Name: comprehensive protocol to sample and process bone marrow for measuring measurable residual disease and leukemic stem cells in acute myeloid leukemia
Uploaded: 2018-03-05T12:30:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia at JoVE.c

이 연구는 VONK 네덜란드 암 협회 (알프 2013-6371)와 Egbers 기초에 의해 지원 되었습니다. 우리는 네덜란드 AML MRD 작업 그룹 공동 작업에 대 한 및 지속적인 개선 및 AML MRD의 표준화에 대 한 유익한 토론 감사합니다.

<ol>
	<li>D&#246;hner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+management+of+AML+in+adults:+2017+ELN+recommendations+from+an+international+expert+panel.">Diagnosis and management of AML in adults: 2017 ELN recommendations from an international expert panel.</a> Blood. 129 (4), 424-447 (2017).</li><li>Zwaan, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collaborative+Efforts+Driving+Progress+in+Pediatric+Acute+Myeloid+Leukemia.">Collaborative Efforts Driving Progress in Pediatric Acute Myeloid Leukemia.</a> J Clin Oncol. 33 (27), 2949-2962 (2015).</li><li>Cornelissen, J. 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여러 독립적인 기관에 줄기 세포 관의 유효성 검사에 사용 하는 항 체 칵테일 친절 하 게 BD에 의해 제공 되었다. 저자는이 원고에 관하여 공개 없다.

충분 한 데이터는 사용할 수 있는 MRD 양성 가난한 생존와 관련 된 것에 대 한 증거를 보여 및 따라서 MRD 평가는 임상 결정을 만들 수 있습니다 추가 전조 정보를 제공 하 여 환자의 결과 향상 될 수 있습니다. 그러므로, MRD의 면역 phenotypic 평가 대 한 일관 되 고 통일 된 방법 궁극적으로 환자 치료를 개선 하기 위해 필수적입니다. 이것은 또한 중요 한 여러 임상 사이트에서 임상 연구를 비교할 때 고 있습니다 궁극적으로 임상에 도움이 결정 하 고 전반적인 생존을 위한 대리 임상 끝점으로 제공. 단단한 지침 서는 정확 하 고 일관 된 MRD 측정에 대 한 보증 개념 디자인의 지침을 유럽 백혈병 네트워크 (ELN)의 공동된 작업을 주도하 고 있다. 이 포괄적인 문서 출판된 늦은-2017, 되며 많은 연구 그룹 및 앞으로 이동 하는 실험실에 대 한 도구가 될 것 이다.
프로토콜 내에서 중요 한 단계
MRD 분석의 중요 한, 그리고 종종 간과 측면 MRD의 정확한 결심에 샘플 품질의 영향 이다. 이 때 더 명백한 물자는 주어진이 설정에서 고려 되어야 하는 데 필요한 추가 작업 고려 글로벌 임상 실험에서 다른 기관에 이송 됩니다. 환자를 혼합의 위험을 줄이기 위해 정보 및 샘플 적절 한 관리의 적시 납품은 중요 합니다. 다시, 전송의이 단계에서 올바른 양식 또는 가져오기 요청된 분석의 명확한 지정 전자 병원 시스템에는 필요 합니다. MRD 샘플링의 치료에서 무대를 지적 또한 중요 한 임상 의사 결정 (예 후 치료의 두번째 과정)와 관련이 있을 수 있습니다 때문 이며 따라서 명확 하 게 정의 해야 합니다. 모의 데이터 (예를 들어 1 월 1 일 출생의 년 당) 사용 환자 또는 분석을 혼합의 위험을 증가 시킵니다. 법에 의해 필요한 경우 익명된 식별 방법은 사용 되어야 한다.
모든 표본 immunophenotyping에 대 한 컬렉션의 24 시간 이내에 우선적으로 처리 한다. 비록 하지 추천, 골 수 및 말 초 혈액 샘플 수 여전히 처리 되며 분석 72 h 최대 주위 온도에 유지 될 때. 또한, 재료와 함께 모든 보정 수행할 수 있는 가장 메 마른 조건 하에서 (로컬) 바이오 뱅크에 셀의 추가 cryopreservation 남아 관련: 많은 임상 연구는 더 이상 백혈병 세포를 조사 하는 추가 분석 이후 단계에서 수행을 분자, 면역 phenotypic 및 기능 기능을 존중 합니다. 그러나 biobanking의 내용은이 원고의 범위 내에서 않습니다.
진단 도구를 사용 하 여 MRD cytometry, 뿐만 아니라 MRD 평가의 품질 관리에 관한 공인된 실험실 필요한 의미 합니다. 이 특정 참조 실험실 또는 (재) 참조 팀 MRD 측정 흐름 파일을 분석 하는 샘플을 배포 해야 합니다.
이 문서는 임상 샘플-효과적인 요구 하는 특정 작업, 책임, 그리고 자주 통신 전문가의 전체 팀에에서 MRD의 결심에 골 aspirate 컬렉션에서 가장 중요 한 작업을 설명 합니다. 특성화 및 분석입니다. 각 작업 절차에 중요 한 이기 때문에, 사운드 물류 각 실험실과 특별히 훈련을 받은 작업에 대 한 충분 한 백업 인재에 프로토콜을 포함 하는 것이 좋습니다. 또한, 몇 가지 상대적으로 주관적인 단계 절차 (특히 LAIP 및 LSC 탈 마커 식별)의 부분에서, 이후 그것은 최종 결과 대 한 토론 팀, 여 고의 팀에 의해 허가 하는 최종 보고서에 필수적 감독자입니다. 현재 노력 (LAIP 및 LSC) MRD 분석 표준화 하는 것을 도울 것 이다 컴퓨터 소프트웨어 개발을 추구 하 고는.
수정 및 문제 해결
각 실험실 MRD 측정 문서 ELN의 지침에 설명 된 대로 비교 결과 대 한 필수적입니다 마커의 표준화 된 백본 데 있지만 다른 부분 모집단을 정의 하는 데 사용할 수 있는 항 체의 그것의 자신의 세트를 가질 수 있습니다. 위의 참조. 고려 될 필요가 및 결과의 분석을 어렵게 만들 수 있는 몇 가지 문제는 선택한 마커의 불문.
기술의 한계
LAIP 및 LSC 탈 마커 식의 식별 처음 진단에서 평가 하 고 (중과 치료 후) 시간이 지남에 MRD의 표현 형의 정확한 특성화에 대 한 모니터링. 이상 환자의 95% LAIP LSC (또는 둘 다)을 통해 평가 될 수 있다, 그러나 아직도 일부 환자 없다 정의 된 LAIPs 또는 아무 CD34 + CD38-LSCs CD34 부정적인 폭발, 제시 또는 누락 된 진단 샘플을가지고. 이러한 경우에, 그것은 여전히 가치가 시도 하 고 사용 가능한 셀 수 있으며 다음 가장 신뢰할 수 있는 (주는 leukemic 세포의 가장 강한 구별)을 선택으로 광범위 한 항 체의 패널 MRD 측정 LAIP. 고려 할 궁극적으로 재발 하는 환자의 비율 완전히 진단 immunophenotype AML 질병의이 성분으로 인해 유사 하지 않습니다 어쨌든 권장 MRD에서 항 체의 광범위 한 패널을 측정. 이러한 immunophenotypic 교대 LSCs 폭발 세포 등 치료16 동안 발생을 표시 하 고 측정 가능 질병이 소위 곧 인구에 기반 할 수 있습니다. 그러나이 시간에, 그것은 되었습니다 결정 되지 여부 모든 immunophenotypic 부분 모집단 질병 재발으로 이어질 것입니다 하 고 따라서 MRD 맞춤형 치료를 보고 하지 관행에 따라 임상 시험에서이 세포. 그것은 중요 인구 변화 때문 LSC를 누락의 위험에 가장 중요 한 aberrancy 정의 마커 있는 하나의 cytometry (PE) 채널141 개의 관 접근에 의해 감소 된다.
기존의 방법에 관하여 의미
이 프로토콜에서 설명 하는 방법을 하나 이상의 LAIPs, 치료 하는 동안 뒤에 셀의 정의에 의존 합니다. 이 방법의 단점은 최근에 보였다 LAIP 치료 동안 변경 될 수 있습니다. 이런식으로 다른 탈 선 마커 일부 곧 인구를 놓칠 수 있습니다. 이 회피, 진단에만 그 대신 모든 탈 마커 측정 하 기쁠 것 이다. 다음 여러 실험실17에서 사용 되는 "정상에서 다른" 접근 방식에 비슷한 것입니다.
미래의 응용 프로그램
최근, MRD는 새로운 임상 시험 디자인에 대 한 여분의 관심을 받고 있다. 전문된 치료 옵션 및 대상된 약물 치료의 시대에서 결과 조치로 MRD 사용 하 여 궁극적으로의 빠른 소개는 급히 치료 필요 수 있도록 새로운 치료의 임상 효능을 설정 하는 데 필요한 시간이 줄어듭니다. 병원에 옵션입니다. 적절 한 물류의 중요성 및 조화 MRD 평가의 실제적인 실행은 FDA MRD를 사용 하 여 전반적인 생존 대신 대리 끝점으로의 타당성을 조사 하 고 현재로 미래 급성 골수성 백혈병 치료 성공에 중요 한 18를 측정합니다.

급성 골수성 백혈병 (AML)은 골 수의 악성 특징 결함 비정상적인 증식 및 골수성 조상 세포의 축적으로 성숙 프로그램에 의해 정상 조, 그리고 궁극적으로 골 수 실패의 저해 . 질병은 매우 이질적인 형태, immunophenotype, 세포 유전학, 분자 착오 및 유전자 식 서명, 뿐만 아니라 치료 반응과 치료 결과1,2. 완전 한 죄 사 함 (CR), 분자, cytogenetic의 결과 의해 크게 유도 후 죄 사 함 치료 뒤 달성을 목표로 유도 화학요법을 포함 하는 현재 관리 및 immunophenotypic 연구의 구성 추가적인 화학요법 또는 헌 (수용자) 줄기 세포 이식3의 여러 코스. 높은 면제 율에도 불구 하 고 후 최대 90%, 성인 5 년 생존의 집중적인 화학요법만 약 30%-40%, 주로의 개발 때문입니다 일반적으로 화학 요법에 저항 하 고 그로 인하여 매우 취급 하기 어려운 relapses. 아이 들에 있는 결과가 낫다, 약 1/3도 재발 하는 비록. 따라서, 절박 한 재발의 조기 발견 unmet 의학 필요를 채울 것입니다 고 후 사 함 치료4가이드 수 있습니다.
잔여 질병 치료의 모든 진단 및 사후 진단 저항 메커니즘/요인; 합계를 반영 수 있습니다 후 따라서 측정 예 후 및 치료 지침에 대 한 수단이 있을 수 있습니다. Deﬁning 잔여 질병 (최소 잔여 질병 및 지금 추천된으로 측정을 잔여 질병 또는 MRD 이전의 함) 5% 폭발 세포의 형태학 기준 보다 훨씬 가능성 위험 classiﬁcation의 풍경이 변하고 있다. 현재 주로 MRD를 감지 하는 데 사용 하는 두 가지 방법 교류 cytometry-및 분자 기반, 후자는 역전사 PCR (RT-정량)5 에 의해 평가 되 고 또는, 다음 세대에 의해 조기 단계에 있지만 (NGS)를 시퀀싱. 성인 뿐만 아니라 아이 들에서 많은 연구는 이미 다양 한 MRD 접근 AML 모두 후 유도 및 통합 치료6,7, 그리고 질병 부담 (새로운 정의에 강한 전조 정보 제공 증명 우수한 형태 CR) 지금 나오고 있다8. MRD 흐름에 의해 평가 및 분자 기술 되어야, 그리고 사실 이미 되고있다, AML에 모든 임상 시험에서 표준 제안 합니다.
이 원고에서는 골 수 샘플, 골 샘플링을 포함 하 여 및 처리 절차 cytometry 앞에 MRD의 정확 하 고 재현 immunophenotypic 특성을 얻기 위해 상세한 흐름 cytometry 절차를 설명 합니다. 진단 및 속 행에서 좋은 품질의 골 샘플의 가용성은 임상 사이트 및 임상 시험이이 측정의 성공에 결정적 이다. 사실, 이러한 사전 분석 고려 사항은 중요 한 분자 (PCR 및 NGS) MRD 접근의 있습니다. MRD의 immunophenotypic 특성, aberrantly 표현된 마커 보통 골수성 및 조상 마커, 백혈병 관련 된 immunophenotype (LAIP)9를 식별 하기 위해 결합 됩니다. MRD는 치료, 내장 또는 취득 백혈병 약물 저항, pharmacodynamics 등 치료, 면역 감시 및 규정 준수의 활동에 대 한 응답에 영향을 미치는 많은 요인의 결과 측정 합니다. 따라서, MRD는 매우 강한 후 진단 전조 매개 변수 수신기 작동 특성 (ROC) 분석에 의해 결정 된 커트 오프 수준에 dichotomized 때 임상 결과와 관련 된입니다. HOVON 42a의 우리의 성인 AML 일대에 대 한 연구, 인하 수준 LAIP 긍정적인 세포/총 백혈구의 0.1%에서 설정 됩니다. 부정적인 대 긍정적인 MRD 상태를 결정 하기 위한이 기준을 사용 하 여, 환자의 그룹 식별할 수 있습니다 크게 악화 재발 발생률, 재발 및 전반적인 생존6을. 또한, 우리는 환자 결과10의 강력한 예측을 제공 하는 줄기 세포와 같은 기능 (CD34 + CD38-백혈병 줄기 세포, 또는 LSC), 미 숙, 약물 내성 백혈병 세포의 측정을 설명 합니다. 함께 LAIP 및 LSC 양식 흐름 cytometric MRD 접근 접근 한다. LAIP 접근 LSC 접근 약 80%의 환자에 적용할 수 있는 하는 동안, 환자의 약 90% 위해 적당 하다. 매개 변수 하나 또는 둘 다 함께 이상 환자의 95%를 평가할 수 있다.
마지막으로,이 게시 cytometry MRD 평가를 상세한 작업 설명이 제공 됩니다. 이것은 포함 한다: 1) 조화 및 골 샘플링 절차의 표준화, 샘플 2) 교통 지도 3) 상세한 설명 leukemic 세포 검출의 FACS 단일 셀 튜브 접근을 포함 한 여러 가지 항 체 패널을 사용 하 여 함께 LSC, 4 하)는 FACS의 표준화 된 측정, 5 기계) MRD 측정 및 6에 대 한 분석 프로그램) LSC 탐지에 대 한 분석 프로그램.
우리는 거의 그것은 최종 결과의 품질에 대 한 중요 한 문제 논의 이후 샘플 준비를 포함 하 여 프로시저의 모든 측면을 표시 하고자 합니다. 골 수 포부와 생 검 임상 절차 골 수 내 조 혈 모 세포를 평가 하는 데 사용 되는. 이러한 완전 한 혈액 검사 (CBC) 및 혈액 얼룩 수행 됩니다. 골 수 포부에 대 한 최적의 방법 정확한 진단과 후속 MRD 측정에 대 한 결정적 이다. 또한, 성공적인 골 수 aspirate LAIP 및 LSC 흐름 분석 (10 백만 이상 실행 가능한 세포)을 수행할 충분 한 세포를 포함 해야 합니다. 여기, 우리 골 수 포부를 수행 하기 위한 방법을 설명 해야 적절 한 셀 샘플링 (및 결과 제한 hemodilution에 대 한 잠재력) 필요한 정확한 진단 및 추가 연구에 대 한 지침을 제공 하 고. 이러한 사전 분석 고려 사항은 중요 한 분자 (PCR 및 NGS) MRD 접근의 있습니다. 모든 표본 immunophenotyping에 대 한 컬렉션의 24 시간 이내에 우선적으로 처리 한다. 비록 하지 추천, 골 수 및 말 초 혈액 샘플 수 여전히 처리 되며 분석 72 h 최대 주위 온도에 유지 될 때. 또한, 재료와 함께 모든 보정 나중 연구/품질 평가 등을 위한 무 균 세포의 cryopreservation 수 있도록 무 균 조건 하에서 수행 되어야 합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >120995496,060996589 and 013729</td>
			<td >FACS Canto II&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >555360</td>
			<td>CD7 FITC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >DAKO</td>
			<td >F076701</td>
			<td>CD2 FITC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Sanquin</td>
			<td >M1613</td>
			<td>CD36 FITC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >332778</td>
			<td>CD15 FITC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>335039</td>
			<td>CD45RA FITC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >345810</td>
			<td >CD56 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >337899</td>
			<td >CD22 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >345785</td>
			<td >CD14 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Miltenyi Biotec</td>
			<td >130-080-801</td>
			<td >CD133 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562566</td>
			<td>Clec12a PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565568</td>
			<td>Tim-3 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >332774</td>
			<td >CD7 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >333142</td>
			<td >CD11b PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >337899</td>
			<td >CD22 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >345810</td>
			<td >CD56 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >347222</td>
			<td >CD34 PERCP-CY5.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558714</td>
			<td>CD123 PERCP-CY5.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Beckman Coulter</td>
			<td>B49221</td>
			<td >CD117 PE-CY7</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562854</td>
			<td>CD33 BV421</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >345791</td>
			<td >CD19 APC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >333143</td>
			<td >CD11b APC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >345800</td>
			<td >CD33 APC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>345807</td>
			<td>CD38 APC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >641411</td>
			<td >HLA-DR APC-H7</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560532</td>
			<td>CD44 APC-H7</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >562596</td>
			<td >CD13 BV421</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>348811</td>
			<td>CD34 PE-CY7</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Beckman Coulter</td>
			<td>A96416</td>
			<td >CD45 Krome Orange</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>655873</td>
			<td >CD45 HV500c</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >BD Biosciences</td>
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			<td>CST beads&#160;</td>
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			<td >BD Biosciences</td>
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			<td>Pharm lysing solution</td>
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			<td >644204</td>
			<td>Multicolor CompBeads</td>
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			<td >655051</td>
			<td>CST beads</td>
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			<td>FACSDiva software</td>
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			<td>Euroflow RCP-30-5a</td>
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	</tbody>
</table>

comprehensive protocol to sample and process bone marrow for measuring measurable residual disease and leukemic stem cells in acute myeloid leukemia

환자는 완전 한 죄 사 함 (CR) 달성 여부를 확인 하기 위해 활용 하는 형태 론 적 검사와 급성 골수성 백혈병 (AML)에 응답 기준을 다시 설정 하 고, 최근 되었습니다 수 있습니다. 약 한 CR 성인 환자의 절반 골에 있는 잔여 AML 셀의 파생물 인 12 개월 이내 재발 됩니다. 남아 있는 백혈병 세포, 또는 측정 최소 잔여 질병 (MRD)로 알려진이 정량이이 relapses의 예측에 대 한 강력한 바이오 마커를 될 수 있습니다. 또한, 여러 연구의 회 고 분석 AML 환자의 골 수에서 MRD의 존재와 가난한 생존 상관을 보이고 있다. 뿐만 아니라 총 leukemic 인구, 반영 세포 면역-표현 형 (LAIP), 임상 결과와 관련 된 관련 된는 백혈병을 품고 있지만 그래서 백혈병 줄기 세포 (LSC), 둘 다 수의 미 숙 저주파 부분 모집단 cytometry MRD 또는 MRD와 같은 접근 방식을 통해 모니터링. 질병 또는 질병 관련 기능 (비정상적인 분자 마커 또는 탈 선 immunophenotypes) 기준으로 잔여 백혈병 (stem) 세포의 탐지를 가능 하 게 하는 중요 한 분석의 여부는 대폭 향상 된 MRD 평가 급성 골수성 백혈병. 그러나, 고유의 고 질병으로 AML의 복잡성을 감안할 때, 골 수를 샘플링 및 MRD 및 LSC 분석 방법 해야 될 조화를 이루고 가능 하면. 이 원고는 적절 한 골 수 aspirate 샘플링에 대 한 상세한 방법론 설명, 수송, 최적의 멀티 컬러 흐름 cytometry 평가 대 한 처리 및 게이팅 MRD LSC 치료 결정에 도움이 평가 전략 대 한 AML 환자.

AML 환자의 90%에서 적어도 1 개의 LAIP은 확인할 수 있습니다. LAIP + 진단에서 원시 폭발 세포의 세포의 정확한 비율을 생성 하기 위해 폭발 게이트의 적절 한 설정을 중요 하 고 그림3에서 시각으로 확인 필요 합니다. CD34 + 기본 셀에 aberrancy의 특정 종류를 품고 각 환자의 예는 그림 5에 시각 이다. 에 따라 업 MRD의 측정, 이전 정의 된 LAIP + 셀 문이 고 WBC의 LAIP + 셀의 비율로 정의. 따라서이 게이트의 설정은 바로 MRD 결과 달성 하기 위해 중요 합니다. 그림 6 유도 치료의 두 번째 주기 후 완전 한 죄 사 함에는 환자와 relapses MRD 긍정적인 결과 (≥ 0.1%) 후 환자를 보여준다.
현재 프로토콜은만이 구획의 철저 한 특성화 CD38-인구 분수 처럼 가장 유력한 줄기 세포 비호 나타났습니다 CD34 + 세포, 줄기 세포 정의 적당 하다. 이 분수에서 HSC에서는 LSC를 분리 하기 위하여 추가 마커 사용 됩니다. LSC 구별을 가장 많이 선택 된 표식은 CD45RA 및 PE 표시 6 특정 LSC 마커 은닉 콤 채널 있습니다. 추가 임상 평가 바탕으로, ≥ 0.004%의 커트 오프 수준을 LSC 양성으로 정의 된 고 0.0001%의 커트 오프 수준을 follw 업10에 사용 되었다 하는 동안 진단에 더 생존에 연관 되었다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig1.jpg"> 그림 1 : 골 수 얼룩. A) 건강 한 기증자와 B) AML 환자 (팹 5 하위). Giemsa 얼룩 100 배 확대 표시입니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig2.jpg"> 그림 2 : 생물 학적 체액에 대 한 포장 재료 수정. 생물 학적 체액을 운반의 규정과 규칙에 세부 사항 더 질병 통제 및 예방 센터의 웹사이트15 에서 찾을 수 있습니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig3.jpg"> 그림 3 : 폭발 셀을 정의 하기 위한 전략을 게이팅. A) 게이팅 CD45dim, B) 게이팅 CD34 + 폭발.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig4.jpg"> 그림 4 : 림프 톨 게이트. A) 블루 셀은 B) 녹색 세포는 림프 톨 CD45높은/SSC낮은, C 특징 FSC/SSC 작 에서처럼 WBC) CD34, D) CD117과 E) CD13에 대 한 부정을 위한 부정에 대 한 부정적의 예제 F)는 다른 세포 유형에 표시 되는 개요 인구 나무입니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig5.jpg"> 그림 5 : 급성 골수성 백혈병 진단에 LAIPs. A) LAIP에 따라 혈통 aberrancy 크로스 (CD7 CD33 표현 셀에), B) 비동기 차별화를 기반으로 하는 LAIP (CD13 표현 셀에 CD11b), 정상 세포 (CD34매우 높은 CD13에 표현 하는 셀)에 비해 overexpression를 기반으로 하는 C) LAIP D) LAIP underexpression (HLA-DR낮은 CD33에 표현 하는 세포) 정상 세포에 비해 기반으로 합니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig6.jpg"> 그림 6 : LAIP 치료 동안 다음. 진단에서 A) LAIP 정의 (CD34 + CD13 + CD33-) 연속 완전 한 죄 사 함, 진단에서 B) LAIP 정의에 남아 있던 환자에서 속 행 동안에 LAIP의 손실 (CD117 + CD7 + CD33 +) 및 환자에 속 행 동안 LAIP의 지 속성 들 relapsed. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig7.jpg"> 그림 7 : 줄기 세포 게이팅. A) Gating의 다른 CD34 + / CD38 인구 기반 구슬 (CD38매우 낮은 LSC를 나타내는 진정한 부정적인 세포로 정의 되어 있으며 구슬의 중간 아래 위치 하면서 구슬의 상단 테두리 아래 CD38낮은 이다), B) 2 환자 CD45RAneg 와 CD45RApos 식에 따라 후속에 HSC 및 LSC 사이 구별의 예. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 파일 1. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/Sampling_Form_MRD_1.pdf" target="_blank">여기를 클릭 하십시오 다운로드가이 파일.</a>
보조 파일 2. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/Sampling_Form_MRD_2.pdf" target="_blank">여기를 클릭 하십시오 다운로드가이 파일.</a>
보충 파일 3. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/Supplementary_information_revised_Cloos_et_al_final2018.docx" target="_blank">여기를 클릭 하십시오 다운로드가이 파일.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia at JoVE.c

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

또는 측정 최소 잔여 질병 (MRD)의 위험 평가 정제 하 고 급성 골수성 백혈병 (AML)에서 재발 예측에 대 한 중요 한 예 후 바이오 마커 이다. 이러한 포괄적인 지침과 일관 되 고 정확한 식별 및 MRD의 검출을 위한 모범 사례 권장 사항을 효과적인 AML 치료 결정에 도움이 수 있습니다.

샘플을 측정 하는 측정 가능한 잔여 질환과 급성 골수성 백혈병에 Leukemic 줄기 세포에 대 한 프로세스 골 포괄적인 프로토콜

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

The overall goal of this protocol is to perform an accurate testing of bone marrow samples from acute myeloid leukemia patients for measurable residual disease including the quantification of leukemia stem cells. This method can provide an accurate assessment of measurable residual disease in bone marrow samples of acute myeloid leukemia patients. The main advantage of this approach is that a close following of the protocol yields highly-reproducible, high-quality results.The implications of this technique extends toward clinical decision-making as it can be used as a read-out of patients'response to treatment. Demonstrating the procedures will be Jeroen Janssen, hematologist, Gerrit Sijm, technician of the diagnostic hematology laboratory and Jennifer Scheick and Sander Snel, technicians of the MRD team. With the patient in the lateral decubitus position, mark the superior posterior iliac spine with a pen and disinfect the skin of the intended biopsy area with 0.5 to 1%chlorhexidine in ethanol in an outward circular motion.After administering a local anesthetic, pick up a 15-gauge 2.8-inch needle with the proximal end in the palm and the index finger against the side of the metal shaft of the needle near the tip for control. Using gentle but firm pressure, introduce the needle with a quick alternating pronating supinating movement through the anesthetized skin toward the iliac spine. When the needle comes into contact with the posterior iliac spine, remove the stilette and attach an empty 10-milliliter syringe to the needle.Gently withdraw the plunger to create negative pressure within the syringe until up to 10 milliliters of bone marrow spicules have been harvested. Do not take more than 10 mils of bone marrow per aspirate to avoid hemodilution. Remove the syringe and place the stilette back onto the needle.Then, eject about two milliliters of the marrow into a watch glass and ensure that enough sample is drawn to be injected into a heparin-coated eight-milliliter tube and immediately invert the tube. To prevent clotting, it is important to invest the anticoagulant-containing tube as soon as the bone marrow is added. For optimal morphological assessment, use a plastic spatula to transfer spicules from the aspirate in the watch glass onto a glass slide, and carefully glide another glass slide on top of the marrow.After drying, stain the spicules with May-Grunwald Giemsa for analysis by light microscopy. Place the bone marrow tube in a plastic holder and place the holder into a plastic container with an ambient gel pack and a completed request form. Before analyzing the bone marrow by flow cytometry, start up the flow cytometer and open the flow cytometry analysis software to create a new experiment with a forward scatter versus side scatter dot plot.For assessment of the size and granularity of the cells, load unlabeled lysed peripheral blood cells from a healthy donor and select the Acquire Cells function. Gate the lymphocytes and adjust the forward and side scatter voltages to reach the appropriate mean target values for the gated cell population. Then, acquire data for at least 10, 000 events.To set up the target florescence channel photo multiplier tube voltages, first use eight-peak rainbow bead calibration particles according to the manufacturer's instructions to acquire 10, 000 events at a low flow rate. Gate the singlet beads in the forward versus side scatter dot plot followed by gating the 7th peak in the FITC-PE dot plot. Gate the resulting bead populations for each fluorophore.Continue the acquisition of the eight-peak rainbow bead suspension and adjust and fine-tune PMT voltages in all fluorescence channels to reach target MFI values according to the manufacturer's instructions. Use Record to collect data of about 2, 000 events and check the MFI for the 7th peak beads. Next, add a sufficient volume of each experimental flourochrome conjugated antibody to stain the beads in the corresponding florescence tubes minus one control and vortex the tubes thoroughly.Create a new blank experiment with the same compensation parameters taking care that the forward scatter threshold is set to 5, 000 and the compensation values of all the flourochromes are zero. To create the compensation controls, select the Create Compensation Control function and load the unstained control tube. Adjust the P1 gate around the singlet bead population and confirm that the P1 gate contains only singlet beads.Right-click the P1 gate and select Apply to All Compensation Controls. Then, record data for all of the single labeled florescence tubes confirming that the P2 gate encompasses the positive population on each florescence histogram. To stain the cells for flow cytometric analysis, transport the bone marrow to the laboratory, check the request form to verify patient study number and date of birth and determine what needs to be stained.For MRD, we use a staining panel consisting of four tubes. Here we demonstrate the staining of the LSC panel which consists of one tube. After cell count, transfer the appropriate volume of bone marrow into a new 15-milliliter tube.Add lysis buffer at 10 times the experimental cell volume to lyse the red blood cells. Invert the tube to mix and incubate the cells for 10 minutes at room temperature. At the end of the lysis period, pellet the cells by centrifugation.Resuspend the cells in 15 milliliters of wash buffer at room temperature and harvest the cell pellet again by centrifugation. In the meantime, pipette the appropriate amount of antibody cocktail solution in five-milliliter FACS tubes. Shown here is the panel for the stem cell tube.Resuspend the pellet in wash buffer and add the cell's suspension to the FACS tube containing the monoclonal antibody cocktail solution for a 15-minute incubation in the dark. Then, wash the cells in wash buffer and pellet the cells by centrifugation. After centrifugation, resuspend the pellet in 400 microliters of fresh wash buffer.To analyze the leukemic stem cells, add four microliters of blank beads to the cell suspension that is stained with the stem cell antibody cocktail. Then, read the samples using the previously set parameters acquiring at least four times 10 to the 6th events from the experimental patient samples. To identify the leukemia-associated immunophenotype observed in approximately 90%of acute myeloid leukemia patients, it is crucial that the blast gates are set appropriately as illustrated.Here, examples of data from individual patients harboring different types of aberrancy on the CD34-positive primitive cells are shown. In these graphs, a patient who remains in complete remission and a patient who relapsed after having measurable residual disease positive results after the second cycle of induction therapy can be observed underscoring the need for accurate gate setting prior to sample analysis. The identification and quantification of LSC requires additional analysis of aberrancies specifically on CD34-positive CD38-negative blast cells as shown in these graphs.While performing this protocol, it's very important to have specialized and backup personnel for the bone marrow sampling, the transport, the experimental work and analysis steps of this procedure. This procedure can also be used to perform cytogenetic and molecular analysis to answer additional questions about the correlation between specific cell populations and molecular aberrancies of interest, or to refine the risk group of a patient for predicting clinical outcome. After its development, this technique paved the way for researchers in the field of hematology to explore residual disease in AML patients after treatment.After watching this video, you should have a good understanding how we accurately identify and quantify residual disease by using flow cytometry including the collection and transportation of bone marrow samples of AML patients.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model

쥐 C1498 세포주와 관련 백혈병 마우스 모델을 특성화에 대한 자세한 프로토콜

The intravenous injection of C1498 cells into syngeneic or congenic mice has been performed since 1941. These injections result in the development of ...

연구

암 연구학

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

확산 내장 뇌교 신경 교종의 신속한 사후 세포 배양을위한 프로토콜 (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

원심 Elutriation에 의해 다른 세포 주기 단계에서 기본 급성 림프 구성 백혈병 세포의 준비

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

위쪽으로 이동: 간단 하 고 유연한 생체 외에서 3 차원 침공 분석 실험 프로토콜

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Flow Cytometry 최대 백혈병 줄기 세포 주 급성 골수성 백혈병 및 환자-파생-xenografts, 진단에 따라 추정 하

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

Calvaria 공동 배양 및 조직 학을 사용하여 뼈 리모델링 및 종양 - 뼈 미세 환경 재현

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

뮤린 조혈 줄기 및 선조 세포 및 MLL-AF9 구동 백혈병에서 미토콘드리아 반응성 산소 종의 유동 세포 분석

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone

원발성 뼈 종양 및 뼈에 이식된 고형 종양을 통한 뼈 전이 모델링

Primary bone tumors or bone metastasis from solid tumors result in painful osteolytic, osteoblastic, or mixed osteolytic/osteoblastic lesions. These ...

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

급성 골수성 백혈병의 대량 하위 집단으로부터 줄기 세포를 구별하기 위해 NKG2D 리간드 표면 검출의 두 개의 흐름 세포 측정 접근법

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice

생쥐에서 급성 골수성 백혈병을 발생시키기 위한 복강내 이식

There is an unmet need for novel therapies to treat acute myeloid leukemia (AML) and the associated relapse that involves persistent leukemia stem cells ...