Name: comprehensive protocol to sample and process bone marrow for measuring measurable residual disease and leukemic stem cells in acute myeloid leukemia
Uploaded: 2018-03-05T12:30:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia at JoVE.c

この研究は、フォンクのオランダのがん学会 (アルペ 2013年-6371) と Egbers 財団によってサポートされています。コラボレーションのオランダ急性骨髄性白血病-MRD ワーキング グループと継続的な改善と AML MRD の標準化のための有意義な議論に感謝します

<ol>
	<li>D&#246;hner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+management+of+AML+in+adults:+2017+ELN+recommendations+from+an+international+expert+panel.">Diagnosis and management of AML in adults: 2017 ELN recommendations from an international expert panel.</a> Blood. 129 (4), 424-447 (2017).</li><li>Zwaan, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collaborative+Efforts+Driving+Progress+in+Pediatric+Acute+Myeloid+Leukemia.">Collaborative Efforts Driving Progress in Pediatric Acute Myeloid Leukemia.</a> J Clin Oncol. 33 (27), 2949-2962 (2015).</li><li>Cornelissen, J. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residual+disease+detected+by+multidimensional+flow+cytometry+signifies+high+relapse+risk+in+patients+with+de+novo+acute+myeloid+leukemia:+a+report+from+Children's+Oncology+Group.">Residual disease detected by multidimensional flow cytometry signifies high relapse risk in patients with de novo acute myeloid leukemia: a report from Children's Oncology Group.</a> Blood. 120 (8), 1581-1588 (2012).</li><li>Zeijlemaker, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+one-tube+assay+for+immunophenotypical+quantification+of+leukemic+stem+cells+in+acute+myeloid+leukemia.">A simple one-tube assay for immunophenotypical quantification of leukemic stem cells in acute myeloid leukemia.</a> Leukemia. 30 (2), 439-446 (2015).</li><li>. Guidance for Collection, Transport and Submission of Specimens for Ebola Virus Testing Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/vhf/ebola/healthcare-us/laboratories/specimens.html">https://www.cdc.gov/vhf/ebola/healthcare-us/laboratories/specimens.html</a> (2017)</li><li>Bachas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+minor+subpopulations+within+the+leukemic+blast+compartment+of+AML+patients+at+initial+diagnosis+in+the+development+of+relapse.">The role of minor subpopulations within the leukemic blast compartment of AML patients at initial diagnosis in the development of relapse.</a> Leukemia. 26 (6), 1313-1320 (2012).</li><li>Ravandi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+minimal+residual+disease+assessed+by+multiparameter+flow+cytometry+is+highly+prognostic+in+younger+patients+with+acute+myeloid+leukemia.">Persistence of minimal residual disease assessed by multiparameter flow cytometry is highly prognostic in younger patients with acute myeloid leukemia.</a> Cancer. 123 (3), 426-435 (2017).</li><li>Hourigan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurable+residual+disease+testing+in+acute+myeloid+leukaemia.">Measurable residual disease testing in acute myeloid leukaemia.</a> Leukemia. 31 (7), 1482-1490 (2017).</li></ol>

いくつかの独立した協会の幹細胞管の検証に使用される抗体カクテルは、BD によって提供された親切。著者が本稿に関連して開示する何もありません。

十分なデータは、貧しい人々 の生存に関連付けられている MRD 陽性のための証拠を示す利用可能な MRD の評価、時に臨床の意思決定を行うことができます追加の予後に関する情報を提供することにより患者の転帰を改善するため。したがって、一貫性のある、調和のとれた MRD の免疫表現型の評価法は最終的に患者の治療を改善するために不可欠です。異なる臨床サイト間で臨床研究を比較するときこれも重要です、可能性があります最終的に臨床に役立つ意志決定と生存のサロゲートの臨床的エンドポイントとして提供します。確固たる指針が正確かつ一貫した MRD 測定保証されます概念は、最先端のデザイン ガイドライン ヨーロッパ白血病ネットワーク (ELN) の協調行動につながっています。この包括的な文書公開後半 ~ 2017 年になります、多くの研究グループと研究所の前進のために尽力されます。
プロトコルの中で重要なステップ
MRD の分析の重要な頻繁に見落された面は、MRD の正確な定量における試料の品質の影響です。これは、素材はこの設定で考慮する必要がある追加の操作上の注意を与えられたグローバルな臨床試験で他の機関に運ばれるより明らかです。患者は、混同のリスクを軽減するには、情報とサンプルの適切な管理のタイムリーな配信は欠かせません。もう一度、輸送のこの段階で正しいフォームおよび/または要求された分析の割り当てのクリアと電子病院システムへのインポートが必要です。MRD サンプリングの療法でステージを指摘し (たとえば後療法の第 2 コース) 臨床的意思決定に関連することがあるためにも重要です、したがって明確に定義する必要があります。モック データ (例えば 1 月 1 日出生の年間) などの使用患者や分析は、混同のリスクが高まります。法律によって要求された場合、匿名識別の方法を使わなければなりません。
診療のすべての標本コレクションの 24 h 内で優先的に処理されます。ない recommendable、骨髄および末梢血サンプルまだ処理および分析できる周囲温度で 72 h を続けたとき。さらに、材料をすべて処理最高実行できます無菌条件の下で (ローカル) バイオバンクの細胞のそれ以上の凍結保存も依然、: 多くの臨床研究がある白血病細胞をさらに調査の追加分析尊敬する分子、免疫表現型と後の段階で実行する機能。しかし biobanking の詳細は本稿の範囲を超えています。
MRD を診断ツールとして使用して、フローサイトメトリー用のみならず、MRD 評価の品質管理についても、公認の実験室が必要がありますを意味します。これは特定の参照実験室または (再) 参照チームによる MRD 測定フロー ファイルの分析のサンプルを配布する必要があります。
骨髄吸引コレクションから効果的な責任、特定のタスクとの頻繁なコミュニケーションの専門家のチーム全体を必要とする臨床サンプルの MRD の決定への最も重要なアクションについて説明します評価と解析。各タスクの手順に重要なので、各研究所と十分なバックアップ人員はタスクの特に訓練されたプロトコルを含む音の物流にそれをお勧めします。さらに、プロシージャ (特に LAIP と LSC 異常マーカーの識別) の一部にいくつかの比較的主観的な手順なのでそれはチームによって最終的な結果についての議論を有しのチームによって承認された最終報告書に不可欠です監督者。現在の取り組みは、(LAIP と LSC) MRD 分析の標準化に役立つコンピュータ ソフトウェアの開発を追求しています。
変更とトラブルシューティング
各演習は MRD 測定文書に対する今回の ELN 最先端のガイドラインに記載されている同等の結果を得るには、不可欠ですマーカーの標準化されたバックボーンを持つが、異なる集団を定義するために使用できる抗体の独自のセットを持つことができます。上記に呼ばれます。関係なく選択したマーカーの結果の分析を難しくことができ、考慮する必要がありますいくつかの問題があるのです。
技術の限界
LAIP と LSC の異常マーカー発現の識別まず診断で評価、MRD 表現型の正確な特性評価 (中および治療後) の時間にわたって監視します。まだ何人かの患者ない定義された LAIPs またはなしの cd 34 + CD38-LSCs がある CD34 陰性の爆発で提示または行方不明の診断サンプルを持っている以上、患者の 95% は、LAIP または LSC (またはその両方) で評価できる中、。 これらのケースでそれはまだしようとする使用できるセル数ができ、最も信頼性の高いの (与える) の白血病細胞の最も強い区別を選択とは違った抗体のパネルと MRD を測定価値がある LAIP。検討して最終的に再発を行う患者の割合診断イムノフェノ タイプの急性骨髄性白血病の病気の多様性により、完全に似ていないことをとにかく推奨は MRD で抗体の広いパネルを測定します。これらの肺浸潤シフトがブラスト細胞 LSCs など療法16の間に発生することが示されているし、測定可能な病気は、これらのいわゆる今後人口に基づいて可能性があります。この時点でしかし、それ決定されていないかどうかすべての肺浸潤サブ集団は病気の再発につながるし、したがって臨床試験のこれらのセルに基づく MRD 調整療法を報告する一般的なないです。1 つの管のアプローチでは最も重要な aberrancy 定義するマーカーが 1 つフローサイトメトリー (PE) チャンネルは14LSC 人口転位のために行方不明者のリスクを軽減するに注意してくださいすることが重要です。
既存のメソッドの意義
このプロトコルで説明する方法は、どの細胞が治療中に続いている 1 つまたは複数の LAIPs の定義に依存します。この方法の欠点は、それが表示されたこと最近、LAIP 療法の間に変わるかもしれないことです。このように異なる異常マーカーといくつかの今後の集団を見逃す可能性があります。これを回避するには、最高の診断で見つけたものだけでなくすべての異常なマーカーを測定することです。これはいくつかの研究所17によって使用される「普段と違う」の手法と同様になります。
将来のアプリケーション
最近では、MRD は新規臨床試験デザインの特別な注意を受けています。MRD のアウトカム指標としての使用、専門的な治療オプションとターゲットを絞った薬物療法の時代に最終的に許可の高速の導入急務治療、新しい治療法の臨床効果を確立するために必要な時間が短縮されます。診療所にオプション。適切な物流の重要性と調和の MRD 評価の実用的な実行 FDA は現在、全生存期間ではなく代理エンドポイントとして MRD を使用しての可能性を調査中です、将来の急性骨髄性白血病の治療の成功に重大であります。18を測定します。

急性骨髄性白血病 (AML) は通常造血と最終的に骨髄障害の抑制骨髄前駆細胞の異常増殖と蓄積成熟プログラムの欠陥によって特徴付けられる骨髄の悪性腫瘍.病気は治療効果や治療結果1,2だけでなく、形態・ イムノフェノ タイプ、細胞遺伝学、分子の異常と遺伝子発現シグネチャに関して極めて不均一。現在管理を含む完全寛解 (CR)、続いて寛解後治療を分子、細胞遺伝学的の結果によって導かれる主を目指す誘導療法と肺浸潤研究では、いずれかの追加化学療法または (自己または同種) 幹細胞移植3のいくつかのコース。 高い寛解率にもかかわらず大人で 5 年生存率 90% までの集中的な化学療法を約 30%-40% の開発のために主にのみ後再発一般的化学療法に抵抗性と治療するためにそれにより非常に困難であります。子供たちの結果は、約 3 分の 1 も再発が、良いです。したがって、差し迫った再発の早期発見は、満たされていない医療ニーズを満たす、寛解後療法4をガイドがあります。
治療は、すべての診断と後診断抵抗メカニズム/要因の合計を反映可能性があります後残存病変したがって予後と器楽指導の処置のための測定があります。出店残存病変 (MRD として測定可能な今呼ばれる残存病変や微少残存病変が旧称) の 5% ブラスト細胞の形態学的基準をはるかに下回るの可能性は、リスク分類の風景を変えています。現在ほとんど MRD を検出するために使用する 2 つの方法は、フロー フローサイトメトリーおよび分子に基づく、後者逆転写酵素 (RT qPCR) PCR5によって評価されて、時期尚早の段階ではあるが次世代シーケンス (NGS)。大人だけでなく子供のように多くの研究はすでに MRD のさまざまなアプローチが両方誘導と統合療法6,7、および病気の負担 (新しい定義後に急性骨髄性白血病の強力な予後情報を提供することを実証形態学的 CR に優れた) 今浮上している8。これは、MRD 評価フローおよび/または分子技術になるべきと実際にはすでに標準になり、急性骨髄性白血病のすべての臨床試験で示唆しています。
本稿では、骨髄のサンプル、骨髄サンプリングを含む、処理手順フローサイトメトリーの前で MRD の正確かつ再現性肺浸潤特性を取得する詳細な流れ cytometry 手順について説明します。診断と経過観察で質の良い骨髄サンプルの可用性は、臨床現場と臨床試験でこの測定の成功に不可欠です。実際には、極めて重要な分子 (PCR と NGS) MRD アプローチはこれらの事前分析に関する考慮事項があります。MRD の肺浸潤特性の異常発現マーカーは、通常骨髄系前駆細胞マーカー、白血病関連イムノフェノ タイプ (LAIP)9と結合されます。MRD は、組み込み関数または取得した白血病の薬剤耐性、薬力学療法、免疫監視およびコンプライアンスの動態などの治療への反応に影響を及ぼす多くの要因の結果を測定します。したがって、MRD は受信者動作特性 (ROC) 解析によって決定されるカットオフ レベルに思って下さいした臨床の結果に関連付けられている非常に強力なポスト診断予後パラメーターです。HOVON 42 a の私達の大人の急性骨髄性白血病のコホート研究、カットオフ レベルを LAIP 肯定的な細胞/総白血球細胞の 0.1% に設定します。この基準を使用すると、否定的な対正 MRD ステータスを決定するため、患者のグループ識別できます大幅に悪化再発率、無再発と全生存期間6を持っています。さらに、患者のアウトカム10の強力な予測を提供する (cd 34 + CD38-白血病幹細胞または LSC) の幹細胞のような機能を持つ未熟な, 薬剤耐性白血病細胞の測定について述べる。一緒に LAIP と LSC 形フロー フローサイトメトリーによる MRD アプローチに近づきます。LAIP アプローチは、LSC アプローチは、患者の約 80% で適用することができます中に、患者の約 90% に適しています。1 つのパラメーターまたは両方の患者の 95% が評価することができますの一緒に。
最後に、この文書は、フローサイトメトリーによる MRD を評価するために詳細な操作説明を提供します。これが含まれます: 1) 調和および/または骨髄試料採取方法の標準化、2) サンプル交通指導 3) 詳細説明白血病細胞検出の FACS 単一セル管アプローチを含むいくつかの抗体パネルを使用するとLSC、4 を特徴付ける)、FACS のセットアップは、標準化された測定、5 機) MRD 測定および 6 の分析プログラム) LSC 検出のための解析プログラム。
以来、それは究極の結果の質の重要な問題についてはほとんどサンプル準備を含むプロシージャのすべてのファセットを表示を目指しています。骨髄穿刺と生検、骨髄内の造血細胞を評価する臨床試験の手順。これらは、完全な血計算 (CBC) と血液塗抹標本と一緒に実行されます。骨髄穿刺する最適の方法は、正確な診断とフォロー アップの MRD 測定に不可欠です。さらに、正常な骨髄液は LAIP と LSC のフロー分析 (少なくとも 1000 万実行可能な細胞) を実行する十分なセルを含める必要があります。ここで、骨髄穿刺の実行方法を説明し、でを結果十分なセル サンプリング (限界希釈の可能性) に必要な正確な診断および付加的な研究のためのガイドラインを提供します。極めて重要な分子 (PCR と NGS) MRD アプローチのこれらの事前分析の考慮事項があります。診療のすべての標本コレクションの 24 h 内で優先的に処理されます。ない recommendable、骨髄および末梢血サンプルまだ処理および分析できる周囲温度で 72 h を続けたとき。さらに、後の研究/品質評価などの無菌細胞の凍結保存を有効にするために、無菌条件下で材料ですべて処理を実行必要があります。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >120995496,060996589 and 013729</td>
			<td >FACS Canto II&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >555360</td>
			<td>CD7 FITC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >DAKO</td>
			<td >F076701</td>
			<td>CD2 FITC</td>
		</tr>
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			<td ></td>
			<td >Sanquin</td>
			<td >M1613</td>
			<td>CD36 FITC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >332778</td>
			<td>CD15 FITC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>335039</td>
			<td>CD45RA FITC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >345810</td>
			<td >CD56 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >337899</td>
			<td >CD22 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >345785</td>
			<td >CD14 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Miltenyi Biotec</td>
			<td >130-080-801</td>
			<td >CD133 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562566</td>
			<td>Clec12a PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565568</td>
			<td>Tim-3 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >332774</td>
			<td >CD7 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >333142</td>
			<td >CD11b PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >337899</td>
			<td >CD22 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >345810</td>
			<td >CD56 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >347222</td>
			<td >CD34 PERCP-CY5.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558714</td>
			<td>CD123 PERCP-CY5.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Beckman Coulter</td>
			<td>B49221</td>
			<td >CD117 PE-CY7</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562854</td>
			<td>CD33 BV421</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >345791</td>
			<td >CD19 APC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >333143</td>
			<td >CD11b APC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >345800</td>
			<td >CD33 APC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>345807</td>
			<td>CD38 APC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >641411</td>
			<td >HLA-DR APC-H7</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560532</td>
			<td>CD44 APC-H7</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >562596</td>
			<td >CD13 BV421</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>348811</td>
			<td>CD34 PE-CY7</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Beckman Coulter</td>
			<td>A96416</td>
			<td >CD45 Krome Orange</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>655873</td>
			<td >CD45 HV500c</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >655051</td>
			<td>CST beads&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >555899</td>
			<td>Pharm lysing solution</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >644204</td>
			<td>Multicolor CompBeads</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >655051</td>
			<td>CST beads</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td ></td>
			<td>FACSDiva software</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Cytognos</td>
			<td ></td>
			<td >Infinicyt&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Spherotech</td>
			<td>Euroflow RCP-30-5a</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td ></td>
			<td >Tuerk solution</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Spherotech</td>
			<td>BCP-100-5</td>
			<td>Blank Calibration Particles Beads</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#160;&#160;</td>
			<td >&#160;&#160;</td>
			<td >&#160;&#160;</td>
			<td >HSA</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#160;&#160;</td>
			<td >&#160;&#160;</td>
			<td >&#160;&#160;</td>
			<td >Azide</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#160;&#160;</td>
			<td >&#160;&#160;</td>
			<td >&#160;&#160;</td>
			<td >ddH2O</td>
		</tr>
	</tbody>
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comprehensive protocol to sample and process bone marrow for measuring measurable residual disease and leukemic stem cells in acute myeloid leukemia

急性骨髄性白血病 (AML) の判定は、患者が完全寛解 (CR) を達成しているかどうかを決定する利用形態の検討と再確立近年します。約残留急性骨髄性白血病骨髄細胞の伸長による 12 ヶ月以内 CR に入った大人の患者の半数に再発します。これらの残りの最小限または測定可能な残存病変 (MRD) として知られているが、白血病細胞の定量は、堅牢なこれらの再発の予測マーカーをすることができます。 さらに、いくつかの研究の回顧的分析は、急性骨髄性白血病の患者の骨髄の MRD の存在が貧しい人々 の生存と相関することを示しています。白血病の総人口は、だけでなく、細胞、白血病をかくまっている免疫表現 (LAIP)、臨床結果に関連付けられている関連付けられているが、白血病幹細胞 (LSC) をすることができますどちらの未熟な低周波の亜種は、反映フローサイトメトリー MRD または MRD のようなアプローチで監視。特定の病気または疾患関連の機能 (異常な分子マーカーまたは異常 immunophenotypes) に基づいて残留白血病 (幹) 細胞の検出を有効にする敏感な試金の可用性が大幅に改善された MRD 評価を持ってください。アジア ・ マイル リミテッド。ただし、固有の多様性と疾患として急性骨髄性白血病の複雑さを考えると、骨髄をサンプリングし、MRD と LSC の解析を実行するためのメソッド調和させるべき可能な場合。本稿で我々 は十分な骨髄液をサンプリング詳細な方法を説明します、輸送、最適なマルチカラー フロー フローサイトメトリー評価の処理や MRD と LSC 治療決定の支援するために評価するための戦略をゲート急性骨髄性白血病の患者。

急性骨髄性白血病患者の 90% に少なくとも 1 つの LAIP を識別できます。LAIP + 診断で原始的なブラスト細胞の細胞の正確な割合を生成するために、ブラスト ゲートの適切な設定は図 3の可視化としての検証が必要、欠かせません。Aberrancy プリミティブ CD34 陽性細胞上の特定の種類を抱いてそれぞれの患者の例を図 5に可視化します。によるフォロー アップ時の MRD の計測、以前定義された LAIP + セル ゲートして WBC の LAIP + 細胞の割合として定義します。このゲートの設定右の MRD の結果を達成することが重要です。図 6は、誘導療法の 2 番目のサイクル後完全寛解は、患者と MRD の肯定的な結果 (≥ 0.1%) をした後再発患者を示します。
現在のプロトコルは、この区画の徹底した特性 CD38 人口港湾分数のような最も強力な幹細胞であることを示しているので、CD34 陽性細胞、幹細胞を定義に適していますのみ。この分数内 HSC から LSC を分離するために追加のマーカーが使用されます。LSC を区別するためにほとんどの場合選択したマーカーは CD45RA と PE の付いた 6 特定 LSC のマーカーをかくまっているコンビ チャネルです。さらに臨床的評価に基づき、≥ 0.004% のカットオフ レベルとして定義されて LSC 正、0.0001% のカットオフ レベル継続調査10で使われていた診断で悪化の生存と関連していた。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig1.jpg"> 図 1:骨髄塗抹します。A) 健康なドナーと患者 B) 急性骨髄性白血病 (FAB 5 サブタイプ)。ギムザ染色の 100 倍の倍率で表示されます。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig2.jpg"> 図 2: 体液の包装材料を修正します。疾病管理・予防センターのウェブサイト15規則および規制の体液の輸送に関する詳細を見つけることが。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig3.jpg"> 図 3: 爆発のセルを定義するための戦略をゲーティングします。A) CD45dim、B ゲート) ゲート cd34 爆発します。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig4.jpg"> 図 4: リンパ球をゲーティングします。A) 青色のセルは WBC B) 緑の細胞がリンパ球 CD45高/SSC低、C によって特徴付けられる FSC/SSC プロットで示されて) CD34、D) CD117 と E)、CD13 の否定の否定のための否定的な例 F) 異なった細胞のタイプを示しますが、概要人口ツリー。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig5.jpg"> 図 5: 急性骨髄性白血病の診断で LAIPs です。A) LAIP に基づいて系統 aberrancy クロス (CD7 CD33 発現細胞)、B) LAIP は、非同期の分化に基づく (CD13 発現細胞の CD11b)、C) LAIP (CD34 で非常に高いCD13 発現細胞)、正常な細胞に比べて過剰発現に基づく D)。LAIP は、underexpression (HLA)、低CD33 の発現細胞の正常な細胞と比較してに基づいています。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig6.jpg"> 図 6: LAIP 続いて療法中。診断で A) LAIP 定義 (CD34 + CD13 + CD33-) と連続完全寛解、診断で B) LAIP 定義に残った患者のフォロー アップ中に LAIP の損失 (CD117 + CD7 + CD33 +) と LAIP の患者のフォロー アップ中に永続性人再発。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig7.jpg"> 図 7: 幹細胞のゲーティングします。異なる cd34 陽性) のゲーティング + ビーズ (CD38非常に低いLSC を表す真の否定的な細胞として定義され、ビーズの中央下にある中、ビーズの上部のボーダー以下は CD38低)、に基づいて B) 2 CD38 集団CD45RAnegと CD45RApos式に基づいてフォロー アップで HSC と LSC の区別の患者の例です。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
補足ファイル 1.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/Sampling_Form_MRD_1.pdf" target="_blank">をクリックしてくださいここにダウンロードこのファイル</a>。
補足ファイル 2.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/Sampling_Form_MRD_2.pdf" target="_blank">をクリックしてくださいここにダウンロードこのファイル</a>。
補足ファイル 3.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/Supplementary_information_revised_Cloos_et_al_final2018.docx" target="_blank">をクリックしてくださいここにダウンロードこのファイル</a>。

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Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

最小限、または測定可能な残存病変 (MRD) の検出は、リスク アセスメントを精製急性骨髄性白血病 (AML) の再発を予測するための重要な予後バイオ マーカーです。これらの包括的なガイドラインと、MRD の一貫性と正確な同定と検出のためのベスト プラクティスと推奨事項は、意思急性骨髄性白血病の治療に役立つ可能性があります。

サンプルおよび測定可能な残存病変と急性骨髄性白血病の白血病幹細胞を測定するプロセス骨髄に対する包括的なプロトコル

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

The overall goal of this protocol is to perform an accurate testing of bone marrow samples from acute myeloid leukemia patients for measurable residual disease including the quantification of leukemia stem cells. This method can provide an accurate assessment of measurable residual disease in bone marrow samples of acute myeloid leukemia patients. The main advantage of this approach is that a close following of the protocol yields highly-reproducible, high-quality results.The implications of this technique extends toward clinical decision-making as it can be used as a read-out of patients'response to treatment. Demonstrating the procedures will be Jeroen Janssen, hematologist, Gerrit Sijm, technician of the diagnostic hematology laboratory and Jennifer Scheick and Sander Snel, technicians of the MRD team. With the patient in the lateral decubitus position, mark the superior posterior iliac spine with a pen and disinfect the skin of the intended biopsy area with 0.5 to 1%chlorhexidine in ethanol in an outward circular motion.After administering a local anesthetic, pick up a 15-gauge 2.8-inch needle with the proximal end in the palm and the index finger against the side of the metal shaft of the needle near the tip for control. Using gentle but firm pressure, introduce the needle with a quick alternating pronating supinating movement through the anesthetized skin toward the iliac spine. When the needle comes into contact with the posterior iliac spine, remove the stilette and attach an empty 10-milliliter syringe to the needle.Gently withdraw the plunger to create negative pressure within the syringe until up to 10 milliliters of bone marrow spicules have been harvested. Do not take more than 10 mils of bone marrow per aspirate to avoid hemodilution. Remove the syringe and place the stilette back onto the needle.Then, eject about two milliliters of the marrow into a watch glass and ensure that enough sample is drawn to be injected into a heparin-coated eight-milliliter tube and immediately invert the tube. To prevent clotting, it is important to invest the anticoagulant-containing tube as soon as the bone marrow is added. For optimal morphological assessment, use a plastic spatula to transfer spicules from the aspirate in the watch glass onto a glass slide, and carefully glide another glass slide on top of the marrow.After drying, stain the spicules with May-Grunwald Giemsa for analysis by light microscopy. Place the bone marrow tube in a plastic holder and place the holder into a plastic container with an ambient gel pack and a completed request form. Before analyzing the bone marrow by flow cytometry, start up the flow cytometer and open the flow cytometry analysis software to create a new experiment with a forward scatter versus side scatter dot plot.For assessment of the size and granularity of the cells, load unlabeled lysed peripheral blood cells from a healthy donor and select the Acquire Cells function. Gate the lymphocytes and adjust the forward and side scatter voltages to reach the appropriate mean target values for the gated cell population. Then, acquire data for at least 10, 000 events.To set up the target florescence channel photo multiplier tube voltages, first use eight-peak rainbow bead calibration particles according to the manufacturer's instructions to acquire 10, 000 events at a low flow rate. Gate the singlet beads in the forward versus side scatter dot plot followed by gating the 7th peak in the FITC-PE dot plot. Gate the resulting bead populations for each fluorophore.Continue the acquisition of the eight-peak rainbow bead suspension and adjust and fine-tune PMT voltages in all fluorescence channels to reach target MFI values according to the manufacturer's instructions. Use Record to collect data of about 2, 000 events and check the MFI for the 7th peak beads. Next, add a sufficient volume of each experimental flourochrome conjugated antibody to stain the beads in the corresponding florescence tubes minus one control and vortex the tubes thoroughly.Create a new blank experiment with the same compensation parameters taking care that the forward scatter threshold is set to 5, 000 and the compensation values of all the flourochromes are zero. To create the compensation controls, select the Create Compensation Control function and load the unstained control tube. Adjust the P1 gate around the singlet bead population and confirm that the P1 gate contains only singlet beads.Right-click the P1 gate and select Apply to All Compensation Controls. Then, record data for all of the single labeled florescence tubes confirming that the P2 gate encompasses the positive population on each florescence histogram. To stain the cells for flow cytometric analysis, transport the bone marrow to the laboratory, check the request form to verify patient study number and date of birth and determine what needs to be stained.For MRD, we use a staining panel consisting of four tubes. Here we demonstrate the staining of the LSC panel which consists of one tube. After cell count, transfer the appropriate volume of bone marrow into a new 15-milliliter tube.Add lysis buffer at 10 times the experimental cell volume to lyse the red blood cells. Invert the tube to mix and incubate the cells for 10 minutes at room temperature. At the end of the lysis period, pellet the cells by centrifugation.Resuspend the cells in 15 milliliters of wash buffer at room temperature and harvest the cell pellet again by centrifugation. In the meantime, pipette the appropriate amount of antibody cocktail solution in five-milliliter FACS tubes. Shown here is the panel for the stem cell tube.Resuspend the pellet in wash buffer and add the cell's suspension to the FACS tube containing the monoclonal antibody cocktail solution for a 15-minute incubation in the dark. Then, wash the cells in wash buffer and pellet the cells by centrifugation. After centrifugation, resuspend the pellet in 400 microliters of fresh wash buffer.To analyze the leukemic stem cells, add four microliters of blank beads to the cell suspension that is stained with the stem cell antibody cocktail. Then, read the samples using the previously set parameters acquiring at least four times 10 to the 6th events from the experimental patient samples. To identify the leukemia-associated immunophenotype observed in approximately 90%of acute myeloid leukemia patients, it is crucial that the blast gates are set appropriately as illustrated.Here, examples of data from individual patients harboring different types of aberrancy on the CD34-positive primitive cells are shown. In these graphs, a patient who remains in complete remission and a patient who relapsed after having measurable residual disease positive results after the second cycle of induction therapy can be observed underscoring the need for accurate gate setting prior to sample analysis. The identification and quantification of LSC requires additional analysis of aberrancies specifically on CD34-positive CD38-negative blast cells as shown in these graphs.While performing this protocol, it's very important to have specialized and backup personnel for the bone marrow sampling, the transport, the experimental work and analysis steps of this procedure. This procedure can also be used to perform cytogenetic and molecular analysis to answer additional questions about the correlation between specific cell populations and molecular aberrancies of interest, or to refine the risk group of a patient for predicting clinical outcome. After its development, this technique paved the way for researchers in the field of hematology to explore residual disease in AML patients after treatment.After watching this video, you should have a good understanding how we accurately identify and quantify residual disease by using flow cytometry including the collection and transportation of bone marrow samples of AML patients.

Research

JoVE Journal

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