Name: comprehensive protocol to sample and process bone marrow for measuring measurable residual disease and leukemic stem cells in acute myeloid leukemia
Uploaded: 2018-03-05T12:30:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia at JoVE.c

Denne forskningen har blitt støttet av hollandske Kreftforeningen (ALPE 2013-6371) og Egbers grunnlag for VONK. Vi takker nederlandske AML-MRD arbeidsgruppen for samarbeid og fruktbart diskusjoner for kontinuerlig forbedring og standardisering av AML-MRD.

<ol>
	<li>D&#246;hner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+management+of+AML+in+adults:+2017+ELN+recommendations+from+an+international+expert+panel.">Diagnosis and management of AML in adults: 2017 ELN recommendations from an international expert panel.</a> Blood. 129 (4), 424-447 (2017).</li><li>Zwaan, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collaborative+Efforts+Driving+Progress+in+Pediatric+Acute+Myeloid+Leukemia.">Collaborative Efforts Driving Progress in Pediatric Acute Myeloid Leukemia.</a> J Clin Oncol. 33 (27), 2949-2962 (2015).</li><li>Cornelissen, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+European+LeukemiaNet+AML+Working+Party+consensus+statement+on+allogeneic+HSCT+for+patients+with+AML+in+remission:+an+integrated-risk+adapted+approach.">The European LeukemiaNet AML Working Party consensus statement on allogeneic HSCT for patients with AML in remission: an integrated-risk adapted approach.</a> Nat Rev Clin Oncol. 9 (10), 579-590 (2012).</li><li>Grimwade, D., Freeman, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+minimal+residual+disease+in+acute+myeloid+leukemia:+which+platforms+are+ready+for+&amp;#34;prime+time&amp;#34;?.">Defining minimal residual disease in acute myeloid leukemia: which platforms are ready for &amp;#34;prime time&amp;#34;?.</a> Hematology. 2014 (1), 222-233 (2014).</li><li>Kr&#246;nke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+minimal+residual+disease+in+NPM1-mutated+acute+myeloid+leukemia:+a+study+from+the+German-Austrian+acute+myeloid+leukemia+study+group.">Monitoring of minimal residual disease in NPM1-mutated acute myeloid leukemia: a study from the German-Austrian acute myeloid leukemia study group.</a> J Clin Oncol. 29 (19), 2709-2716 (2011).</li><li>Terwijn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+prognostic+impact+of+flow+cytometric+minimal+residual+disease+detection+in+acute+myeloid+leukemia:+data+from+the+HOVON/SAKK+AML+42A+study.">High prognostic impact of flow cytometric minimal residual disease detection in acute myeloid leukemia: data from the HOVON/SAKK AML 42A study.</a> J Clin Oncol. 31 (31), 3889-3897 (2013).</li><li>van der Velden, V. H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+significance+of+flowcytometric+minimal+residual+disease+detection+in+pediatric+acute+myeloid+leukemia+patients+treated+according+to+the+DCOG+ANLL97/MRC+AML12+protocol.">Clinical significance of flowcytometric minimal residual disease detection in pediatric acute myeloid leukemia patients treated according to the DCOG ANLL97/MRC AML12 protocol.</a> Leukemia. 24 (9), 1599-1606 (2010).</li><li>Ossenkoppele, G., Schuurhuis, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRD+in+AML:+time+for+redefinition+of+CR?.">MRD in AML: time for redefinition of CR?.</a> Blood. 121 (12), 2166-2168 (2013).</li><li>Feller, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRD+parameters+using+immunophenotypic+detection+methods+are+highly+reliable+in+predicting+survival+in+acute+myeloid+leukaemia.">MRD parameters using immunophenotypic detection methods are highly reliable in predicting survival in acute myeloid leukaemia.</a> Leukemia. 18 (8), 1380-1390 (2004).</li><li>Terwijn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukemic+stem+cell+frequency:+a+strong+biomarker+for+clinical+outcome+in+acute+myeloid+leukemia.">Leukemic stem cell frequency: a strong biomarker for clinical outcome in acute myeloid leukemia.</a> PLoS One. 9 (9), e107587 (2014).</li><li>Kalina, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EuroFlow+standardization+of+flow+cytometer+instrument+settings+and+immunophenotyping+protocols.">EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols.</a> Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).</li><li>Paietta, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+minimal+residual+disease+(MRD)+in+leukemia:+a+changing+definition+and+concept?.">Assessing minimal residual disease (MRD) in leukemia: a changing definition and concept?.</a> Bone Marrow Transplant. 29 (6), 459-465 (2002).</li><li>Loken, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residual+disease+detected+by+multidimensional+flow+cytometry+signifies+high+relapse+risk+in+patients+with+de+novo+acute+myeloid+leukemia:+a+report+from+Children's+Oncology+Group.">Residual disease detected by multidimensional flow cytometry signifies high relapse risk in patients with de novo acute myeloid leukemia: a report from Children's Oncology Group.</a> Blood. 120 (8), 1581-1588 (2012).</li><li>Zeijlemaker, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+one-tube+assay+for+immunophenotypical+quantification+of+leukemic+stem+cells+in+acute+myeloid+leukemia.">A simple one-tube assay for immunophenotypical quantification of leukemic stem cells in acute myeloid leukemia.</a> Leukemia. 30 (2), 439-446 (2015).</li><li>. Guidance for Collection, Transport and Submission of Specimens for Ebola Virus Testing Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/vhf/ebola/healthcare-us/laboratories/specimens.html">https://www.cdc.gov/vhf/ebola/healthcare-us/laboratories/specimens.html</a> (2017)</li><li>Bachas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+minor+subpopulations+within+the+leukemic+blast+compartment+of+AML+patients+at+initial+diagnosis+in+the+development+of+relapse.">The role of minor subpopulations within the leukemic blast compartment of AML patients at initial diagnosis in the development of relapse.</a> Leukemia. 26 (6), 1313-1320 (2012).</li><li>Ravandi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+minimal+residual+disease+assessed+by+multiparameter+flow+cytometry+is+highly+prognostic+in+younger+patients+with+acute+myeloid+leukemia.">Persistence of minimal residual disease assessed by multiparameter flow cytometry is highly prognostic in younger patients with acute myeloid leukemia.</a> Cancer. 123 (3), 426-435 (2017).</li><li>Hourigan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurable+residual+disease+testing+in+acute+myeloid+leukaemia.">Measurable residual disease testing in acute myeloid leukaemia.</a> Leukemia. 31 (7), 1482-1490 (2017).</li></ol>

Antistoff cocktailer brukes til validering av stilk cellen røret i flere uavhengige institutter fotograferingen av BD. Forfatterne ikke avsløre i forhold til dette manuskriptet.

God data er tilgjengelig som viser bevis for MRD positivitet å være assosiert med dårlig overlevelse, og derfor MRD vurdering kan forbedre pasient utfall av gir deg prognostiske informasjon som klinisk beslutninger kan gjøres. Derfor er en konsekvent og harmoniske metode for immuno-fenotypiske vurdering av MRD viktig til slutt forbedre pasientens terapi. Dette er også viktig når du sammenligner kliniske studier over forskjellige kliniske områder, og kan til slutt hjelp i klinisk beslutningsstøtte gjør og tjene som et surrogat klinisk endepunkt for total overlevelse. Forestillingen om at solid retningslinjer er berettiget for nøyaktig og konsekvent MRD målinger har ført til en felles handling av europeiske leukemi nettverk (ELN) design toppmoderne retningslinjer. Denne omfattende dokument blir publisert sent-2017, og vil være instrumentell for mange kollokvier og laboratorier fremover.
Avgjørende skritt i protokollen
En viktig og ofte oversett del av MRD analyse er effekten av prøven kvalitet på nøyaktig bestemmelse av MRD. Dette er tydeligere når materialet har å bli transportert til andre institutter i globale kliniske forsøk gitt de ekstra driftsmessige hensyn som må tas hensyn til i denne innstillingen. For å redusere risikoen for å blande opp pasienten er informasjon og rettidig levering av prøver tilstrekkelig administrasjonen avgjørende. Igjen, på dette stadiet av transporten den korrekte former og/eller import i elektronisk sykehus systemer med klart tildelinger forespurte analysen er nødvendig. Merke scenen ved behandling av MRD prøvetaking er også avgjørende siden det kan være relevant for klinisk beslutningsstøtte (for eksempel etter andre løpet av terapi) og bør derfor defineres klart. Bruk av uekte data (som for eksempel januar 1 per fødselsår) øker risikoen for å blande opp pasienter eller analyser. Hvis påkrevet ved lov, bør en alternativ anonymisert måte legitimasjon brukes.
Alle prøver for immunophenotyping bør behandles fortrinnsvis innen 24 timer av samlingen. Selv om det ikke anbefales, kan benmargen og eksterne blodprøver fortsatt behandles og analysert når holdt opptil 72 h ved omgivelsestemperatur. I tillegg alle handlings med materialet kan best utføres under sterile forhold, slik at ytterligere kryonisk bevaring av celler i (lokal) biobanker fortsatt relevante: mange kliniske studier har flere analyser til å undersøke nærmere leukemi celler med respekt til molekylær immuno-fenotypiske og funksjonelle funksjoner som skal utføres på et senere tidspunkt. Men detaljene for biobanking er ikke innenfor dette manuskriptet.
Bruke MRD som et diagnostisk verktøy innebærer at det må akkreditert laboratorium, ikke bare for flowcytometri, men også om kvalitetskontroll av MRD vurdering. Dette krever distribusjon prøver å spesifikk referanse laboratorier eller (re) analysere flyt filer med MRD målinger av referanse.
Denne artikkelen beskriver de viktigste handlingene fra benmargen leveringstanken samling til fastsettelse av MRD i klinisk prøver - krever en hele team av eksperter med bestemte oppgaver, ansvar, og hyppige kommunikasjon for effektiv karakterisering og analyse. Siden hver aktivitet er avgjørende for prosedyren, anbefales det å ha lyd logistikk inkludert protokoller ved hvert laboratorium og tilstrekkelig sikkerhetskopi personell som er spesielt opplært på aktiviteten. I tillegg, siden det er noen relativt subjektive trinn delvis av prosedyrer (spesielt LAIP og Lexmarks Løsningssenter avvikende markør identification), er det viktig å ha diskusjoner om resultatet av teamet, og har den endelige rapporten er godkjent av et team av veiledere. Dagens innsats arbeider computer software utvikling som vil bidra til å standardisere (LAIP og Lexmarks Løsningssenter) MRD analysen.
Modifikasjon og feilsøking
Hver lab kan ha sitt eget sett av antistoffer som kan brukes til å definere de forskjellige subpopulasjoner selv om å ha en standardisert ryggrad av markører er avgjørende for sammenlignbare resultater, som beskrevet i ELN toppmoderne retningslinjer for MRD målinger dokument nevnt over. Uansett valgte markører det er noen problemer som kan gjøre analyse av resultatene vanskelig og må tas i betraktning.
Begrensninger av teknikken
Identifikasjon av LAIP og Lexmarks Løsningssenter avvikende markør uttrykk er først vurdert på diagnose og overvåket over tid (under og etter terapi) for nøyaktig karakteristikk av MRD fenotypen. Mens over 95% av pasientene kan evalueres via LAIP eller Lexmarks Løsningssenter (eller begge), fortsatt noen pasienter har ingen definerte LAIPs eller ingen CD34 + CD38-LSCs presentere CD34 negative støt eller har en manglende diagnose prøve. I disse tilfellene, er det fortsatt verdt å prøve å måle MRD med et panel av antistoffer bredt som antall tilgjengelige celler tillater og velg den mest pålitelige (gir sterkeste æren av leukemic celler) LAIP. Vurderer at en andel av pasienter som til slutt tilbakefall ikke helt ligner diagnose immunophenotype, på grunn av heterogenitet AML Disease, måle et bredt panel av antistoffer i MRD anbefales allikevel. Disse immunophenotypic Skift blast celler og LSCs og har vist seg å oppstå under terapi16 og measureable sykdommen kan være basert på disse såkalte kommende populasjoner. Denne gangen men er det ikke fastslått om alle immunophenotypic Sub-populasjoner vil føre til sykdommen tilbakefall, og er derfor ikke vanlig praksis å rapportere MRD skreddersydd-terapi basert på disse cellene i kliniske forsøk. Det er viktig å merke seg at risikoen for manglende Lexmarks Løsningssenter på grunn av befolkningen Skift er redusert av en tube tilnærming som den viktigste aberrancy definere markører er i en flowcytometri (PE) kanal14.
Betydning når det gjelder eksisterende metoder
Metoden beskrevet i denne protokollen er avhengig av definisjonen av en eller flere LAIPs, hvilke celler følges under behandling. En ulempe med denne metoden er at det har nylig vist at LAIP kan endres i løpet av terapi. Denne måten noen kommende populasjoner med forskjellige avvikende indikatorer kan være savnet. For å omgå dette, ville det være best å måle alle avvikende markører i stedet for bare de på diagnose. Dette vil da være lik "annerledes fra vanlig" tilnærmingen som brukes av flere laboratorier17.
Framtidige applikasjoner
MRD har nylig fått ekstra oppmerksomhet for romanen klinisk prøve design. I æra av spesialiserte behandlingstilbud og målrettet medikamentell behandling, bruk av MRD som et resultat tiltaket vil redusere tiden det tar å opprette klinisk effekt av romanen behandlinger, til slutt slik at raskere innføring av haster terapeutiske alternativer i klinikken. Betydningen av aktuelle logistikk og praktisk effektuering av en harmonisert MRD vurdering er avgjørende for fremtidige AML suksess som FDA er for tiden undersøker muligheten for å bruke MRD som et surrogat endepunkt i stedet for total overlevelse måler18.

Akutt myelogen leukemi (AML) er en malignancy av benmargen preget av feil i modning programmet, med unormal spredning og akkumulering av myeloid progenitor celler, hemming av vanlige hematopoiesis, og til slutt benmarg feil . Sykdommen er svært heterogen forhold til morfologi, immunophenotype, cytogenetics, molekylær avvik og genuttrykk signaturer og behandlingsrespons og behandlingen utfallet1,2. Nåværende ledelsen inkluderer induksjon kjemoterapi med sikte på å oppnå komplett forlatelse (CR), etterfulgt av etter remission behandling, i stor grad styrt resultatene av molekylære, cytogenetic og immunophenotypic studier og består av enten flere kurs av flere kjemoterapi eller (autologous eller allogene) stilk cellen transplantasjon3. Til tross for høy remisjon priser etter intensiv kjemoterapi for opptil 90%, 5-års overlevelse hos voksne er bare ca 30% - 40%, hovedsakelig på grunn av utviklingen av tilbakefall som er vanligvis motstandsdyktige mot kjemoterapi og dermed svært vanskelig å behandle. Utfallet i barn er bedre, men omtrent en tredjedel også tilbakefall. Derfor tidlig deteksjon av overhengende tilbakefall fyller et udekket medisinske behov og kan veilede etter remission terapi4.
Gjenværende sykdom etter terapi kan gjenspeile summen av alle diagnose og etter diagnose motstand mekanismer/faktorer; Dermed kan sin måling være prognostiske og instrumentale for guiding behandling. Muligheten for deﬁning gjenværende sykdom (tidligere kalt minimal gjenværende sykdom og nå referert til som målbare gjenværende sykdom eller MRD) langt under morfologiske nødvendighetskriteriet 5% blast celler endrer landskapet av risiko classiﬁcation. For tiden de to metodene hovedsakelig brukes til å oppdage MRD er flyt cytometri- og molekylær-baserte, sistnevnte blir vurdert av revers transkriptase PCR (RT-qPCR)5 eller, men i et tidlig stadium av neste generasjons sekvensering (NGS). Mange studier hos voksne også som barn vist allerede at ulike MRD tilnærminger gir sterk prognostiske informasjon i AML både etter induksjon og konsolidering terapi6,7, og en ny definisjon av sykdom byrde ( overordnet morfologiske CR) fremstår nå8. Dette tyder på at MRD vurdert av flyt og/eller molekylær teknikker bør bli, og faktisk allerede blitt, standard i alle kliniske i AML.
Dette manuskriptet diskuterer detaljerte flyt cytometri prosedyren for å få en nøyaktig og reproduserbar immunophenotypic karakteristikk av MRD i benmargen prøver, inkludert beinmargen prøvetaking og behandling prosedyrer foregående flowcytometri. Tilgjengeligheten av god kvalitet benmarg samples ved diagnostisering og oppfølging er avgjørende for suksessen til denne målingen over kliniske områder og kliniske studier. Faktisk er disse pre analytisk også av avgjørende betydning for molekylær (PCR og NGS) MRD. Immunophenotypic karakteristikk av MRD, er aberrantly uttrykt indikatorer kombinert med normal myelogen og stamfar markører, til å identifisere en leukemi-assosiert immunophenotype (LAIP)9. MRD måler resulterende av mange faktorer som påvirker svar terapi, som innebygd eller ervervet leukemi resistens, pharmacodynamics og kinetics terapi, immun overvåking og etterlevelse. MRD er derfor en veldig sterk etter diagnose prognostiske parameter tilknyttet kliniske utfallet når dichotomized på cut-off nivå bestemmes av mottakeren drift karakteristisk (ROC) analyse. For våre voksen AML kohort av HOVON 42a studere, cut-off settes på 0,1% LAIP positive celler/totalt hvite blodlegemer. Bruker dette kriteriet for å bestemme negative vs positiv MRD status, kan en gruppe pasienter identifiseres som har en betydelig dårligere tilbakefall forekomsten, tilbakefall-fri og total overlevelse6. I tillegg beskriver vi måling av umoden, resistente leukemi celler med stilk cellen-lignende funksjoner (CD34 + CD38-leukemi stamceller eller Lexmarks Løsningssenter), som gir en sterk prediktor for pasient utfall10. Sammen LAIP og Lexmarks Løsningssenter tilnærminger skjemaet flyt cytometric MRD tilnærming. LAIP tilnærmingen passer for omtrent 90% av pasienter, mens Lexmarks Løsningssenter tilnærming kan brukes i ca 80% av pasientene. Sammen over 95% av pasientene kan vurderes for en parameter eller begge.
Til slutt gir denne publikasjonen en detaljert operative beskrivelse for å vurdere MRD av flowcytometri. Dette inkluderer: 1) harmonisering og/eller standardisering av benmarg utvalgstrekking, 2) eksempel transport veiledning 3) detaljert beskrivelse av leukemic celle gjenkjenning med FACS bruker flere antistoff panelene inkludert enkeltcelle tube tilnærminger å karakterisere Lexmarks Løsningssenter, 4) oppsett av FACS maskiner for standardisert målinger, 5) analyseprogrammer for MRD målinger og 6) analyseprogrammer for Lexmarks Løsningssenter gjenkjenning.
Vi tar sikte på å vise alle fasetter av prosedyren inkludert eksempel utarbeidelsen siden som er sjelden diskutert mens det er en viktig sak for kvaliteten på det ultimate resultatet. Benmarg aspirasjon og biopsi er kliniske prosedyrer brukes til å evaluere blodkreft cellene i benmargen. Dette utføres sammen med en full blodstatus (CBC) og blodutstryk. Den optimale metoden for benmarg aspirasjon er avgjørende for nøyaktig diagnose og oppfølging for MRD måling. I tillegg inneholde en vellykket benmarg leveringstanken nok celler for å utføre LAIP og Lexmarks Løsningssenter flyt analyse (minst 10 millioner levedyktig celler). Her beskriver vi metoden for å utføre en benmarg aspirasjon og gi retningslinjer, som skal resultere i tilstrekkelig celle utvalg (og grense potensialet for hemodilution) behov for nøyaktig diagnostikk og ytterligere forskning. Disse pre analytiske vurderinger er også av avgjørende betydning for molekylær (PCR og NGS) MRD tilnærminger. Alle prøver for immunophenotyping bør behandles fortrinnsvis innen 24 timer av samlingen. Selv om det ikke anbefales, kan benmargen og eksterne blodprøver fortsatt behandles og analysert når holdt opptil 72 h ved omgivelsestemperatur. I tillegg bør alle handlings med materialet utføres under sterile forhold, for å aktivere kryonisk bevaring av sterile celler for senere forskning/kvalitetsvurdering osv.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >120995496,060996589 and 013729</td>
			<td >FACS Canto II&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >555360</td>
			<td>CD7 FITC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >DAKO</td>
			<td >F076701</td>
			<td>CD2 FITC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Sanquin</td>
			<td >M1613</td>
			<td>CD36 FITC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >332778</td>
			<td>CD15 FITC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>335039</td>
			<td>CD45RA FITC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >345810</td>
			<td >CD56 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >337899</td>
			<td >CD22 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >345785</td>
			<td >CD14 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Miltenyi Biotec</td>
			<td >130-080-801</td>
			<td >CD133 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562566</td>
			<td>Clec12a PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565568</td>
			<td>Tim-3 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >332774</td>
			<td >CD7 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >333142</td>
			<td >CD11b PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >337899</td>
			<td >CD22 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >345810</td>
			<td >CD56 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >347222</td>
			<td >CD34 PERCP-CY5.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558714</td>
			<td>CD123 PERCP-CY5.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Beckman Coulter</td>
			<td>B49221</td>
			<td >CD117 PE-CY7</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562854</td>
			<td>CD33 BV421</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >345791</td>
			<td >CD19 APC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >333143</td>
			<td >CD11b APC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >345800</td>
			<td >CD33 APC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>345807</td>
			<td>CD38 APC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >641411</td>
			<td >HLA-DR APC-H7</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560532</td>
			<td>CD44 APC-H7</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >562596</td>
			<td >CD13 BV421</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>348811</td>
			<td>CD34 PE-CY7</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Beckman Coulter</td>
			<td>A96416</td>
			<td >CD45 Krome Orange</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>655873</td>
			<td >CD45 HV500c</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >655051</td>
			<td>CST beads&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >555899</td>
			<td>Pharm lysing solution</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >644204</td>
			<td>Multicolor CompBeads</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >655051</td>
			<td>CST beads</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td ></td>
			<td>FACSDiva software</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Cytognos</td>
			<td ></td>
			<td >Infinicyt&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Spherotech</td>
			<td>Euroflow RCP-30-5a</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td ></td>
			<td >Tuerk solution</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Spherotech</td>
			<td>BCP-100-5</td>
			<td>Blank Calibration Particles Beads</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#160;&#160;</td>
			<td >&#160;&#160;</td>
			<td >&#160;&#160;</td>
			<td >HSA</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#160;&#160;</td>
			<td >&#160;&#160;</td>
			<td >&#160;&#160;</td>
			<td >Azide</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#160;&#160;</td>
			<td >&#160;&#160;</td>
			<td >&#160;&#160;</td>
			<td >ddH2O</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comprehensive protocol to sample and process bone marrow for measuring measurable residual disease and leukemic stem cells in acute myeloid leukemia

Svar vilkår i akutt myelogen leukemi (AML) har nylig blitt re-etablert, med morfologiske undersøkelse benyttes for å fastslå om pasienter har oppnådd fullstendig forlatelse (CR). Omtrent vil halvparten av de voksne pasientene som angitt CR tilbakefall innen 12 måneder på grunn av resultatet av gjenværende AML cellene i benmargen. Kvantifisering av disse gjenværende leukemi celler, kalles minimal eller målbare gjenværende sykdom (MRD), kan være en robust biomarkør for prediksjon av disse relapses. Videre har retrospektiv av flere studier vist at tilstedeværelsen av MRD i benmargen av AML pasienter korrelerer med dårlig overlevelse. Ikke bare er leukemic befolkningen, reflektert av cellene skjuler en leukemi forbundet immun-fenotypen (LAIP), tilknyttet kliniske utfallet, men så er de umodne lavfrekvente subpopulasjon av leukemi stamceller (Lexmarks Løsningssenter), begge kan være overvåkes gjennom flowcytometri MRD eller MRD-lignende tilnærminger. Tilgjengeligheten av sensitive analyser at påvisning av gjenværende leukemi (stem) celler på grunnlag av sykdom-spesifikke eller sykdomsassosierte funksjoner (unormal molekylære markører eller avvikende immunophenotypes) har drastisk forbedret MRD vurdering i AML. Men bør gitt den iboende heterogenitet og kompleksiteten i AML som en sykdom, metoder for prøvetaking benmargen og MRD og Lexmarks Løsningssenter analyse være harmoniserte når mulig. I dette manuskriptet beskriver vi en detaljert metodikk for tilstrekkelig benmarg leveringstanken prøvetaking, transport, prøve behandling for optimal multi-farge flyt cytometri vurdering og gating strategier for å vurdere MRD og Lexmarks Løsningssenter for å hjelpe i terapeutisk beslutningsprosesser for AML pasienter.

I 90% av AML pasienter kan minst én LAIP identifiseres. For å generere nøyaktige prosentverdiene LAIP + celler av primitive blast cellene på diagnose, innstillingen av blast gate er avgjørende og trenger bekreftelse som visualisert i Figur 3. Et eksempel på hver pasient skjuler en bestemt type aberrancy på det CD34 + primitive celler er visualisert i figur 5. For måling av MRD på oppfølging, tidligere definerte LAIP + cellene er gated og definert som prosent av LAIP + celler av WBC. Derfor er innstillingen for denne porten avgjørende for riktig MRD resultat. Figur 6 viser en pasient som forblir i fullstendig forlatelse og en pasient som tilbakefall etter å ha MRD positive resultater (≥ 0,1%) etter andre syklus av induksjon terapi.
Gjeldende protokollen er bare egnet til å definere stamceller i CD34 + celler, siden grundig karakteristikk av dette rommet har vist at CD38-befolkningen havner mest potente stilk cellen som brøkdel. For å skille Lexmarks Løsningssenter fra HSC i denne fraksjonen, brukes ekstra markører. Oftest valgte indikatorer for å skille Lexmarks Løsningssenter er CD45RA og combi kanalen skjuler 6 bestemt Lexmarks Løsningssenter markører merket med PE. Basert på ytterligere kliniske evalueringer, en cut-off ≥ 0.004% ble definert som Lexmarks Løsningssenter-positive og ble assosiert med dårligere overlevelse på diagnose mens et cut-off nivå på 0,0001% ble brukt på følge etter etter opp10.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig1.jpg"> Figur 1 : Bein margtransplantasjon smøre. A) frisk donor og B) AML pasient (FAB 5 undertype). Giemsa flekk på 100 x forstørrelse. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig2.jpg"> Figur 2 : Riktig emballasje for biologiske væsker. Mer informasjon om regler og forskrifter for transport biologiske væsker kan finnes på nettsiden15 av Centers for Disease Control og Prevention. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig3.jpg"> Figur 3 : Gating strategi for å definere blast celler. A) Gating CD45dim, B) Gating CD34 + eksplosjonene.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig4.jpg"> Figur 4 : Gating lymfocytter. A) blå celler er WBC vises i FSC/SSC tomten, B) grønne celler er lymfocytter preget av CD45høy/SSClav, C) eksempler av negativitet for CD34, D) negativitet for CD117 og E) negativitet for CD13, F) i ulike celletyper vises i en Oversikt over befolkningen treet. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig5.jpg"> Figur 5 : LAIPs på AML diagnose. A) LAIP basert på tvers av slekten aberrancy (CD7 på CD33 uttrykke celler), B) LAIP basert på asynkron differensiering (CD11b på CD13 uttrykke celler), C) LAIP basert på overuttrykte i forhold til normale celler (CD34svært høy på CD13 uttrykke celler), D). LAIP basert på underexpression i forhold til normale celler (HLA-DRlav CD33 uttrykke celler). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig6.jpg"> Figur 6 : LAIP fulgte i løpet av terapi. A) LAIP definisjon på diagnose (CD34 / CD13 / CD33-) og tap av LAIP under oppfølging i en pasient som forble i kontinuerlig komplett remisjon, B) LAIP definisjon på diagnose (CD117 / CD7 / CD33 +) og utholdenhet av LAIP under oppfølging i en pasient som tilbakefall. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig6large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig7.jpg"> Figur 7 : Stamcelleforskningen gating. A) Gating av de forskjellige CD34 / CD38 bestander basert på perler (CD38lav er under den øvre grensen av perler, mens CD38svært lav er definert som ekte negative cellene representerer Lexmarks Løsningssenter og ligger nedenfor median av perler), B) to Eksempler på pasienter med skille mellom HSC og Lexmarks Løsningssenter på oppfølging basert på CD45RAneg og CD45RApos uttrykk. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig7large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
Ekstra fil 1. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/Sampling_Form_MRD_1.pdf" target="_blank">Vennligst klikk her å downoad filen.</a>
Ekstra filen 2. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/Sampling_Form_MRD_2.pdf" target="_blank">Vennligst klikk her å downoad filen.</a>
Ekstra filen 3. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/Supplementary_information_revised_Cloos_et_al_final2018.docx" target="_blank">Vennligst klikk her å downoad filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia at JoVE.c

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Oppdagelsen av minimal eller målbare gjenværende sykdom (MRD) er en viktig prognostiske biomarkør for raffinering risikovurdering og forutsi tilbakefall i akutt myelogen leukemi (AML). Disse omfattende retningslinjer og anbefalinger med beste praksis for konsekvent og nøyaktig identifikasjon og påvisning av MRD, kan hjelpe i å gjøre effektiv AML behandlingen avgjørelser.

Omfattende protokoll for å prøve og prosessen benmarg for å måle målbare gjenværende sykdom og Leukemic stamceller i akutt myelogen leukemi

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

The overall goal of this protocol is to perform an accurate testing of bone marrow samples from acute myeloid leukemia patients for measurable residual disease including the quantification of leukemia stem cells. This method can provide an accurate assessment of measurable residual disease in bone marrow samples of acute myeloid leukemia patients. The main advantage of this approach is that a close following of the protocol yields highly-reproducible, high-quality results.The implications of this technique extends toward clinical decision-making as it can be used as a read-out of patients'response to treatment. Demonstrating the procedures will be Jeroen Janssen, hematologist, Gerrit Sijm, technician of the diagnostic hematology laboratory and Jennifer Scheick and Sander Snel, technicians of the MRD team. With the patient in the lateral decubitus position, mark the superior posterior iliac spine with a pen and disinfect the skin of the intended biopsy area with 0.5 to 1%chlorhexidine in ethanol in an outward circular motion.After administering a local anesthetic, pick up a 15-gauge 2.8-inch needle with the proximal end in the palm and the index finger against the side of the metal shaft of the needle near the tip for control. Using gentle but firm pressure, introduce the needle with a quick alternating pronating supinating movement through the anesthetized skin toward the iliac spine. When the needle comes into contact with the posterior iliac spine, remove the stilette and attach an empty 10-milliliter syringe to the needle.Gently withdraw the plunger to create negative pressure within the syringe until up to 10 milliliters of bone marrow spicules have been harvested. Do not take more than 10 mils of bone marrow per aspirate to avoid hemodilution. Remove the syringe and place the stilette back onto the needle.Then, eject about two milliliters of the marrow into a watch glass and ensure that enough sample is drawn to be injected into a heparin-coated eight-milliliter tube and immediately invert the tube. To prevent clotting, it is important to invest the anticoagulant-containing tube as soon as the bone marrow is added. For optimal morphological assessment, use a plastic spatula to transfer spicules from the aspirate in the watch glass onto a glass slide, and carefully glide another glass slide on top of the marrow.After drying, stain the spicules with May-Grunwald Giemsa for analysis by light microscopy. Place the bone marrow tube in a plastic holder and place the holder into a plastic container with an ambient gel pack and a completed request form. Before analyzing the bone marrow by flow cytometry, start up the flow cytometer and open the flow cytometry analysis software to create a new experiment with a forward scatter versus side scatter dot plot.For assessment of the size and granularity of the cells, load unlabeled lysed peripheral blood cells from a healthy donor and select the Acquire Cells function. Gate the lymphocytes and adjust the forward and side scatter voltages to reach the appropriate mean target values for the gated cell population. Then, acquire data for at least 10, 000 events.To set up the target florescence channel photo multiplier tube voltages, first use eight-peak rainbow bead calibration particles according to the manufacturer's instructions to acquire 10, 000 events at a low flow rate. Gate the singlet beads in the forward versus side scatter dot plot followed by gating the 7th peak in the FITC-PE dot plot. Gate the resulting bead populations for each fluorophore.Continue the acquisition of the eight-peak rainbow bead suspension and adjust and fine-tune PMT voltages in all fluorescence channels to reach target MFI values according to the manufacturer's instructions. Use Record to collect data of about 2, 000 events and check the MFI for the 7th peak beads. Next, add a sufficient volume of each experimental flourochrome conjugated antibody to stain the beads in the corresponding florescence tubes minus one control and vortex the tubes thoroughly.Create a new blank experiment with the same compensation parameters taking care that the forward scatter threshold is set to 5, 000 and the compensation values of all the flourochromes are zero. To create the compensation controls, select the Create Compensation Control function and load the unstained control tube. Adjust the P1 gate around the singlet bead population and confirm that the P1 gate contains only singlet beads.Right-click the P1 gate and select Apply to All Compensation Controls. Then, record data for all of the single labeled florescence tubes confirming that the P2 gate encompasses the positive population on each florescence histogram. To stain the cells for flow cytometric analysis, transport the bone marrow to the laboratory, check the request form to verify patient study number and date of birth and determine what needs to be stained.For MRD, we use a staining panel consisting of four tubes. Here we demonstrate the staining of the LSC panel which consists of one tube. After cell count, transfer the appropriate volume of bone marrow into a new 15-milliliter tube.Add lysis buffer at 10 times the experimental cell volume to lyse the red blood cells. Invert the tube to mix and incubate the cells for 10 minutes at room temperature. At the end of the lysis period, pellet the cells by centrifugation.Resuspend the cells in 15 milliliters of wash buffer at room temperature and harvest the cell pellet again by centrifugation. In the meantime, pipette the appropriate amount of antibody cocktail solution in five-milliliter FACS tubes. Shown here is the panel for the stem cell tube.Resuspend the pellet in wash buffer and add the cell's suspension to the FACS tube containing the monoclonal antibody cocktail solution for a 15-minute incubation in the dark. Then, wash the cells in wash buffer and pellet the cells by centrifugation. After centrifugation, resuspend the pellet in 400 microliters of fresh wash buffer.To analyze the leukemic stem cells, add four microliters of blank beads to the cell suspension that is stained with the stem cell antibody cocktail. Then, read the samples using the previously set parameters acquiring at least four times 10 to the 6th events from the experimental patient samples. To identify the leukemia-associated immunophenotype observed in approximately 90%of acute myeloid leukemia patients, it is crucial that the blast gates are set appropriately as illustrated.Here, examples of data from individual patients harboring different types of aberrancy on the CD34-positive primitive cells are shown. In these graphs, a patient who remains in complete remission and a patient who relapsed after having measurable residual disease positive results after the second cycle of induction therapy can be observed underscoring the need for accurate gate setting prior to sample analysis. The identification and quantification of LSC requires additional analysis of aberrancies specifically on CD34-positive CD38-negative blast cells as shown in these graphs.While performing this protocol, it's very important to have specialized and backup personnel for the bone marrow sampling, the transport, the experimental work and analysis steps of this procedure. This procedure can also be used to perform cytogenetic and molecular analysis to answer additional questions about the correlation between specific cell populations and molecular aberrancies of interest, or to refine the risk group of a patient for predicting clinical outcome. After its development, this technique paved the way for researchers in the field of hematology to explore residual disease in AML patients after treatment.After watching this video, you should have a good understanding how we accurately identify and quantify residual disease by using flow cytometry including the collection and transportation of bone marrow samples of AML patients.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model

En detaljert protokoll for å karakterisere Murine C1498 Cell Line og dens Associated leukemi Mouse Model

The intravenous injection of C1498 cells into syngeneic or congenic mice has been performed since 1941. These injections result in the development of ...

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

En protokoll for Rapid Post mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

Forberedelse av primære akutt lymfatisk leukemi celler i forskjellige cellen syklus faser av sentrifugal Elutriation

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Flytte oppover: En enkel og fleksibel In Vitro tredimensjonale invasjonen analysen protokoll

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Flow cytometri å anslå leukemi stamceller i primære akutt myelogen leukemi og pasient-avledet-xenografts, diagnose og følge opp

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

Måle beinremodellering og gjenskape tumor-bone mikromiljøet ved hjelp av Calvaria co-kultur og histomorfometry

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Flow analytiske analyse av mitokondrie reaktive oksygen arter i murine blodkreft stem og stamceller og MLL-AF9 drevet leukemi

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone

Modellering av primære beintumorer og benmetastase med implantasjon av solid tumortransplantat i bein

Primary bone tumors or bone metastasis from solid tumors result in painful osteolytic, osteoblastic, or mixed osteolytic/osteoblastic lesions. These ...

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

To flowcytometriske tilnærminger til NKG2D Ligand overflatedeteksjon for å skille stamceller fra bulk subpopulations i akutt myeloid leukemi

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice

Intraperitoneal transplantasjon for generering av akutt myelogen leukemi hos mus

There is an unmet need for novel therapies to treat acute myeloid leukemia (AML) and the associated relapse that involves persistent leukemia stem cells ...