in sistemi elettronici ospedalieri con chiare assegnazioni dell'analisi richiesta è necessaria. Notando la stage presso terapia di campionamento MRD è anche cruciale poiché esso può essere rilevante per risoluzione clinica (ad esempio dopo il secondo corso della terapia) e pertanto dovrebbe essere chiaramente definito. L'uso di dati fittizi (come per esempio gennaio 1 all'anno di nascita) aumenta il rischio di confondere i pazienti o le analisi. Se richiesto dalla legge, un modo alternativo di anonimo di identificazione deve essere utilizzato.
Tutti gli esemplari per immunophenotyping dovrebbero essere trattati preferenzialmente entro 24 h dalla raccolta. Anche se non raccomandabile, midollo osseo e campioni di sangue periferici ancora possono elaborati e analizzati fino a 72 h, conservato a temperatura ambiente. Inoltre, tutte le manipolazioni con il materiale migliore possono essere eseguite in condizioni di sterilità, così ulteriore crioconservazione delle cellule in biobanche (locale) rimane rilevante: molti studi clinici hanno ulteriori analisi per analizzare ulteriormente le cellule di leucemia con rispetto alle caratteristiche molecolari, immuno-fenotipica e funzionale deve essere eseguita in una fase successiva. Tuttavia dettagli di biobanking non rientrano nell'ambito di questo manoscritto.
Utilizzando MRD come strumento diagnostico implica che ha bisogno di un laboratorio accreditato, non solo per citometria a flusso, ma anche per quanto riguarda il controllo di qualità di valutazione MRD. Ciò può richiedere la distribuzione di campioni ai laboratori di riferimento specifici o (ri) analisi dei file di flusso con le misurazioni di MRD da squadre di riferimento.
Questo articolo viene descritto le azioni più importanti da midollo osseo aspirato insieme alla determinazione di MRD in campioni clinici - che richiedono un intero team di esperti con specifici compiti, responsabilità e con una comunicazione frequente per una efficace caratterizzazione e analisi. Poiché ogni attività è determinante per la procedura, è consigliabile avere suono logistica tra cui protocolli ad ogni laboratorio e sufficiente personale di backup che sono stato addestrato in modo specifico per l'attività. Inoltre, poiché ci sono alcuni passaggi relativamente soggettive in parte delle procedure (soprattutto la identificazione dei marcatori aberranti LAIP e LSC), è essenziale avere discussioni circa il risultato finale da parte del team, e hanno la relazione finale autorizzata da un team di autorità di vigilanza. Gli sforzi attuali stanno perseguendo lo sviluppo del software di computer che vi aiuterà a standardizzare l'analisi MRD (LAIP e LSC).
Modificazione e risoluzione dei problemi
Ogni laboratorio può avere una propria serie di anticorpi che può essere utilizzato per definire le sottopopolazioni differenti pur avendo un backbone standardizzato dei marcatori è essenziale per ottenere risultati comparabili, come indicato nelle linee guida ELN d'avanguardia per documento misure MRD di cui sopra. Indipendentemente degli indicatori scelti ci sono alcuni problemi che possono rendere difficile l'analisi dei risultati e devono essere prese in considerazione.
Limiti della tecnica
L'identificazione di espressione aberrante marcatore LAIP e LSC è in primo luogo valutato alla diagnosi e monitorato nel tempo (durante e dopo la terapia) per accurata caratterizzazione del fenotipo MRD. Mentre oltre il 95% dei pazienti può essere valutato tramite LAIP o LSC (o entrambi), ancora alcuni pazienti hanno nessun LAIPs definito o no CD34 + CD38-LSCs presentano con CD34 negativi blasti o avere un campione di diagnosi mancante. In questi casi, vale ancora la pena di cercare di misurare MRD con un pannello di anticorpi più ampi in quanto il numero di celle disponibili permette e quindi seleziona il più affidabile (dando la distinzione più forte delle cellule leucemiche) LAIP. Considerando che una percentuale di pazienti che recidivano in definitiva non assomigliano completamente il immunophenotype di diagnosi, a causa dell'eterogeneità della malattia AML, un vasto pannello degli anticorpi alle MRD di misura è consigliabile comunque. Questi spostamenti di immunophenotypic includono le cellule di scoppio e LSCs e sono stati indicati per verificarsi durante terapia16 e la malattia misurabile può basarsi su queste popolazioni prossime cosiddette. In questo momento tuttavia, esso è non stato determinato se tutte le sottopopolazioni di immunophenotypic porterà alla ricaduta di malattia, ed è pertanto non comune pratica di segnalare MRD su misura-terapia basato su queste cellule negli studi clinici. È importante notare che il rischio di perdere LSC a causa di spostamenti di popolazione è ridotta tramite l'approccio di un tubo in cui i più importanti marcatori definizione aberrancy sono in un unico flusso cytometry (PE) canale14.
Significato per quanto riguarda i metodi esistenti
Il metodo descritto in questo protocollo si basa sulla definizione di uno o più LAIPs, le celle che sono seguite durante la terapia. Uno svantaggio di questo metodo è che è stato recentemente dimostrato che LAIP possono cambiare durante la terapia. In questo modo alcune popolazioni prossime con differenti marcatori aberranti possono essere mancate. Per ovviare a questo, sarebbe meglio misurare tutti i marcatori aberranti anziché solo quelli che si trovano al momento della diagnosi. Quindi questo sarebbe simile all'approccio "diverso dal normale" che viene utilizzato da diversi laboratori17.
Applicazioni future
Recentemente, MRD ha ricevuto attenzione supplementare per sperimentazione clinica romanzo di progettazione. In epoca di opzioni di trattamento specializzato e terapia farmacologica mirata, l'uso di MRD come misura di esito ridurrà il tempo necessario per stabilire l'efficacia clinica di nuovi trattamenti, in ultima analisi, permettendo più veloce introduzione di urgente bisogno terapeutico opzioni in clinica. L'importanza della logistica appropriata ed esecuzione pratica di una valutazione di MRD armonizzata sono cruciali per il futuro successo di trattamento di AML come la FDA sta attualmente esaminando la possibilità di usando MRD come endpoint surrogato invece di sopravvivenza globale misura18.

Leucemia mieloide acuta (AML) è che un tumore maligno del midollo osseo caratterizzata da difetti nel programma di maturazione, con anomala proliferazione e accumulo di cellule progenitrici mieloidi, inibizione di ematopoiesi normale e in definitiva insufficienza del midollo osseo . La malattia è altamente eterogenea per quanto riguarda la morfologia, immunofenotipo, citogenetica, molecolare aberrazioni e firme di espressione genica, nonché alla risposta al trattamento e trattamento risultato1,2. Gestione attuale comprende la chemioterapia di induzione con l'obiettivo di raggiungere la remissione completa (CR), seguita da post-remissione trattamento, che è in gran parte guidato dai risultati di molecolare, citogenetica e immunophenotypic studi e consiste di uno diversi corsi di chemioterapia complementare o di trapianto di cellule staminali (autologo o allogenico)3. Nonostante i tassi di remissione alta dopo la chemioterapia intensa fino al 90%, sopravvivenza a 5 anni negli adulti è solo circa 30% - 40%, principalmente dovuto lo sviluppo di recidive che sono comunemente resistenti alla chemioterapia e quindi molto difficili da trattare. Risultato in bambini è meglio, anche se circa un terzo anche la ricaduta. Pertanto, l'individuazione tempestiva della ricaduta imminente riempirà un'esigenza medica insoddisfatta e può guidare la terapia post-remissione4.
Malattia residua dopo terapia può riflettere la somma di tutte le diagnosi e meccanismi/fattori di resistenza post-diagnosi; quindi la sua misurazione può essere prognostici e strumentale per guidare il trattamento. La possibilità della malattia residua di deﬁnire (precedentemente chiamata malattia minima residua e ora indicata come misurabile malattia residua o MRD) lontano sotto il criterio morfologico delle cellule di scoppio 5% sta cambiando il panorama del rischio classiﬁcazione. Attualmente i due metodi utilizzati principalmente per rilevare MRD sono flusso cytometry-molecolari basati e, quest'ultima viene valutata da d'inversione di transcriptase PCR (RT-qPCR)5 o, anche se in una fase precoce, di prossima generazione sequenziamento (NGS). Molti studi negli adulti e nei bambini già dimostrato che vari approcci MRD forniscano informazioni prognostiche forte in AML sia dopo induzione e consolidamento terapia6,7e una nuova definizione di malattia onere ( superiore a CR morfologica) emerge ora8. Ciò suggerisce MRD valutata dal flusso e/o tecniche molecolari dovrebbero diventare e in realtà stanno già diventando, standard in ogni studio clinico in AML.
Questo manoscritto viene descritto la procedura di cytometry di flusso dettagliato per ottenere una caratterizzazione di immunophenotypic accurati e riproducibili di MRD nei campioni di midollo osseo, tra cui il campionamento del midollo osseo e l'elaborazione di procedure che precedono la citometria a flusso. La disponibilità di campioni di midollo osseo di buona qualità alla diagnosi ed al follow-up è fondamentale per il successo di questa misura in siti clinici e studi clinici. In realtà, queste considerazioni pre-analitiche sono anche degli approcci MRD di vitale importanza per molecolare (PCR e NGS). Per la caratterizzazione di immunophenotypic di MRD, aberrante espressi marcatori sono combinati con normale mieloide e marcatori di cellule progenitrici, per identificare un immunophenotype leucemia-collegato (LAIP)9. MRD misura la risultante di molti fattori che influenzano la risposta alla terapia, quali leucemia intrinseca o acquisita farmacoresistenza, farmacodinamica e cinetica di terapia, sorveglianza immune e di conformità. Di conseguenza, MRD è un parametro di prognostico post-diagnosi molto forte connesso con risultato clinico quando Dicotomizzate su un livello di cut-off determinato mediante analisi di caratteristica operativa ricevente (ROC). Per nostra coorte AML adulto di HOVON 42a studio, il livello di cut-off è fissato a 0,1% di cellule bianche del sangue LAIP positivo cellule/totale. Utilizzando questo criterio per determinare lo status negativo vs positivo MRD, un gruppo di pazienti possa essere identificato che hanno un'incidenza di recidive significativamente peggiore, la sopravvivenza ricaduta-libera e generale6. Inoltre, descriviamo la misura delle cellule di leucemia immaturi, resistente alla droga con le caratteristiche delle cellule staminali (cellule staminali CD34 + CD38-leucemia o LSC), che offre un forte predittore di outcome del paziente10. Insieme LAIP e LSC si avvicina forma l'approccio MRD cytometric di flusso. L'approccio LAIP è adatto per circa il 90% dei pazienti, mentre l'approccio LSC può essere applicato in circa l'80% dei pazienti. Insieme sopra 95% dei pazienti possono essere valutati per un parametro o entrambi.
Infine, questa pubblicazione fornisce una descrizione dettagliata di operativa per valutare MRD tramite flusso cytometry. Questo include: 1) armonizzazione e/o standardizzazione delle procedure di prelievo di midollo osseo, guida trasporto 2) esempio 3) Descrizione dettagliata del rilevamento delle cellule leucemiche con FACS usando diversi pannelli di anticorpo, inclusi gli approcci di tubo singola cella a caratterizzare la LSC, 4) set-up della FACS macchine per misure standardizzate, 5) programmi analitici per misurazioni MRD e 6) programmi di analisi per il rilevamento di LSC.
Miriamo a mostrare tutte le sfaccettature della procedura tra cui la preparazione del campione, dal momento che è raramente discusso mentre è una questione importante per la qualità del risultato finale. Biopsia e aspirazione del midollo osseo sono procedure cliniche utilizzate per valutare le cellule ematopoietiche all'interno del midollo osseo. Questi vengono eseguiti insieme ad un esame emocromocitometrico completo (CBC) e sbavatura di anima. Il metodo ottimale per l'aspirazione del midollo osseo è fondamentale per la diagnosi esatta e follow-up per la misura di MRD. Inoltre, un successo il midollo osseo aspirato dovrebbe contenere abbastanza cellule per eseguire l'analisi del flusso LAIP e LSC (cellule vitali almeno 10 milioni). Qui, descriviamo il metodo per eseguire un'aspirazione del midollo osseo e fornire linee guida, che dovrebbero provocare adeguata cella campionamento (e limite il potenziale per emodiluizione) necessari per la diagnostica accurata e ulteriori ricerche. Queste considerazioni pre-analitiche sono anche degli approcci MRD di vitale importanza per molecolare (PCR e NGS). Tutti gli esemplari per immunophenotyping dovrebbero essere trattati preferenzialmente entro 24 h dalla raccolta. Anche se non raccomandabile, midollo osseo e campioni di sangue periferici ancora possono elaborati e analizzati fino a 72 h, conservato a temperatura ambiente. Inoltre, tutte le manipolazioni con il materiale devono essere eseguite in condizioni di sterilità, al fine di consentire la crioconservazione di cellule sterili per la successiva valutazione di ricerca/qualità ecc.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >120995496,060996589 and 013729</td>
			<td >FACS Canto II&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >555360</td>
			<td>CD7 FITC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >DAKO</td>
			<td >F076701</td>
			<td>CD2 FITC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Sanquin</td>
			<td >M1613</td>
			<td>CD36 FITC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >332778</td>
			<td>CD15 FITC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>335039</td>
			<td>CD45RA FITC</td>
		</tr>
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			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >345810</td>
			<td >CD56 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >337899</td>
			<td >CD22 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >345785</td>
			<td >CD14 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Miltenyi Biotec</td>
			<td >130-080-801</td>
			<td >CD133 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562566</td>
			<td>Clec12a PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565568</td>
			<td>Tim-3 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >332774</td>
			<td >CD7 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >333142</td>
			<td >CD11b PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >337899</td>
			<td >CD22 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >345810</td>
			<td >CD56 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >347222</td>
			<td >CD34 PERCP-CY5.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558714</td>
			<td>CD123 PERCP-CY5.5</td>
		</tr>
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			<td >Beckman Coulter</td>
			<td>B49221</td>
			<td >CD117 PE-CY7</td>
		</tr>
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			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562854</td>
			<td>CD33 BV421</td>
		</tr>
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			<td>BD Biosciences</td>
			<td >345791</td>
			<td >CD19 APC</td>
		</tr>
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			<td>BD Biosciences</td>
			<td >333143</td>
			<td >CD11b APC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >345800</td>
			<td >CD33 APC</td>
		</tr>
		<tr >
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			<td>BD Biosciences</td>
			<td>345807</td>
			<td>CD38 APC</td>
		</tr>
		<tr >
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			<td>BD Biosciences</td>
			<td >641411</td>
			<td >HLA-DR APC-H7</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560532</td>
			<td>CD44 APC-H7</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >562596</td>
			<td >CD13 BV421</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>348811</td>
			<td>CD34 PE-CY7</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Beckman Coulter</td>
			<td>A96416</td>
			<td >CD45 Krome Orange</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>655873</td>
			<td >CD45 HV500c</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >655051</td>
			<td>CST beads&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >555899</td>
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		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >644204</td>
			<td>Multicolor CompBeads</td>
		</tr>
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			<td >BD Biosciences</td>
			<td >655051</td>
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		</tr>
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			<td ></td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td ></td>
			<td>FACSDiva software</td>
		</tr>
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			<td >Cytognos</td>
			<td ></td>
			<td >Infinicyt&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Spherotech</td>
			<td>Euroflow RCP-30-5a</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td ></td>
			<td >Tuerk solution</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Spherotech</td>
			<td>BCP-100-5</td>
			<td>Blank Calibration Particles Beads</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#160;&#160;</td>
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			<td >&#160;&#160;</td>
			<td >HSA</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#160;&#160;</td>
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			<td >Azide</td>
		</tr>
		<tr >
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			<td >&#160;&#160;</td>
			<td >&#160;&#160;</td>
			<td >ddH2O</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comprehensive protocol to sample and process bone marrow for measuring measurable residual disease and leukemic stem cells in acute myeloid leukemia

Criteri di risposta nella leucemia mieloide acuta (AML) recentemente è stato ristabilito, con esame morfologico utilizzato per determinare se i pazienti hanno realizzato la remissione completa (CR). Circa la metà dei pazienti adulti che sono entrati CR sarà ricaduta entro 12 mesi dovuto la conseguenza di cellule residue di AML nel midollo osseo. La quantificazione di questi restanti cellule di leucemia, note come malattia residua minima o misurabile (MRD), può essere un biomarcatore affidabile per la previsione di queste ricadute. Inoltre, l'analisi retrospettiva di numerosi studi ha dimostrato che la presenza di MRD nel midollo osseo dei pazienti LMA correla con la sopravvivenza difficile. Non solo è la totale popolazione leucemica, riflessa dalle cellule che harboring una leucemia associato immunitario-fenotipo (LAIP), connesso con risultato clinico, ma così è la sottopopolazione immaturo bassa frequenza delle cellule staminali leucemia (LSC), entrambi i quali possono essere monitorati tramite flusso cytometry MRD o MRD-come approcci. La disponibilità di test sensibili che permettono l'individuazione delle cellule di leucemia residua (staminali) in base alle caratteristiche specifiche di malattia o malattia-collegati (marcatori molecolari anormali o aberrante immunophenotypes) hanno drasticamente migliorato MRD valutazione in AML. Tuttavia, data l'intrinseca eterogeneità e complessità di AML come una malattia, metodi per il campionamento del midollo osseo e l'analisi MRD e LSC devono essere armonizzate quando possibile. In questo manoscritto che descriviamo una metodologia dettagliata per adeguata midollo osseo aspirato di campionamento, trasporto, esempi di elaborazione per la valutazione di citometria a flusso multi-colore ottimale e gating strategie per valutare MRD e LSC per aiutare nel processo decisionale terapeutico per i pazienti AML.

Nel 90% dei pazienti LMA può essere identificato almeno un LAIP. Al fine di generare le percentuali precise di cellule LAIP + il primitive delle cellule di scoppio al momento della diagnosi, l'impostazione appropriata del cancello blast è cruciale ed esigenze di verifica come visualizzato nella Figura 3. Un esempio di ogni paziente che harboring un tipo specifico di aberranza sulle cellule CD34 + primitive viene visualizzato in Figura 5. Per la misurazione di MRD di follow-up, la precedenza definito LAIP + cellule sono gated e definite come percentuale di cellule LAIP + del WBC. Quindi l'impostazione di questo cancello è fondamentale per ottenere i giusti risultati MRD. Figura 6 Mostra un paziente che rimane nella remissione completa e un paziente che ricadute dopo avere risultati positivi MRD (≥ 0,1%) dopo il secondo ciclo di terapia di induzione.
Il protocollo attuale è solo adatto per definire le cellule staminali in cellule CD34 +, poiché approfondita caratterizzazione di questo comparto ha mostrato che il CD38-popolazione porti il più potente della cellula formativa come frazione. Al fine di separare la LSC da HSC all'interno di questa frazione, ulteriori marcatori vengono utilizzati. Marcatori più spesso selezionati per distinguere LSC sono CD45RA e il canale di combi che harboring 6 marcatori specifici di LSC etichettati con PE. Basato su ulteriori valutazioni cliniche, un livello di cut-off di ≥ 0,004% è stato definito come LSC-positivo ed è stato associato con una sopravvivenza peggiore alla diagnosi mentre un livello di cut-off di 0,0001% è stato utilizzato follw-up10.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig1.jpg"> Figura 1 : Sbavatura del midollo osseo. A) sano donatore e paziente B) AML (sottotipo FAB 5). Colorazione di Giemsa mostrato ad ingrandimento 100x. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig2.jpg"> Figura 2 : Correggere il materiale di imballaggio per liquidi biologici. Maggiori dettagli sulle regole di trasporto di fluidi biologici si trovano presso il sito Web15 dei centri per controllo e la prevenzione. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig3.jpg"> Figura 3 : Strategia per la definizione di blastomeri di gating. A) Gating CD45dim, B) Gating CD34 + esplosioni.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig4.jpg"> Figura 4 : Gating linfociti. A) cellule blu sono WBC indicato nel plot FSC/SSC, cellule B) verde sono linfociti caratterizzati da CD45alta/SSCbasso, C) esempi di negatività per CD34, D) negatività per CD117 ed E) negatività per CD13, F) i diversi tipi cellulari sono riportati un albero di popolazione di panoramica. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig5.jpg"> Figura 5 : LAIPs al momento della diagnosi AML. A) LAIP basata su croce lignaggio aberrancy (CD7 sulle cellule esprimenti CD33), B) LAIP basato sulla differenziazione asincrona (CD11b sulle cellule esprimenti CD13), C) LAIP basato su sovraespressione rispetto alle cellule normali (CD34molto alta su CD13 che esprimono le cellule), D). LAIP basato su sottoespressione rispetto alle cellule normali (HLA-DRbasso su CD33 che esprimono le cellule). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig6.jpg"> Figura 6 : LAIP seguita durante la terapia. Definizione di A) LAIP alla diagnosi (CD34 + CD13 + / CD33-) e perdita di LAIP durante il follow-up in un paziente che è rimasto in remissione completa continua, definizione di B) LAIP alla diagnosi (CD117 + CD7 + / CD33 +) e persistenza di LAIP durante il follow-up in un paziente che è ricaduto. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig7.jpg"> Figura 7 : Cellule staminali gating. A) Gating dei diversi CD34 + CD38 popolazioni basato su beads (CD38basso è sotto il bordo superiore delle perline, mentre CD38 sono definiti come le vere cellule negative che rappresenta il LSCmolto bassa e si trovano sotto la mediana delle perle), B) due esempi di pazienti con distinzione tra HSC e LSC al follow-up basato su CD45RAneg e CD45RApos espressione. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
File supplementare 1. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/Sampling_Form_MRD_1.pdf" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 2. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/Sampling_Form_MRD_2.pdf" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 3. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/Supplementary_information_revised_Cloos_et_al_final2018.docx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>

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Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Rilevazione della malattia residua minima o misurabile (MRD) è un biomarcatore prognostico importante per raffinazione di valutazione del rischio e la previsione di ricaduta in leucemia mieloide acuta (AML). Queste linee guida complete e consigli con le migliori pratiche di coerente e accurata individuazione e rilevazione del MRD, può essere di aiuto nel prendere le decisioni efficace trattamento di AML.

Protocollo completo del campione e del midollo osseo di processo per misurare la malattia residua misurabile e cellule staminali leucemiche nella leucemia mieloide acuta

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

The overall goal of this protocol is to perform an accurate testing of bone marrow samples from acute myeloid leukemia patients for measurable residual disease including the quantification of leukemia stem cells. This method can provide an accurate assessment of measurable residual disease in bone marrow samples of acute myeloid leukemia patients. The main advantage of this approach is that a close following of the protocol yields highly-reproducible, high-quality results.The implications of this technique extends toward clinical decision-making as it can be used as a read-out of patients'response to treatment. Demonstrating the procedures will be Jeroen Janssen, hematologist, Gerrit Sijm, technician of the diagnostic hematology laboratory and Jennifer Scheick and Sander Snel, technicians of the MRD team. With the patient in the lateral decubitus position, mark the superior posterior iliac spine with a pen and disinfect the skin of the intended biopsy area with 0.5 to 1%chlorhexidine in ethanol in an outward circular motion.After administering a local anesthetic, pick up a 15-gauge 2.8-inch needle with the proximal end in the palm and the index finger against the side of the metal shaft of the needle near the tip for control. Using gentle but firm pressure, introduce the needle with a quick alternating pronating supinating movement through the anesthetized skin toward the iliac spine. When the needle comes into contact with the posterior iliac spine, remove the stilette and attach an empty 10-milliliter syringe to the needle.Gently withdraw the plunger to create negative pressure within the syringe until up to 10 milliliters of bone marrow spicules have been harvested. Do not take more than 10 mils of bone marrow per aspirate to avoid hemodilution. Remove the syringe and place the stilette back onto the needle.Then, eject about two milliliters of the marrow into a watch glass and ensure that enough sample is drawn to be injected into a heparin-coated eight-milliliter tube and immediately invert the tube. To prevent clotting, it is important to invest the anticoagulant-containing tube as soon as the bone marrow is added. For optimal morphological assessment, use a plastic spatula to transfer spicules from the aspirate in the watch glass onto a glass slide, and carefully glide another glass slide on top of the marrow.After drying, stain the spicules with May-Grunwald Giemsa for analysis by light microscopy. Place the bone marrow tube in a plastic holder and place the holder into a plastic container with an ambient gel pack and a completed request form. Before analyzing the bone marrow by flow cytometry, start up the flow cytometer and open the flow cytometry analysis software to create a new experiment with a forward scatter versus side scatter dot plot.For assessment of the size and granularity of the cells, load unlabeled lysed peripheral blood cells from a healthy donor and select the Acquire Cells function. Gate the lymphocytes and adjust the forward and side scatter voltages to reach the appropriate mean target values for the gated cell population. Then, acquire data for at least 10, 000 events.To set up the target florescence channel photo multiplier tube voltages, first use eight-peak rainbow bead calibration particles according to the manufacturer's instructions to acquire 10, 000 events at a low flow rate. Gate the singlet beads in the forward versus side scatter dot plot followed by gating the 7th peak in the FITC-PE dot plot. Gate the resulting bead populations for each fluorophore.Continue the acquisition of the eight-peak rainbow bead suspension and adjust and fine-tune PMT voltages in all fluorescence channels to reach target MFI values according to the manufacturer's instructions. Use Record to collect data of about 2, 000 events and check the MFI for the 7th peak beads. Next, add a sufficient volume of each experimental flourochrome conjugated antibody to stain the beads in the corresponding florescence tubes minus one control and vortex the tubes thoroughly.Create a new blank experiment with the same compensation parameters taking care that the forward scatter threshold is set to 5, 000 and the compensation values of all the flourochromes are zero. To create the compensation controls, select the Create Compensation Control function and load the unstained control tube. Adjust the P1 gate around the singlet bead population and confirm that the P1 gate contains only singlet beads.Right-click the P1 gate and select Apply to All Compensation Controls. Then, record data for all of the single labeled florescence tubes confirming that the P2 gate encompasses the positive population on each florescence histogram. To stain the cells for flow cytometric analysis, transport the bone marrow to the laboratory, check the request form to verify patient study number and date of birth and determine what needs to be stained.For MRD, we use a staining panel consisting of four tubes. Here we demonstrate the staining of the LSC panel which consists of one tube. After cell count, transfer the appropriate volume of bone marrow into a new 15-milliliter tube.Add lysis buffer at 10 times the experimental cell volume to lyse the red blood cells. Invert the tube to mix and incubate the cells for 10 minutes at room temperature. At the end of the lysis period, pellet the cells by centrifugation.Resuspend the cells in 15 milliliters of wash buffer at room temperature and harvest the cell pellet again by centrifugation. In the meantime, pipette the appropriate amount of antibody cocktail solution in five-milliliter FACS tubes. Shown here is the panel for the stem cell tube.Resuspend the pellet in wash buffer and add the cell's suspension to the FACS tube containing the monoclonal antibody cocktail solution for a 15-minute incubation in the dark. Then, wash the cells in wash buffer and pellet the cells by centrifugation. After centrifugation, resuspend the pellet in 400 microliters of fresh wash buffer.To analyze the leukemic stem cells, add four microliters of blank beads to the cell suspension that is stained with the stem cell antibody cocktail. Then, read the samples using the previously set parameters acquiring at least four times 10 to the 6th events from the experimental patient samples. To identify the leukemia-associated immunophenotype observed in approximately 90%of acute myeloid leukemia patients, it is crucial that the blast gates are set appropriately as illustrated.Here, examples of data from individual patients harboring different types of aberrancy on the CD34-positive primitive cells are shown. In these graphs, a patient who remains in complete remission and a patient who relapsed after having measurable residual disease positive results after the second cycle of induction therapy can be observed underscoring the need for accurate gate setting prior to sample analysis. The identification and quantification of LSC requires additional analysis of aberrancies specifically on CD34-positive CD38-negative blast cells as shown in these graphs.While performing this protocol, it's very important to have specialized and backup personnel for the bone marrow sampling, the transport, the experimental work and analysis steps of this procedure. This procedure can also be used to perform cytogenetic and molecular analysis to answer additional questions about the correlation between specific cell populations and molecular aberrancies of interest, or to refine the risk group of a patient for predicting clinical outcome. After its development, this technique paved the way for researchers in the field of hematology to explore residual disease in AML patients after treatment.After watching this video, you should have a good understanding how we accurately identify and quantify residual disease by using flow cytometry including the collection and transportation of bone marrow samples of AML patients.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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Ricerca

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A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

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Un protocollo per Rapid post-mortem delle cellule Cultura della diffusa intrinseca Pontine glioma (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

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Lo spostamento verso l'alto: Un semplice e flessibile In Vitro tridimensionale invasione protocollo di analisi

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

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Il flusso Cytometry per stimare cellule staminali leucemia nella leucemia mieloide acuta primaria e negli xenotrapianti paziente-derivato, alla diagnosi ed al Follow Up

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

Misurare il rimodellamento osseo e ricreare il microambiente tumore-osso utilizzando la co-cultura Calvaria e l'ibitorometria

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Flusso Analisi citometrica delle specie di ossigeno reattivo mitocondriale nelle cellule staminali e semigeniche Murine Hematopoietic e MLL-AF9 Driven Leucemia

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone

Modellazione dei tumori ossei primari e delle metastasi ossee con impianto di innesto tumorale solido nell'osso

Primary bone tumors or bone metastasis from solid tumors result in painful osteolytic, osteoblastic, or mixed osteolytic/osteoblastic lesions. These ...

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Due approcci citometrici a flusso del rilevamento della superficie del ligando NKG2D per distinguere le cellule staminali dalle sottopopolazioni di massa nella leucemia mieloide acuta

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice

Trapianto intra-peritoneale per la generazione di leucemia mieloide acuta nei topi

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