Name: comprehensive protocol to sample and process bone marrow for measuring measurable residual disease and leukemic stem cells in acute myeloid leukemia
Uploaded: 2018-03-05T12:30:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia at JoVE.c

Esta pesquisa foi apoiada pela sociedade holandesa de câncer (ALPE 2013-6371) e Fundação de Egbers por VONK. Agradecemos o grupo de trabalho de LMA-MRD holandês para a colaboração e frutíferos debates para melhoria contínua e padronização de LMA-MRD.

<ol>
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Os cocktails de anticorpo usados para a validação do tubo células-tronco em vários institutos independentes foram gentilmente cedidos pela BD. Os autores não têm nada para divulgar em relação a este manuscrito.

Amplos dados estão disponíveis, que apresentam evidências de positividade MRD, sendo associada com a sobrevivência do pobre, e, portanto, avaliação MRD pode melhorar o resultado do paciente, fornecendo informações adicionais de prognósticos sobre as quais decisões clínicas podem ser feitas. Portanto, um método consistente e harmonizado para avaliação imuno-fenotípica de MRD é essencial para, finalmente, melhorar o tratamento do paciente. Isto também é importante ao comparar estudos clínicos através de centros clínicos diferentes, e pode, finalmente, ajuda na clínica a decisão fazendo e servindo como um ponto de extremidade clínico substituto para sobrevivência global. A noção de que orientações sólidas são garantidas para medições de MRD precisas e consistentes tem levado a uma acção concertada de rede europeia de leucemia (ELN), de diretrizes de design do estado da arte. Este documento abrangente será publicado atrasado-2017 e será fundamental para muitos grupos de estudo e laboratórios a avançar.
Passos críticos dentro do protocolo
Um aspecto importante e muitas vezes esquecido da análise MRD é o impacto da qualidade da amostra na determinação precisa da MRD. Isto é mais evidente quando o material tem que ser transportado para outros institutos em testes clínicos globais, tendo em conta as considerações operacionais adicionais que precisam ser tomadas em consideração neste cenário. Para reduzir o risco de mistura-se paciente informações e entrega oportuna da administração adequada de amostras é crucial. Novamente, nesta fase do transporte as formas corretas e/ou importação em sistemas eletrônicos de hospital com atribuições claras das análises solicitadas é necessária. Observar o estágio em terapia da amostragem MRD é também crucial, uma vez que pode ser relevante para a decisão clínica (por exemplo após o segundo curso de terapia) e, portanto, deve ser definido claramente. O uso de dados fictícios (como por exemplo 1 de janeiro por ano de nascimento) aumenta o risco de mistura-se análises ou pacientes. Se exigido por lei, uma forma alternativa de anónimos de identificação deve ser usada.
Todos os espécimes para immunophenotyping devem ser processados, preferencialmente dentro de 24 h de coleção. Embora não recomendável, amostras de sangue periférico e medula óssea ainda podem ser processadas e analisadas quando mantidos até 72 h à temperatura ambiente. Além disso, a todos os manejos com o material melhor podem ser realizados em condições estéreis, portanto mais criopreservação de células em biobancos (locais) continua a ser relevante: muitos estudos clínicos têm análises adicionais para investigar mais células de leucemia com respeito às características moleculares, imuno-fenotípica e funcionais para ser executada em um estágio posterior. No entanto, detalhes de biobanking não são no âmbito deste manuscrito.
Usando MRD como uma ferramenta de diagnóstico implica que ele precisa de um laboratório acreditado, não só por citometria de fluxo, mas também em matéria de controlo de qualidade da avaliação de MRD. Isso pode exigir a distribuição de amostras aos laboratórios de referência específica ou (re) analisando arquivos de fluxo com as medições de MRD por equipes de referência.
Este artigo descreve as ações mais importantes da coleção de aspirado de medula óssea para determinação de MRD em amostras clínicas - exigindo uma equipe inteira de especialistas com tarefas específicas, responsabilidades e com a comunicação frequente para efetiva caracterização e análise. Uma vez que cada tarefa é crucial para o procedimento, é recomendável ter som logística incluindo protocolos em cada laboratório e pessoal suficiente de backup que foram treinado especificamente para a tarefa. Além disso, uma vez que existem algumas etapas relativamente subjetivas em parte dos procedimentos (especialmente LAIP e LSC identificação de marcador aberrante), é essencial ter discussões sobre o resultado final pela equipe, e ter o relatório final autorizado por uma equipe de supervisores. Os esforços atuais buscam o desenvolvimento de software de computador que vai ajudar a uniformizar a análise MRD (LAIP e LSC).
Modificação e resolução de problemas
Cada laboratório pode ter seu próprio conjunto de anticorpos que podem ser usados para definir as diferentes subpopulações, apesar de ter uma espinha dorsal padronizada dos marcadores é essencial para resultados comparáveis, conforme descrito nas diretrizes de estado da arte da ELN para documento de medições de MRD acima referido. Independentemente dos marcadores de escolhido, há algumas questões que podem dificultar a análise dos resultados e precisa ser levado em consideração.
Limitações da técnica
A identificação da expressão de marcador aberrante LAIP e LSC primeiro é avaliada no momento do diagnóstico e monitorizada ao longo do tempo (durante e após a terapia) para a caracterização exata do fenótipo MRD. Enquanto mais 95% dos pacientes podem ser avaliadas através de LAIP LSC (ou ambos), ainda alguns pacientes tem não LAIPs definidos ou nenhum CD34 + CD38-LSCs apresentam com explosões de CD34 negativos ou tem uma amostra de diagnóstico a falta. Nesses casos, é ainda vale a pena tentar e medir MRD com um painel de anticorpos tão amplas como o número de células disponíveis permite e, em seguida, selecione o mais confiável (dando a mais forte distinção das células leucêmicas) LAIP. Considerando que uma proporção de pacientes que, finalmente, ter uma recaída não completamente se assemelham o imunofenótipo de diagnóstico, devido à heterogeneidade da doença AML, medir um amplo painel de anticorpos no MRD recomenda-se de qualquer maneira. Estes turnos imunofenotípica incluem blastos e LSCs e foram mostrados para ocorrer durante a terapia16 e a doença mensurável pode basear-se nestas populações próximas so-called. Neste momento, no entanto, não foi determinado se todos imunofenotípica sub-populações conduzirá a recaída da doença, e, portanto, prática não comum para relatar MRD adaptados-terapia baseia-se nessas células em ensaios clínicos. É importante observar que o risco de perder a LSC devido a deslocamentos de população é reduzido com a aproximação de um tubo em que os marcadores mais importantes de definição aberrancy estão em um fluxo cytometry (PE) canal14.
Importância no que diz respeito a métodos existentes
O método descrito neste protocolo baseia-se na definição de um ou mais LAIPs, que as células são seguidas durante a terapia. Uma desvantagem deste método é que recentemente mostrou que Roberto pode mudar durante a terapia. Desta forma, que algumas populações próximas com diferentes marcadores aberrantes podem ser perdidas. Para contornar isso, seria melhor medir todos os marcadores aberrantes em vez de apenas aquelas encontradas no momento do diagnóstico. Isto então seria semelhante à abordagem "diferente do normal" é usado por vários laboratórios17.
Aplicações futuras
Recentemente, MRD tem recebido atenção extra para projeto novo de julgamento clínico. Na era das opções de tratamento especializado e terapia com drogas específicas, o uso de MRD como uma medida de resultado irá reduzir o tempo necessário para estabelecer a eficácia clínica de novos tratamentos, em última análise, permitindo a introdução mais rápida de urgentemente necessária terapêutica opções para a clínica. O significado de logística adequada e execução prática de uma avaliação de MRD harmonizada são cruciais para o sucesso futuro do tratamento LMA como o FDA está atualmente investigando a viabilidade do uso de MRD como um ponto de extremidade do substituto em vez de sobrevivência global mede18.

Leucemia mieloide aguda (LMA) é que um tumor maligno da medula óssea caracterizadas por defeitos no programa de maturação, com proliferação anormal e acúmulo de células progenitoras mieloides, inibição da hematopoiese normal e, finalmente, falha da medula óssea . A doença é altamente heterogênea no que diz respeito a morfologia, imunofenótipo, citogenética, moleculares aberrações e assinaturas de expressão do gene, bem como a resposta do tratamento e tratamento resultado1,2. Gestão atual inclui quimioterapia de indução com o objectivo de atingir a remissão completa (CR), seguida por pós-remissão tratamento, que é guiado em grande parte pelos resultados de molecular, citogenética e imunofenotípica estudos e consiste tanto vários cursos de quimioterapia adicional ou transplante de células-tronco (autólogo ou alogênico)3. Apesar das taxas de remissão alta após quimioterapia intensiva de até 90%, sobrevida de 5 anos em adultos é somente aproximadamente 30% a 40%, principalmente devido ao desenvolvimento de recaídas que são geralmente resistente à quimioterapia e, assim, muito difícil de tratar. Resultado nas crianças é melhor, embora aproximadamente um terço também uma recaída. Portanto, a deteção adiantada de recaída iminente irá preencher uma necessidade médica não atendida e guie remissão após terapia4.
Doença residual após terapia pode refletir a soma de todos os diagnóstico e fatores/mecanismos de resistência pós-diagnóstico; Portanto, sua medição pode ser instrumental para orientar o tratamento e prognóstico. A possibilidade de deﬁning doença residual (anteriormente chamada de doença residual mínima e agora referida como mensurável de doença residual ou MRD) muito abaixo do critério morfológico de 5% de blastos está mudando a paisagem de risco classiﬁcation. Atualmente, os dois métodos utilizados principalmente para detectar MRD estão fluxo cytometry-molecular baseada e, este último sendo avaliada pela transcriptase reversa PCR (RT-qPCR)5 ou, embora numa fase prematura, pela próxima geração (NGS) de sequenciamento. Muitos estudos em adultos, bem como em crianças já demonstraram que várias abordagens MRD fornecem informação prognóstica forte na LMA, tanto após a indução e consolidação terapia6,7e uma nova definição de doença fardo ( superior ao CR morfológica) está a emergir8. Isto sugere que MRD avaliados pelo fluxo e/ou técnicas moleculares devem tornar-se e na verdade são já se tornando, padrão em cada ensaio clínico na LMA.
Este manuscrito descreve o procedimento de citometria de fluxo detalhado para obter uma caracterização imunofenotípica precisos e reprodutíveis de MRD em amostras de medula óssea, incluindo a recolha de amostras de medula óssea e procedimentos anteriores de citometria de fluxo de processamento. A disponibilidade das amostras de medula óssea de boa qualidade no diagnóstico e acompanhamento é crucial para o sucesso desta medida em locais clínicos e ensaios clínicos. Na verdade, estas considerações pré-analíticas são também de abordagens MRD de vital importância para molecular (PCR e NGS). Para caracterização imunofenotípica de MRD, aberrantly expressas marcadores são combinados com normal mieloide e marcadores do progenitor, para identificar um imunofenótipo associada a leucemia (LAIP)9. MRD mede a resultante de muitos fatores que influenciam a resposta à terapia, tais como resistência a drogas leucemia intrínseca ou adquirida, farmacodinâmica e cinética da terapia, vigilância imunológica e conformidade. Portanto, MRD é um parâmetro prognóstico muito forte de pós-diagnóstico associado com resultados clínicos quando dicotomizado em um nível de limite determinado pela análise característica operacional receptor (ROC). Para nosso adulto coorte de LMA da 42a HOVON estudo, o nível de limiar é fixado em 0,1% de LAIP células positivas/total de leucócitos. Usando este critério para determinar o status de MRD positivos vs negativos, um grupo de pacientes pode ser identificado que têm uma incidência de recaída significativamente pior, sobrevivência livre de recaída e total6. Além disso, descrevemos a medição das células de leucemia imaturos, resistentes aos medicamentos com características de células estaminais (células-tronco CD34 + CD38-leucemia, ou LSC), que oferece um forte preditor de resultado paciente10. Juntos LAIP e LSC aproxima-se forma a abordagem MRD fluxo cytometric. A abordagem LAIP é apropriada para cerca de 90% dos pacientes, enquanto que a abordagem do LSC pode ser aplicada em cerca de 80% dos pacientes. Junto sobre 95% dos pacientes podem ser avaliados para um parâmetro, ou ambos.
Por último, esta publicação fornece uma descrição detalhada e operacional para avaliar MRD por citometria de fluxo. Isto inclui: 1) harmonização e/ou padronização de procedimentos de recolha de amostras de medula óssea, orientação de transporte 2) amostra 3) descrição detalhada da detecção de células leucêmicas com FACS usando vários painéis de anticorpos, incluindo abordagens de tubo de célula única para caracterizar a LSC, 4) set-up dos FACS máquinas para medições padronizadas, 5) programas analíticos para medições de MRD e 6) programas analíticos para a deteção da LSC.
Nosso objetivo é mostrar todas as facetas do processo, incluindo a preparação da amostra, uma vez que raramente é discutido enquanto é uma questão importante para a qualidade do resultado final. Biópsia e aspiração de medula óssea são procedimentos clínicos usados para avaliar as células hematopoiéticas dentro da medula óssea. Estas são realizadas em conjunto com um hemograma completo (CBC) e o esfregaço de sangue. O método ideal para aspiração de medula óssea é crucial para o diagnóstico preciso e o acompanhamento para medição de MRD. Além disso, um aspirado de medula de óssea bem sucedida deve conter células suficientes para executar a análise de fluxo LAIP e LSC (pelo menos 10 milhões células viáveis). Aqui, descrevemos o método para a realização de uma aspiração de medula óssea e fornecer orientações, que devem resultar em adequado célula amostragem (e limite o potencial de hemodiluição) necessários para diagnósticos precisos e pesquisa adicional. Estas considerações pré-analíticas são também de abordagens MRD de vital importância para molecular (PCR e NGS). Todos os espécimes para immunophenotyping devem ser processados, preferencialmente dentro de 24 h de coleção. Embora não recomendável, amostras de sangue periférico e medula óssea ainda podem ser processadas e analisadas quando mantidos até 72 h à temperatura ambiente. Além disso, todos os manejos com o material devem ser realizados sob condições estéreis, a fim de permitir a criopreservação de células estéreis para posterior avaliação de pesquisa/qualidade etc.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >120995496,060996589 and 013729</td>
			<td >FACS Canto II&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >555360</td>
			<td>CD7 FITC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >DAKO</td>
			<td >F076701</td>
			<td>CD2 FITC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Sanquin</td>
			<td >M1613</td>
			<td>CD36 FITC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >332778</td>
			<td>CD15 FITC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>335039</td>
			<td>CD45RA FITC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >345810</td>
			<td >CD56 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >337899</td>
			<td >CD22 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >345785</td>
			<td >CD14 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Miltenyi Biotec</td>
			<td >130-080-801</td>
			<td >CD133 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562566</td>
			<td>Clec12a PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565568</td>
			<td>Tim-3 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >332774</td>
			<td >CD7 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >333142</td>
			<td >CD11b PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >337899</td>
			<td >CD22 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >345810</td>
			<td >CD56 PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >347222</td>
			<td >CD34 PERCP-CY5.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558714</td>
			<td>CD123 PERCP-CY5.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Beckman Coulter</td>
			<td>B49221</td>
			<td >CD117 PE-CY7</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562854</td>
			<td>CD33 BV421</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >345791</td>
			<td >CD19 APC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >333143</td>
			<td >CD11b APC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >345800</td>
			<td >CD33 APC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>345807</td>
			<td>CD38 APC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >641411</td>
			<td >HLA-DR APC-H7</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560532</td>
			<td>CD44 APC-H7</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td >562596</td>
			<td >CD13 BV421</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>348811</td>
			<td>CD34 PE-CY7</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Beckman Coulter</td>
			<td>A96416</td>
			<td >CD45 Krome Orange</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>655873</td>
			<td >CD45 HV500c</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >655051</td>
			<td>CST beads&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >555899</td>
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		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >644204</td>
			<td>Multicolor CompBeads</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >655051</td>
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		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td ></td>
			<td>FACSDiva software</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Cytognos</td>
			<td ></td>
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		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Spherotech</td>
			<td>Euroflow RCP-30-5a</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td ></td>
			<td >Tuerk solution</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Spherotech</td>
			<td>BCP-100-5</td>
			<td>Blank Calibration Particles Beads</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#160;&#160;</td>
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comprehensive protocol to sample and process bone marrow for measuring measurable residual disease and leukemic stem cells in acute myeloid leukemia

Critérios de resposta na leucemia mieloide aguda (LMA) foi recentemente re-estabelecido, com exame morfológico utilizado para determinar se os pacientes atingiram remissão completa (CR). Aproximadamente metade dos pacientes adultos que entraram CR será uma recaída dentro de 12 meses devido a consequência de células residuais de LMA na medula óssea. A quantificação destes restantes células de leucemia, conhecidas como doença residual mínima ou mensurável (MRD), pode ser um biomarcador robusto para a previsão dessas recaídas. Além disso, uma análise retrospectiva de vários estudos demonstrou que a presença de MRD na medula óssea de pacientes LMA correlaciona-se com a sobrevivência do pobre. Não só é o total da população leucêmicas, refletida pelas células abrigar uma leucemia associada imune-fenótipo (LAIP), associado com resultados clínicos, mas assim é a subpopulação de imaturos de baixa frequência de leucemia células-tronco (LSC), ambos dos quais podem ser monitorado através de citometria de fluxo MRD ou MRD-como abordagens. A disponibilidade dos ensaios sensíveis que permitem a detecção de células de leucemia residual (haste) com base nas características de doenças específicas ou doença associada (marcadores moleculares anormais ou aberrante immunophenotypes) tem avaliação de MRD drasticamente melhorada na LMA. No entanto, dada a heterogeneidade inerente e a complexidade da LMA como uma doença, métodos para a recolha de medula óssea e realizando análise MRD e LSC devem harmonizar quando possível. Neste manuscrito, descrevemos uma metodologia detalhada de aspirado de medula de óssea adequada amostragem, transporte, processamento para avaliação de citometria de fluxo de multi cor ideal e retenção de estratégias para avaliar MRD e LSC para auxiliar na tomada de decisão terapêutica da amostra para pacientes com LMA.

Em 90% dos pacientes LMA LAIP pelo menos um pode ser identificado. A fim de gerar as percentagens precisas de células LAIP + das células primitivas explosão no momento do diagnóstico, a configuração apropriada do portão de explosão é crucial e precisa de verificação como visualizado na Figura 3. Um exemplo de cada paciente, abrigando um tipo específico de aberrancy sobre as células CD34 + primitivas é visualizado na Figura 5. Para medição de MRD no follow-up, as anteriormente definido LAIP + células são bloqueadas e definidas como a percentagem de células LAIP + do WBC. Portanto, a configuração deste portão é crucial para alcançar os resultados MRD a razão. A Figura 6 mostra um paciente que recaídas depois de ter resultados positivos MRD (≥ 0,1%) e um paciente que permanece em remissão completa após o segundo ciclo da terapia de indução.
O protocolo atual só é adequado para definir as células-tronco em células CD34 +, desde a caracterização completa deste compartimento tem mostrado que o CD38-população abriga as células-tronco mais potentes como fração. A fim de separar o CSS dentro dessa fração da LSC, marcadores adicionais são usados. Marcadores mais frequentemente selecionadas para distinguir LSC são CD45RA e o canal de combi abrigando 6 marcadores específicos do LSC rotulados com PE. Com base em novas avaliações clínicas, um nível de corte de ≥ 0,004% foi definido como LSC-positivo e foi associado com pior sobrevivência no momento do diagnóstico, enquanto um nível de corte de 0,0001% foi usado no seguindo-acima de10.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig1.jpg"> Figura 1 : Esfregaço de medula óssea. A) saudável doador e paciente B) AML (subtipo FAB 5). Mancha de Giemsa mostrada na ampliação de 100x. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig2.jpg"> Figura 2 : Corrigir o material de embalagem de fluidos biológicos. Mais detalhes sobre as regras e regulamentos do transporte de fluidos biológicos podem ser encontradas no site15 de centros de controle e prevenção de doenças. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig3.jpg"> Figura 3 : Estratégia para a definição de blastos de gating. A) Gating CD45dim, B) Gating CD34 + explosões.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig4.jpg"> Figura 4 : Gating linfócitos. A) células azul WBC mostrado na trama do FSC/SSC, células B) verde são linfócitos caracterizados por CD45alta/SSCbaixa, C) são exemplos de negatividade para CD34, D) negatividade para CD117 e negatividade E) para CD13, F) os diferentes tipos de células são mostrados em uma árvore de população de visão geral. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig5.jpg"> Figura 5 : LAIPs no momento do diagnóstico da LMA. A) LAIP baseado em cruz linhagem aberrancy (CD7 expressando células CD33), B) LAIP baseado na diferenciação assíncrona (CD11b na células expressando CD13), C) LAIP baseado em superexpressão em comparação com células normais (CD34muito alta na CD13 expressando células), D). LAIP baseado no underexpression em comparação com células normais (HLA-DRbaixa CD33 expressando células). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig6.jpg"> Figura 6 : LAIP seguido durante a terapia. Definição de LAIP A) no momento do diagnóstico (CD34 + / CD13 + / CD33-) e perda de LAIP durante o seguimento em um paciente que permaneceram em remissão completa contínua, definição de LAIP B) no momento do diagnóstico (CD117 + / CD7 + / CD33 +) e persistência de LAIP durante o seguimento em um paciente que teve uma recaída. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig7.jpg"> Figura 7 : Retenção de células-tronco. Um) Gating das diferentes CD34 + CD38 populações com base em grânulos (CD38baixa está abaixo da margem superior dos grânulos, enquanto CD38muito baixo são definidos como as verdadeiras células negativas representando a LSC e situam-se abaixo da mediana dos grânulos), B) dois exemplos de pacientes com distinção entre HSC e LSC no acompanhamento baseada CD45RAneg e CD45RApos expressão. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig7large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Arquivo suplementar 1. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/Sampling_Form_MRD_1.pdf" target="_blank">Clique aqui para downoad este arquivo.</a>
Arquivo suplementar 2. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/Sampling_Form_MRD_2.pdf" target="_blank">Clique aqui para downoad este arquivo.</a>
Arquivo suplementar 3. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/Supplementary_information_revised_Cloos_et_al_final2018.docx" target="_blank">Clique aqui para downoad este arquivo.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia at JoVE.c

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Detecção de doença residual mínima ou mensurável (MRD) é um biomarcador prognóstico importante para avaliação do risco de refinação e predizer a recaída em leucemia mieloide aguda (LMA). Estas orientações abrangentes e recomendações com as melhores práticas para consistente e exata identificação e detecção de MRD, pode ajudar na tomada de decisões de tratamento eficazes AML.

Protocolo abrangente de amostra e da medula óssea do processo de medição de doença Residual mensurável e células leucêmicas em leucemia mieloide aguda

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

The overall goal of this protocol is to perform an accurate testing of bone marrow samples from acute myeloid leukemia patients for measurable residual disease including the quantification of leukemia stem cells. This method can provide an accurate assessment of measurable residual disease in bone marrow samples of acute myeloid leukemia patients. The main advantage of this approach is that a close following of the protocol yields highly-reproducible, high-quality results.The implications of this technique extends toward clinical decision-making as it can be used as a read-out of patients'response to treatment. Demonstrating the procedures will be Jeroen Janssen, hematologist, Gerrit Sijm, technician of the diagnostic hematology laboratory and Jennifer Scheick and Sander Snel, technicians of the MRD team. With the patient in the lateral decubitus position, mark the superior posterior iliac spine with a pen and disinfect the skin of the intended biopsy area with 0.5 to 1%chlorhexidine in ethanol in an outward circular motion.After administering a local anesthetic, pick up a 15-gauge 2.8-inch needle with the proximal end in the palm and the index finger against the side of the metal shaft of the needle near the tip for control. Using gentle but firm pressure, introduce the needle with a quick alternating pronating supinating movement through the anesthetized skin toward the iliac spine. When the needle comes into contact with the posterior iliac spine, remove the stilette and attach an empty 10-milliliter syringe to the needle.Gently withdraw the plunger to create negative pressure within the syringe until up to 10 milliliters of bone marrow spicules have been harvested. Do not take more than 10 mils of bone marrow per aspirate to avoid hemodilution. Remove the syringe and place the stilette back onto the needle.Then, eject about two milliliters of the marrow into a watch glass and ensure that enough sample is drawn to be injected into a heparin-coated eight-milliliter tube and immediately invert the tube. To prevent clotting, it is important to invest the anticoagulant-containing tube as soon as the bone marrow is added. For optimal morphological assessment, use a plastic spatula to transfer spicules from the aspirate in the watch glass onto a glass slide, and carefully glide another glass slide on top of the marrow.After drying, stain the spicules with May-Grunwald Giemsa for analysis by light microscopy. Place the bone marrow tube in a plastic holder and place the holder into a plastic container with an ambient gel pack and a completed request form. Before analyzing the bone marrow by flow cytometry, start up the flow cytometer and open the flow cytometry analysis software to create a new experiment with a forward scatter versus side scatter dot plot.For assessment of the size and granularity of the cells, load unlabeled lysed peripheral blood cells from a healthy donor and select the Acquire Cells function. Gate the lymphocytes and adjust the forward and side scatter voltages to reach the appropriate mean target values for the gated cell population. Then, acquire data for at least 10, 000 events.To set up the target florescence channel photo multiplier tube voltages, first use eight-peak rainbow bead calibration particles according to the manufacturer's instructions to acquire 10, 000 events at a low flow rate. Gate the singlet beads in the forward versus side scatter dot plot followed by gating the 7th peak in the FITC-PE dot plot. Gate the resulting bead populations for each fluorophore.Continue the acquisition of the eight-peak rainbow bead suspension and adjust and fine-tune PMT voltages in all fluorescence channels to reach target MFI values according to the manufacturer's instructions. Use Record to collect data of about 2, 000 events and check the MFI for the 7th peak beads. Next, add a sufficient volume of each experimental flourochrome conjugated antibody to stain the beads in the corresponding florescence tubes minus one control and vortex the tubes thoroughly.Create a new blank experiment with the same compensation parameters taking care that the forward scatter threshold is set to 5, 000 and the compensation values of all the flourochromes are zero. To create the compensation controls, select the Create Compensation Control function and load the unstained control tube. Adjust the P1 gate around the singlet bead population and confirm that the P1 gate contains only singlet beads.Right-click the P1 gate and select Apply to All Compensation Controls. Then, record data for all of the single labeled florescence tubes confirming that the P2 gate encompasses the positive population on each florescence histogram. To stain the cells for flow cytometric analysis, transport the bone marrow to the laboratory, check the request form to verify patient study number and date of birth and determine what needs to be stained.For MRD, we use a staining panel consisting of four tubes. Here we demonstrate the staining of the LSC panel which consists of one tube. After cell count, transfer the appropriate volume of bone marrow into a new 15-milliliter tube.Add lysis buffer at 10 times the experimental cell volume to lyse the red blood cells. Invert the tube to mix and incubate the cells for 10 minutes at room temperature. At the end of the lysis period, pellet the cells by centrifugation.Resuspend the cells in 15 milliliters of wash buffer at room temperature and harvest the cell pellet again by centrifugation. In the meantime, pipette the appropriate amount of antibody cocktail solution in five-milliliter FACS tubes. Shown here is the panel for the stem cell tube.Resuspend the pellet in wash buffer and add the cell's suspension to the FACS tube containing the monoclonal antibody cocktail solution for a 15-minute incubation in the dark. Then, wash the cells in wash buffer and pellet the cells by centrifugation. After centrifugation, resuspend the pellet in 400 microliters of fresh wash buffer.To analyze the leukemic stem cells, add four microliters of blank beads to the cell suspension that is stained with the stem cell antibody cocktail. Then, read the samples using the previously set parameters acquiring at least four times 10 to the 6th events from the experimental patient samples. To identify the leukemia-associated immunophenotype observed in approximately 90%of acute myeloid leukemia patients, it is crucial that the blast gates are set appropriately as illustrated.Here, examples of data from individual patients harboring different types of aberrancy on the CD34-positive primitive cells are shown. In these graphs, a patient who remains in complete remission and a patient who relapsed after having measurable residual disease positive results after the second cycle of induction therapy can be observed underscoring the need for accurate gate setting prior to sample analysis. The identification and quantification of LSC requires additional analysis of aberrancies specifically on CD34-positive CD38-negative blast cells as shown in these graphs.While performing this protocol, it's very important to have specialized and backup personnel for the bone marrow sampling, the transport, the experimental work and analysis steps of this procedure. This procedure can also be used to perform cytogenetic and molecular analysis to answer additional questions about the correlation between specific cell populations and molecular aberrancies of interest, or to refine the risk group of a patient for predicting clinical outcome. After its development, this technique paved the way for researchers in the field of hematology to explore residual disease in AML patients after treatment.After watching this video, you should have a good understanding how we accurately identify and quantify residual disease by using flow cytometry including the collection and transportation of bone marrow samples of AML patients.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model

Um protocolo detalhado para caracterizar a linhagem celular murina C1498 e seu Modelo Associated leucemia mouse

The intravenous injection of C1498 cells into syngeneic or congenic mice has been performed since 1941. These injections result in the development of ...

Pesquisa do câncer

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Um protocolo para a Cultura rápidos post-mortem celular de Difuso Intrínseca Pontine glioma (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

Preparação de células de leucemia linfoblástica aguda primária em fases diferentes de ciclo celular por Elutriation centrífuga

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Se movendo para cima: Um simples e flexível em Vitro invasão tridimensional protocolo do ensaio

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Fluxo Cytometry para estimar leucemia células-tronco na leucemia mieloide aguda primária e no paciente-derivada-xenografts, diagnóstico e segue até

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

Medição da remodelagem óssea e recriação do microambiente tumor-osso usando a cocultura da Calvaria e a histomormormetria

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Análise Citométrica de fluxo de espécies reativas de oxigênio mitocondrial em células tronco e progenitoras hematopoiéticas Murinas e leucemia acionada por MLL-AF9

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone

Modelagem de Tumores Ósseos Primários e Metástases Ósseas com Implante de Enxerto Sólido de Tumor em Osso

Primary bone tumors or bone metastasis from solid tumors result in painful osteolytic, osteoblastic, or mixed osteolytic/osteoblastic lesions. These ...

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

Duas abordagens citométricas de fluxo de detecção de superfície de ligante NKG2D para distinguir células-tronco de subpopulações a granel em leucemia mielóide aguda

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice

Transplante Intra-Peritoneal na Geração de Leucemia Mielóide Aguda em Camundongos

There is an unmet need for novel therapies to treat acute myeloid leukemia (AML) and the associated relapse that involves persistent leukemia stem cells ...